EDS1-interacting J Protein 1 je základním negativním regulátorem přirozené imunity rostlin u Arabidopsis

Abstraktní

Rostliny si vyvinuly přesné mechanismy pro optimalizaci imunitních reakcí proti patogenům. ZVÝŠENÁ CITLIVOST K ONEMOCNĚNÍM 1 (EDS1) hraje zásadní roli ve vrozené imunitě rostlin tím, že reguluje bazální rezistenci a efektorem spouštěnou imunitu. Nukleocytoplazmatický transport EDS1 je nutný pro posílení rezistence, ale molekulární mechanismus zůstává nepolapitelný. Zde ukazujeme, že EDS1-INTERACTING J PROTEIN1 (EIJ1), který působí jako chaperon podobný proteinu DnaJ v reakci na infekci patogenem, funguje jako nezbytný negativní regulátor imunity rostlin prostřednictvím interakce s EDS1. Ztráta funkce mutace EIJ1 neovlivnila růst rostlin, ale významně zvýšila odolnost vůči patogenům. Po infekci patogenem se EIJ1 relokalizoval z chloroplastu do cytoplazmy, kde interagoval s EDS1, čímž se omezil patogenem spouštěný přenos EDS1 do jádra a ohrozila odolnost v raném stádiu infekce. Během vývoje onemocnění byl EIJ1 postupně degradován, což umožnilo jadernou akumulaci EDS1 pro posílení transkripční rezistence. Avirulentní kmen Pst DC3000 (AvrRps4) zrušil represivní působení EIJ1 rychlou indukcí jeho degradace v efektorem spouštěné imunitní odpovědi. Naše zjištění tedy ukazují, že EIJ1 je zásadním negativním regulátorem přirozené rostlinné imunity závislým na EDS{23}} a poskytuje mechanické pochopení toho, jak je regulována jaderná versus cytoplazmatická distribuce EDS1 během imunitní odpovědi.

cistanche výhody-posilují imunitní systém

Úvod

Rostliny si vyvinuly komplikovanou síť, aby modulovaly své imunitní reakce. K obraně proti patogenům rostliny používají dvě hlavní regulační strategie: imunitu spouštěnou vzorem (PTI) a imunitu spouštěnou efektorem (ETI). PTI je řízena receptory pro rozpoznávání vzorů (PRR), které rozpoznávají molekulární vzory asociované s patogeny nebo mikroby (Zipfel, 2008). Pro usnadnění infekce virulentní patogeny potlačují PTI sekrecí patogenních efektorů a manipulují s hostitelskými buňkami, aby usnadnily získávání živin a nakonec reprodukci (Tsuda a Katagiri, 2010). Nízkoúrovňová rezistence, kterou rostlina projevuje vůči těmto virulentním patogenům, se nazývá bazální rezistence (Jones a Dangl, 2006; Klessig et al., 2018). Na druhé straně je ETI zprostředkována rostlinami kódovanými proteiny rezistence vůči chorobám (R), které mohou přímo nebo nepřímo rozpoznat přítomnost efektorů vylučovaných patogeny (Tsuda a Katagiri, 2010). Většina R proteinů obsahuje nukleotidové vazebné místo a na leucin bohatou opakující se doménu (NB-LRR). Proteiny NB-LRR, které obsahují doménu interakce protein-protein N-terminální Toll/interleukin-1 receptor (TIR), jsou známé jako proteiny TIR-NB-LRR (TNL) a tvoří největší skupinu NB- LRR proteiny (Caplan et al., 2008). Ve srovnání s bazální rezistencí indukuje ETI silnější a rychlejší obrannou reakci proti patogenům a je často doprovázena lokální buněčnou smrtí, což je charakteristický rys hypersenzitivní reakce (HR; Dodds a Rathjen, 2010). ZVÝŠENÁ CITLIVOST K ONEMOCNĚNÍM 1 (EDS1), centrální regulátor imunity rostlin, pomáhá kontrolovat bazální rezistenci omezením invaze biotrofních a hemibiotrofních patogenů (Wiermer et al., 2005). EDS1 hraje také důležitou roli v ETI, která je zprostředkována především TNL třídou R proteinů (Heidrich et al., 2012). EDS1 úzce spolupracuje se svými koregulátory PHYTOALEXIN DEFICIENT 4 a SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 101 v cytoplazmě a/nebo jádře na regulaci produkce intracelulárních reaktivních forem kyslíku (ROS), akumulace kyseliny salicylové (SA) a dalších procesů, čímž se posiluje odolnost vůči patogenům (Ruste ´rucci a kol., 2001; Rietz a kol., 2011; Wagner a kol., 2013). Mutant Arabidopsis eds1 je tedy vysoce citlivý na Pseudomonas syringae pv. rajčatový (Pst) kmen DC3000 a vykazuje kompromitovanou ETI zprostředkovanou TNL, ve které je inhibována exprese ISOCHORISMATE SYNTÁZE1 (ICS1; SA biosyntetický gen) a biosyntéza SA (Parker et al., 1996; Feys et al., 2001; Bartsch et al., 2006). Kromě toho EDS1 vykazuje transport proteinů mezi cytoplazmou a jádrem zprostředkovaný nukleárními transportními receptory (Garcı´a et al., 2010). Ačkoli jaderné funkce EDS1 zahrnují bazální rezistenci a produkci ROS, programovaná buněčná smrt a posílení rezistence vyžadují koordinaci jaderné versus cytoplazmatické lokalizace EDS1 (Heidrich et al., 2011). Rovnováha mezi množstvím EDS1 v cytosolu a množstvím v jádře je důležitá pro účinnou bazální rezistenci a imunitu spouštěnou TNL (Garci´a et al., 2010). Nicméně, jak EDS1 udržuje nukleocytoplazmatický distribuční vzorec během vrozených imunitních reakcí rostlin, zůstává nejasné. DnaJ proteiny (nebo J proteiny) jsou chaperonové proteiny (Pulido a Leister, 2018), které patří do superrodiny domén bohatých na cystein (Cys) a podílejí se na skládání a sestavování nascentních proteinů, transportu proteinů přes membrány s následným přebalováním a likvidace nesbalených nebo defektních proteinů (Bukau et al., 2006). Tyto procesy jsou nezbytné pro normální funkci většiny buněčných proteinů v různých vývojových stádiích (Pulido a Leister, 2018). Výzkum v různých organismech ukazuje, že proteiny DnaJ hrají také různé role v biotických a abiotických reakcích na stres, zejména v imunitních reakcích. U Nicotiana benthamiana funguje DnaJ protein Nb-MIP1 jako cochaperon v reakci na virové patogeny (Du et al., 2013). Soybean (Glycine max L.) Gm-heat shock protein 40 (HSP40.1), v jádře lokalizovaný DnaJ protein, je pozitivním regulátorem rezistence vůči viru mozaiky sóji (Liu a Whitham, 2013). U rajčat (Solanum lycopersicum) bylo hlášeno, že protein DnaJ lokalizovaný v chloroplastech, Le-CDJ2, zlepšuje odolnost vůči bakteriálnímu patogenu, Pseudomonas solanacearum (Wang et al., 2014). Kromě toho bylo uvedeno, že Tsi1- interagující protein1 (Tsip1), tabákový (Nicotiana tabacum) DnaJ protein, reguluje Tsi1-zprostředkovanou transkripční aktivaci v reakci na stres (Ham et al., 2006). Tyto výsledky jasně ukazují, že proteiny DnaJ hrají důležitou roli v imunitě rostlin, ačkoli základní mechanismy vyžadují další výzkum. V této studii jsme izolovali Arabidopsis thaliana EDS1 INTERACTING J PROTEIN 1 (EIJ1), HSP40-jako DnaJ protein, a ukázali jsme, že EIJ1 interagoval s EDS1 u rostlin. Mutované rostliny eij1 se ztrátou funkce vykazovaly normální růst, silnější rezistenci vůči patogenům a vyšší expresi genů souvisejících s odolností po infekci patogeny ve srovnání s rostlinami divokého typu. Mutace se ztrátou funkce EIJ1 však nezachránila citlivý fenotyp mutantu eds1 po expozici Pst DC3000. Protein EIJ1, který se normálně lokalizuje v chloroplastu, byl navíc po inokulaci patogenem uvolněn z chloroplastu do cytoplazmy, kde interagoval s EDS1, čímž se zabránilo jeho patogenem spouštěnému transportu do jádra a v důsledku toho byla včas ohrožena reakce rezistence. stádium infekce. Tato zjištění objasňují důležité detaily regulačního mechanismu, který je základem nukleocytoplazmatického distribučního vzorce EDS1 a poskytují potenciálně účinný cíl pro šlechtění plodin odolných vůči chorobám.

cistanche výhody-posilují imunitní systém

Výsledek

EIJ1 interaguje s EDS1 in vitro a in vivo

Jako základní součást obranných reakcí rostlin je EDS1 umístěn v klíčovém uzlu signální sítě přirozené imunity rostliny. Abychom identifikovali potenciální interagující proteinové partnery EDS1, provedli jsme kvasinkový dvouhybridní screening. EDS1 vykazoval silnou interakci s Arabidopsis HSP40- jako chaperonový protein (AT2G24860) s neznámou funkcí (obrázek 1, A a B), patřící do nadrodiny DnaJ (doplňkový obrázek 1A); tento protein je dále označován jako EIJ1. Sekvenční analýza ukázala, že EIJ1 obsahuje 144 aminokyselinových zbytků, včetně čtyř motivů Zn prstů bohatých na Cys (CXXCXGXG; doplňkový obrázek 1A). Ačkoli jiné druhy krytosemenných mají homology EIJ1, zdá se, že nejbližší homology jsou omezeny na Brassicaceae (doplňkový obrázek 1B a soubor S1). Je pozoruhodné, že EIJ1 vykazoval sekvenční podobnost s proteinem N. tabacum Tsip1, který se podílí na rezistenci vůči patogenům (doplňkový obrázek 1B; Ham et al., 2006). K identifikaci funkčních domén odpovědných za interakci mezi EDS1 a EIJ1 byly v kvasinkových dvouhybridních testech použity dvě zkrácené verze těchto proteinů (obrázek 1A; doplňkový obrázek 1A). N konec EIJ1 vykazoval silnou interakci s EDS1 plné délky, stejně jako EDS1 N konec, ale slabou interakci s EDS1 C koncem (obrázek 1B). To naznačuje, že N konec EDS1 obsahující doménu podobnou lipáze a N konec EIJ1 jsou nezbytné a dostatečné pro jejich interakci. Ačkoli C konec EIJ1 obsahuje konzervovanou doménu Zn prstu bohatou na Cys, která může usnadnit její vazbu na DNA nebo jiné proteiny, nepřispívá k interakci s EDS1. Pull-down testy dále ověřovaly interakci mezi EDS1 a EIJ1 in vitro (obrázek 1C), zatímco koimunoprecipitační (Co-IP) testy využívající transgenní rostliny 35Spro: EIJ1- 6HA 35Spro: EDS1-3FLAG potvrdili jejich interakci v planta (obrázek 1D). Celkově tyto výsledky ukazují, že EDS1 interaguje s EIJ1 in vitro i in vivo. Charakterizace EIJ1 Abychom určili subcelulární lokalizaci EIJ1, fúzovali jsme otevřený čtecí rámec EIJ1 s reportérovým genem mCherry pod kontrolou promotoru 35S viru květákové mozaiky, abychom vytvořili konstrukt 35Spro: EIJ1-mCherry. Tento konstrukt byl přechodně transformován do listů N. benthamiana agroinfiltrací. Fluorescenční mikroskopie ukázala, že EIJ1-mCherry byla lokalizována jak v chloroplastu, tak v jádře (obrázek 2A). Tento lokalizační vzorec byl potvrzen imunoblotovou analýzou transgenních rostlin 35Spro: EIJ1-6HA (doplňkový obrázek 2). Pro zkoumání expresního vzoru EIJ1 byla genomová sekvence EIJ1 fúzována s reportérovým genem ß-glukuronidázy (GUS), aby se vytvořily EIJ1pro: EIJ1-GUS transgenní linie Arabidopsis. Silná aktivita GUS byla detekována v listech a kořenech růžice; nicméně aktivita GUS byla slabá u křemene a nedetekovatelná ve stoncích a květech (obrázek 2B). Tyto výsledky byly v souladu s výsledky exprese pro EIJ1, která byla zkoumána pomocí kvantitativní reverzní transkripce-PCR (RT-PCR) v různých tkáních (obrázek 2C). Vzhledem k tomu, že EDS1 je centrální regulátor imunity rostlin (Saikat et al., 2011), zkoumali jsme, zda se EIJ1, domnělý kofaktor EDS1, také podílí na reakci na infekci patogeny. Úroveň transkriptu EIJ1 byla indukována ošetřením buď hemibiotrofními bakteriemi Pst DC3000 nebo SA (obrázek 2D). Barvení GUS odhalilo, že EIJ1 byl indukován a výrazně koncentrován kolem trichomů v listech naočkovaných Pst DC3000- (obrázek 2E–G), což naznačuje možnou biologickou relevanci EIJ1 v obranné reakci (Xin a He, 2013). Dále jsme zkoumali hladinu EIJ1 v rostlinách 35Spro: EIJ1-HA ošetřených Pst DC3000 nebo SA. Je zajímavé, že po ošetření Pst DC3000 nebo SA byl EIJ1 po rychlé indukci postupně degradován (obrázek 2, H a I). Tento výsledek nebyl v souladu se stabilním vzorem exprese EIJ1-HA pozorovaným u rostlin 35Spro:EIJ1-HA během infekce patogenem (doplňkový obrázek 3), což ukazuje na posttranskripční regulaci EIJ1. Tyto výsledky společně naznačují, že EIJ1 se podílí na imunitní reakci rostlin.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Mutace se ztrátou funkce EIJ1 zvyšuje odolnost vůči Pst DC3000 prostřednictvím SA dráhy

Abychom prozkoumali roli EIJ1 v imunitě rostlin, identifikovali jsme mutant Arabidopsis (SALK_142975) obsahující inzerci T-DNA ve třetím exonu EIJ1 (obrázek 3, A a B). Kvantitativní analýza RT-PCR ukázala, že EIJ1 byl v tomto inzerčním mutantu eij1 T-DNA slabě exprimován; proto jsme tuto alelu EIJ1 pojmenovali eij{{10}} (obrázek 3C). Následně jsme vyhodnotili fenotyp rezistence vůči chorobám u 3-týdenních eij{14}} mutantních rostlin a rostlin Arabidopsis (A. thaliana) ekotypu Columbia (Col-0; divoký typ) inokulací Pst DC3000. Hodnocení infikovaných listů 5 dní po inokulaci (dpi) odhalilo méně nekrotických lézí na listech eij1-1 než na listech Col-0 (obrázek 3D). Listy eij1-1 konzistentně vykazovaly výrazně nižší bakteriální titr než listy Col-0 při rozlišení 5 dpi, ačkoli bakteriální titr nevykazoval žádný rozdíl mezi listy Col-0 a eij{26}} při 0 dpi (obrázek 3E). Dále jsme vygenerovali komplementační linie eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA transformací genomového fragmentu EIJ1 fúzovaného se sekvencí značky 6xHA na pozadí eij1-1. Komplementační linie zcela zachránily fenotyp rezistence vůči patogenu eij1-1 (obrázek 3E), což podporuje, že eij1-1 je mutant se ztrátou funkce. Pro stanovení účinku EIJ1 na apoplastickou imunitu byl fenotyp rezistence na onemocnění těchto komplementačních linií také hodnocen tlakovou infiltrací Pst DC3000 a byly získány podobné výsledky (doplňkový obrázek 4A). Abychom potvrdili funkci EIJ1, identifikovali jsme další mutant eij1-2 Arabidopsis (WiscDsLox343G09), který obsahoval inzerci T-DNA v promotorové oblasti EIJ1 (doplňkový obrázek 5, A a B). Transkripty EIJ1 byly v mutantě eij1-2 sotva detekovatelné, což naznačuje, že eij1-2 je nulová alela EIJ1. Podobně jako u eij1-1 testy bakteriálního růstu odhalily, že eij1-2 byl přítomen při významně nižším bakteriálním titru než Col-0 (doplňkový obrázek 5, D a E). V souhrnu tyto výsledky naznačují, že EIJ1 hraje důležitou represivní roli v imunitní odpovědi rostlin.

Obrázek 1 EIJ1 interaguje s EDS1 in vitro a in planta. (A) Schematický diagram znázorňující domény nalezené v EIJ1, EDS1 a jejich zkrácené verze. (B) Kvasinkové dvouhybridní testy ukazují interakce mezi EIJ1, EDS1 a jejich zkrácenými verzemi. Transformované kvasinkové buňky byly pěstovány na médiu SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade a SD/-Trp/-Leu. Prázdné, pouze vektorové ovládací prvky; AD, aktivační doména; BD, doména vázající DNA. (C) Pull-down test ukazující přímou interakci mezi fúzními proteiny His-EIJ1 a GST-EDS1 in vitro. His-EIJ1 proteiny byly inkubovány s imobilizovaným GST nebo GST-EDS1 proteinem. Imunoprecipitované frakce byly detekovány anti-His a anti-GST protilátkami, v daném pořadí. (D) Co-IP ukazující interakci EIJ1 a EDS1 v listech Arabidopsis. Celkové proteiny extrahované z 3-týden starých listů 35Spro: EIJ1-6HA (jako kontrola genotypu) a 35Spro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG listy byly imunoprecipitovány buď anti-FLAG protilátka nebo preimunní sérum (IgG). Koimunoprecipitované proteiny byly detekovány pomocí anti-FLAG a anti-HA protilátek, v daném pořadí. Reprezentativní výsledky uvedené v (B–D) byly nezávisle třikrát opakovány.

Produkce peroxidu vodíku (H2O2), typu reaktivních forem kyslíku, je charakteristickým znakem úspěšného rozpoznání patogenů a následné aktivace obranných reakcí rostlin, včetně programované buněčné smrti související s HR (Lam et al., 2001; Torres et al. al., 2006; Nanda et al., 2010). Proto jsme monitorovali hladinu H2O2 v 3-týdenním patogenem naočkovaném Col-0, eij1-1 a eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA rostliny pomocí 3,3-diaminobenzidinové (DAB) barvicí metody. Výsledky ukázaly, že H2O2 se nahromadil ve vysokých hladinách v infikovaných rostlinách, ale nebyl detekován v nenaočkovaných (falešných) rostlinách (obrázek 3F). Vyšší hladina H2O2 byla detekována v listech eij1-1 než v listech Col- 0 a komplementačních liniích naočkovaných Pst DC3000 (obrázek 3F). Kromě toho, zatímco barvení trypanovou modří odhalilo, že buněčná smrt (microHR, Alvarez et al., 1998) nastala v eij1-1 listech 24-h po inokulaci (HPI) Pst DC3000, ale ne microHR byla pozorována v rostlinách Col-0 a eij1-1 EIJpro1:EIJ1-6HA (obrázek 3G). Inokulace avirulentním Pst DC3000 (AvrRps4) měla za následek vyšší akumulaci H2O2 a více microHR, ačkoli mezi těmito třemi genotypy nebyl pozorován žádný viditelný rozdíl (obrázek 3, F a G). Tyto výsledky naznačují zásadní roli EIJ1 v bazální rezistenci vůči patogenům.

Obrázek 2 Vzorec exprese EIJ1 mRNA a proteinu. (A) Chloroplast a lokalizace jádra EIJ1. Fúzní protein EIJ1-mCherry byl přechodně exprimován v listech N. benthamiana a analyzován konfokální mikroskopií. Fluorescence DAPI označuje jádro. Fluorescence chlorofylu je označena zelenou barvou. Pruh=10 lm. (B) Barvení GUS ukazující expresi EIJ1 v kořenech, stoncích, růžicích listech, květech, silique a 10-denních semenácích (zleva doprava). Pruh=1 mm. (C) Vzorec exprese EIJ1 v různých tkáních rostlin Col včetně kořenů, stonků, listů růžice, květů a křemenů, jak bylo detekováno pomocí qRT-PCR. Relativní exprese byla vypočtena normalizací hladiny transkripce zkoumaného genu proti hladině ACTIN2 (stejně jako níže). Data jsou průměrem ± SD ze tří biologických replikátů. Malá písmena označují významné rozdíly (jednosměrná ANOVA, P 5 0.01; soubor doplňkových dat 1). (D) Expresní analýza EIJ1 pomocí 3-týden starých rostlin Col naočkovaných Pst DC3000 (OD600=0.1) nebo postříkaných 0,05 mM SA. Data jsou průměrem ± SD tří biologických replikátů (soubor doplňkových dat 1). (E–G) Barvení GUS ukazuje indukci exprese EIJ1 patogeny. Tři týdny staré rostliny pEIJ1:EIJ1-GUS byly simulovaně naočkovány (10 mM MgCl2; E) nebo naočkovány ponorem Pst DC3000 (OD600=0.1; F). Pruh=1 mm. Zvětšený obrázek ukazuje, že EIJ1-GUS se soustřeďuje v oblasti trichomu v (G). Pruh=100 lm. Listy při 4 hpi byly sklizeny a inkubovány s roztokem pro barvení GUS. (H) a (I) Vzorec exprese EIJ1 po léčbě Pst DC3000 nebo SA. Celkové proteiny byly extrahovány z 3-týden starých rostlin 35Spro: EIJ1-6HA ponořených Pst DC3000 (OD600=0.1; H) nebo postříkaných 0,05 mM SA (I), a detekován pomocí anti-HA protilátky. Spodní panely ukazují barvení Coomassie Brilliant Blue (CBB) jako kontrolu nanášení. Imunoblotové analýzy uvedené v (H) a (I) byly nezávisle třikrát opakovány.

Obrázek 3 Identifikace mutované alely eij1-1 Arabidopsis EIJ1. (A) Schematický diagram ukazující místo inzerce T-DNA v eij1-1 (SALK_142975). Exony jsou reprezentovány rámečky a introny čarami mezi rámečky. Černé rámečky představují kódující oblasti EIJ1 a bílé rámečky představují nepřeloženou oblast. Trojúhelník označuje místo inzerce T-DNA. (B) PCR amplifikace genomové DNA potvrzuje, že eij1-1 je homozygotní inzerční mutant. Použité primery (P1, P2) jsou uvedeny v (A). LB označuje T-DNA levý okrajový primer a M označuje molekulární markery DNA. (C) qRT-PCR analýza exprese EIJ1. Celková RNA byla extrahována z 3-týdenních listů eij1 a Col. Relativní exprese EIJ1 v eij1-1 byla nastavena na 1. Data jsou průměrem ± SD tří biologických replikátů (soubor doplňkových dat 1). (D) Fenotyp Col, eij1-1 rezistence vůči chorobám a dvě reprezentativní transgenní linie komplementace EIJ1 eij1 EIJ1pro: EIJ1-6HA. Tři týdny staré rostliny byly naočkovány Pst DC3000 (OD600=0.05). Zobrazené listy byly vyfotografovány v rozlišení 5 dpi. Pruhy=5 mm. (E) Bakteriální růst Pst DC3000 na rostlinách popsaných v (D) při 0 a 5 dpi. cfu/g, jednotky tvořící kolonie na g čerstvé hmotnosti. Data jsou průměrem ± SD ze tří biologických replikátů. Malá písmena označují významné rozdíly (jednosměrná ANOVA, P 5 0.01, soubor doplňkových dat 1). (F) Vyšetření hladin H2O2 v listech Col,

EIJ1 zprostředkovává imunitu rostlin potlačením aktivity EDS1

Abychom porozuměli genetickému vztahu mezi EDS1 a EIJ1, vytvořili jsme eij1-1 eds1-22 dvojité mutantní linie křížením eij1-1 mutanty s eds1-22, což je ztráta- funkční mutantní alela EDS1-90 (AT3G48090; pozadí Col{11}}), která vykazuje sníženou rezistenci vůči patogenům (Yang a Hua, 2004). Mezi mutantními rostlinami eij1-1, eds1-22 a eij1-1eds1-22 za normálních růstových podmínek nebyl pozorován žádný morfologický rozdíl (obrázek 4, A a B). Po inokulaci Pst DC3000 vykazovaly mutantní rostliny eij{19}} silnější rezistenci než rostliny Col{20}} při rozlišení 5 dpi (obrázek 4, A a B). Dvojitý mutant eij1-1 eds1-22 však vykazoval pozoruhodné nekrotické léze a vysoký bakteriální titr, srovnatelný s jednoduchým mutantem eds{25}}, což naznačuje, že alela eij{26}} nebyla schopna k záchraně fenotypu eds citlivých na onemocnění1-22 (obrázek 4, A a B). Odolnost vůči chorobám byla také hodnocena po tlakové infiltraci Pst DC3000 a byly získány podobné výsledky (doplňkový obrázek 4B). Dále jsme použili nulovou alelu EDS1, eds1-2; pozadí Col{34}}; Bartsch et al., 2006), k vytvoření eij1-1 eds1-2 dvojitě mutantních rostlin pro genetickou analýzu. Podobně jako eij1-1 eds1-22, eij1-1eds1-2 dvojitě mutantní rostliny také vykazovaly pozoruhodné nekrotické léze a vyšší bakteriální titr než eij1-1, což bylo srovnatelné s eds1-2 jednoduchou mutantou (doplňkový obrázek 6). Tento genetický důkaz naznačuje, že EDS1 je epistatický vůči EIJ1. V souladu s výše uvedenými pozorováními se H2O2 nahromadil na vysoké úrovně v eij1-1 listech, ale na nízké úrovně v eds{50}} a eij{51}} eds1-22 listech ve srovnání s Col{1-22 53}} po inokulaci Pst DC3000 (obrázek 4C). Kromě toho byla mikroHR v eij1-1 jasně potlačena ztrátou funkce EDS1 při 24 hpi s Pst DC3000 nebo avirulentním Pst DC3000 (AvrRps4; obrázek 4D). V souladu s tímto výsledkem byly hladiny exprese ICS1 a PR1 v rostlinách eij1-1 eds1-22 a eds1-22 srovnatelné, ale podstatně nižší než v rostlinách eij1-1 a Col{ {71}} rostlin (obrázek 4E). Tyto výsledky podporují, že vrozená imunitní odpověď zprostředkovaná EIJ1- je závislá na EDS1. Abychom prozkoumali roli interakce EIJ1–EDS1 v imunitní reakci rostlin, provedli jsme analýzu RNA-seq listů eij1-1, eds1-22 a Col{80}} při 24 hpi s Pst DC3000 ; s nenaočkovanými listy Col{83}} byly použity jako falešná léčba. Celkem 2762, 923 a 622 odlišně exprimovaných genů (DEG) bylo identifikováno v Col_Pst DC3000 versus Col_mock, eij1-1_Pst DC3000 versus Col_ Srovnání Pst DC3000 a eds1-22_Pst DC3000 versus Col{96}}Pst DC3000. Tyto geny jsou dále označovány jako geny reagující na patogeny, regulované EIJ 1-a EDS{100} regulované geny (doplňkový obrázek 7A a soubor dat 2). Z těchto genů bylo 471 regulováno EIJ1; 396 byly regulovány pomocí EDS1 (obrázek 4F; soubor doplňkových dat 2); a 124 byly koregulovány pomocí EIJ1 a EDS1 (obrázek 4F). Shluková analýza ukázala, že 93,5 % (116) společně regulovaných genů (124) bylo up-regulováno pomocí EDS1 a down-regulováno pomocí EIJ1 (obrázek 4F; doplňkový obrázek 7B a soubor dat 2), což podporuje represivní roli EIJ1 na Funkce EDS1. Analýza genové ontologie (GO) dále odhalila, že většina genů regulovaných antagonisticky pomocí EIJ1 a EDS1 se podílí hlavně na stresových reakcích a vrozených imunitních reakcích (obrázek 4G; doplňková tabulka S1). Tyto analýzy naznačují, že EIJ1 a EDS1 regulují geny související s rezistencí kontrastním způsobem během infekce patogeny. Značná část EDS1-regulovaných genů (272/396) nebyla regulována EIJ1, pravděpodobně kvůli nižší násobné změně (52) nebo EIJ1-nezávislé funkci EDS1.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

EIJ1 interaguje s EDS1 v cytoplazmě a inhibuje jaderné obchodování EDS1

EIJ1 je lokalizován v chloroplastu a jádře listových buněk (obrázek 2A), zatímco protein EDS1 vykazuje nukleocytoplazmatický distribuční vzorec, který se vyskytuje na obou místech (Garci´a et al., 2010). Abychom prozkoumali, kde a jak EIJ1 interaguje s EDS1 v rostlině, provedli jsme přechodné expresní testy s použitím protoplastů Arabidopsis. Je zajímavé, že ačkoli si EIJ1 zachoval svůj původní subcelulární lokalizační vzorec v chloroplastu a jádře v přítomnosti zeleného fluorescenčního proteinu (GFP; kontrola), EIJ1-mCherry lokalizovaný v chloroplastech byl difundován v cytoplazmě, když byl koexprimován s EDS{ {9}}GFP v protoplastech (obrázek 5A, viz repliky v doplňkovém souboru 2). Tento jev byl potvrzen v epidermálních buňkách N. benthamiana, ve kterých byla EIJ1-mCherry přechodně koexprimována buď s EDS1-GFP, nebo s kontrolou GFP (doplňkový obrázek 8, viz repliky v doplňkovém souboru 2) . Tato pozorování naznačují, že nadměrná exprese EDS1 může vést k subcelulární relokalizaci EIJ1. Dále, abychom určili subcelulární umístění, kde EDS1 a EIJ1 interagují, provedli jsme pull-down test s použitím rekombinantního glutathion S-transferázy (GST)-EDS1 fúzního proteinu (návnady) a celkového proteinového extraktu, frakcí ochuzených o jádra a jader- obohacené frakce transgenních linií 35Spro: EIJ1-HA (kořistní proteiny). Naše výsledky ukázaly, že EDS1 imunoprecipitoval s EIJ1-HA při použití celkového proteinového extraktu a frakcí 35Spro zbavených jader: listy EIJ1-HA, ale nikoli při použití frakcí obohacených o jádra (obrázek 5B), což naznačuje, že k interakci mezi EIJ1 a EDS1 dochází v cytoplazmě.

Obrázek 4 EIJ1 a EDS1 opačně regulují odolnost rostlin vůči patogenům. (A) Fenotyp odolnosti vůči chorobám Col, eij1-1, eds1-22 a eij{5}} eds1-22. Tři týdny staré rostliny byly naočkovány Pst DC3000 (OD600=0.05). Zobrazené listy byly vyfotografovány v rozlišení 5 dpi. Pruh=5 mm. (B) Bakteriální růst Pst DC3000 na rostlinách popsaných v (A) při 0 a 5 dpi. Data jsou průměrem ± SD ze tří biologických replikátů. Malá písmena označují významné rozdíly (jednosměrná ANOVA, P 5 0.01, soubor doplňkových dat 1). (C) Zkoumání hladin H2O2 v závodech Col, eij1-1, eds1-22 a eij{26}} eds1-22. Tři týdny staré rostliny byly naočkovány Pst DC3000 nebo Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) a poté obarveny DAB při 24 hpi. Pruh=500 lm. (D) Analýza buněčné smrti rostlin Col, eij1-1, eds1-22 a eij{40}} eds1-22. Tři týdny staré rostliny byly dipinokulovány Pst DC3000 nebo Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) a poté obarveny trypanovou modří při 24 hpi. Pruh=500 lm.

Vzhledem k tomu, že EIJ1 negativně reguluje imunitní odpověď rostlin v závislosti na EDS1- (obrázek 4), dále jsme zkoumali účinek patogenů na interakci mezi EIJ1 a EDS1. Infekce Pst DC3000 překvapivě zvýšila interakci EDS1–EIJ1 v cytoplazmě spíše než v chloroplastu i jádře (obrázek 5C, viz repliky v doplňkovém souboru 2). Toto zjištění, spolu s nukleocytoplazmatickým distribučním vzorem EDS1 a úlohou jaderné lokalizace EDS1 při posilování rezistence patogenů na transkripční úrovni (Garcı´a et al., 2010), nás přimělo prozkoumat roli EIJ1 v subcelulární transport EDS1 během infekce patogenem. Když jsme přechodně exprimovali EDS1-3FLAG v protoplastech Arabidopsis izolovaných z rostlin eij1-1, nadměrné exprese EIJ1 a Col{19}}, EIJ1 výrazně potlačila přenos EDS1 do jádra (doplňkový obrázek 9) . Kromě toho imunoblotová analýza odhalila malý rozdíl v množství celkového proteinu EDS1 mezi eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG a eij{27}} eds1-22 EDS1pro: EDS{{30} } FLAG transgenní rostliny (obrázek 5D, viz repliky v doplňkovém souboru 2). Ve srovnání s eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG transgenní rostliny, Pst DC{36}} naočkované eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS13FLAG rostliny vykázaly výrazný nárůst v hladině proteinu EDS1 obohaceného jádry a snížení hladiny EDS1 lokalizovaného v cytoplazmě (obrázek 5D, viz repliky v doplňkovém souboru 2), což potvrzuje represivní roli EIJ1 při přenosu EDS1 z cytoplazmy do jádra. Dále jsme testovali, zda tento proces redistribuce zprostředkovaný interakcí EIJ1–EDS1 ovlivnil transkripční regulaci genů souvisejících s rezistencí v rostlinách. Efektorové konstrukty 35Spro: EIJ1-mCherry a 35Spro: EDS1-3FLAG efektorové konstrukty byly transformovány jednotlivě nebo společně s reportérovými konstrukty do listových epidermálních buněk N. benthamiana (obrázek 5E). Při 24 hpi s Pst DC3000 EDS1 aktivoval expresi PR1 a ICS1 (obrázek 5F), zatímco EIJ1 výrazně inhiboval genovou expresi indukovanou EDS1- (obrázek 5F). Na rozdíl od EIJ1 plné délky nebyl N-terminální konec proteinu EIJ1, který není ovlivněn v eij1-1, schopen inhibovat expresi PR1 indukovanou EDS1- (doplňkový obrázek 10, A a B ), což naznačuje, že intaktní proteinová struktura EIJ1 je nezbytná pro jeho represivní funkci. Tyto výsledky společně podporují, že EIJ1 funguje jako nezbytný represor v odpovědi na rezistenci zprostředkovanou EDS{77}} tím, že reguluje nukleocytoplazmatický přenos EDS1. Protože protein EIJ1 byl postupně degradován v rostlinách naočkovaných Pst DC{80}} nebo ošetřených SA po rychlé počáteční indukci (obrázek 2, H a I), zkoumali jsme, zda EDS1 naopak spouští degradaci EIJ1 prostřednictvím interakce protein-protein. Bezbuněčné degradační testy a in vivo testy detekce proteinů pomocí eds1-22 35Spro: EIJ1-HA transgenních rostlin ukázaly, že ani nepřítomnost, ani přítomnost EDS1 neovlivnila degradaci EIJ1 (doplňkový obrázek 11), což naznačuje, že EDS1 se nepodílí na patogenem spouštěné degradaci EIJ1.

Výhody cistanche tubulosa- posílení imunitního systému

Patogenní infekce mění subcelulární lokalizaci EIJ1

Zesílená interakce mezi EIJ1 a EDS1 v cytoplazmě po inokulaci patogenem (obrázek 5, B a C) znamenala možnou relokalizaci EIJ1 v rostlinných buňkách spouštěnou patogenem. Abychom tuto možnost otestovali, zkoumali jsme subcelulární lokalizaci EIJ1 v listech N. benthamiana naočkovaných Pst DC3000. Za neinfikovaných podmínek byla EIJ1-mCherry lokalizována do chloroplastu a jádra. Avšak při 24 dpi byly fluorescenční signály v chloroplastech značně sníženy a byly zesíleny v cytoplazmě (obrázek 6A). Aby bylo možné dále určit, zda patogeny spouštějí disociaci EIJ1 z chloroplastu do cytoplazmy v listech, byla provedena imunoblotová analýza proteinu EIJ1 pomocí transgenních rostlin 35Spro: EIJ1-6HA. Celkové proteiny, chloroplastové proteiny a cytoplazmatické proteiny byly izolovány z 35Spro:EIJ1-6HA transgenních rostlin při 0 a 4 hpi s Pst DC3000. Množství EIJ1 bylo pozoruhodně zvýšeno v cytoplazmatické frakci, ale sníženo ve frakci chloroplastů při 24 dpi (obrázek 6B, viz repliky v doplňkovém souboru 2), což ukazuje na negativní korelaci mezi hladinami proteinu EIJ1 v chloroplastu a cytoplazmě.

Obrázek 5 EIJ1 interaguje s EDS1 v cytoplazmě za účelem zprostředkování jaderného obchodování EDS1. (A) Analýza přechodné exprese ukazující lokalizaci EDS1 a EIJ1 v protoplastech Arabidopsis. Pruh=10 lm. (B) Pull-down test interakce mezi EIJ1 a EDS1. Celkové proteiny, frakce ochuzené o jádra a frakce obohacené o jádra extrahované z 3-týden starých transgenních rostlin eij1-1 35Spro: EIJ1-6HA byly inkubovány s imobilizovanými proteiny GST-EDS1 nebo GST , resp. IP byly detekovány pomocí anti-HA nebo anti-GST protilátek. Jako cytoplazmatické a nukleární markery byly použity PEPC a histon H3. Hvězdičky označují pruhy proteinů GST-EDS1. (C) Infekce Pst DC3000 zvyšuje proteinovou interakci EDS1 a EIJ1 v cytoplazmě. Celkové proteiny, frakce ochuzené o jádra, frakce obohacené o jádra a chloroplastové proteiny byly extrahovány z 3-týden starých rostlin EIJ1pro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG naočkovaných Pst DC3000 (OD600=0.1) nebo falešně naočkováno při 4 hpi a imunoprecipitováno pomocí buď anti-FLAG protilátky nebo preimunního séra (IgG). Koimunoprecipitované proteiny byly detekovány pomocí anti-HA a anti-FLAG protilátek. frakce ochuzené o N, jádra ochuzené; Frakce obohacené o N, jádra obohacené. Jako cytoplazmatické a nukleární markery byly použity PEPC a histon H3. (D) Imunoblotová analýza ukazuje, že EIJ1 zprostředkovává cytoplazmatickou versus jadernou distribuci EDS1. Celkové proteiny, frakce ochuzené o jádra a frakce obohacené o jádra byly extrahovány z 3-týden starých eds1-22 EDS1pro: EDS1- 3FLAG a eij1-1 eds{{59 }} EDS1pro: EDS1-3FLAG transgenní rostliny naočkované Pst DC3000 (OD600=0.1) nebo simulované naočkování při 4 hpi a detekované pomocí protilátky anti-FLAG. Relativní intenzita proteinů z eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG s falešnou inokulací nastavenou na 1. M, falešná; P, Pst DC3000. Jako cytoplazmatické a nukleární markery byly použity PEPC a histon H3. Výsledky uvedené v (A), (C) a (D) byly nezávisle třikrát opakovány (doplňkový soubor 2). (E) a (F) Přechodná analýza aktivity promotoru PR1 a ICS1 regulované EIJ1 a EDS1. Různé konstrukty používané v testech přechodné exprese jsou ukázány v (E). Buď PR1pro: GUS nebo ICS1pro: GUS byl kotransformován s efektory nebo prázdným vektorem (kontrola) do listů N. benthamiana pokapaných Pst DC3000 (OD600=0.1) po dobu 24 hodin. Relativní aktivita GUS (GUS/luciferáza), která indikuje hladinu exprese PR1 a ICS1 regulovanou různými efektory, je ukázána v (F). Data jsou průměrem ± SD tří biologických replikátů (soubor doplňkových dat 1). Malá písmena označují významné rozdíly (jednosměrná ANOVA, P 5 0.01).

Patogenem spouštěná disociace EIJ1 z chloroplastu naznačuje potenciální funkci EIJ1 v cytoplazmě. Abychom tuto možnost otestovali, imobilizovali jsme protein EIJ1 na chloroplasty připojením sekvence cílené na chloroplast (CTS; Lee et al., 2008) k N-terminálnímu konci reportérového genu EIJ1-mCherry. Fúze CTS-EIJ1-mCherry byla poté exprimována v listech N. benthamiana pod kontrolou nativního promotoru. Fluorescence byla detekována pouze v chloroplastech, ale ne v cytosolu a jádře listů N. benthamiana naočkovaných Pst DC 3000- (doplňkový obrázek 12A). Toto pozorování potvrdilo, že CTStagged EIJ1 byl zachován v chloroplastu a nebyl vtlačen do cytoplazmy patogenní infekcí. Následně jsme vytvořili EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA transgenní linie Arabidopsis, abychom vyhodnotili biologickou funkci CTS-EIJ1 v imunitní odpovědi rostlin. Jak se očekávalo, na rozdíl od eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA linie eij1-1 EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA nevykazovaly žádný významný rozdíl v odolnosti vůči patogenům ve srovnání s eij1-1, což naznačuje, že EIJ1 imobilizovaný v chloroplastu není schopen zachránit fenotyp eij1-1 rezistence vůči chorobám (obrázek 6C). V souladu s tímto pozorováním byla exprese PR1 udržována na vysoké úrovni v eij1-1 EIJ1pro: CTSEIJ1-6HA transgenních rostlinách, podobných eij1-1 (doplňkový obrázek 12B). Kromě toho CTS-EIJ1 vykazoval menší schopnost potlačit transkripční aktivitu EDS1 než EIJ1 (obrázek 6, D a E). Tyto výsledky nás vedly k závěru, že časná reakce hostitele na infekci patogenem spouští subcelulární relokalizaci EIJ1, která zase moduluje imunitní odpověď potlačením přenosu EDS1 do jádra.

EIJ1 reguluje reakci spouštěnou efektorem virulence

Efektorový protein AvrRps4 P. syringae sekretovaný sekrečním systémem typu III je rozpoznán TIR-NB-LRR receptorem RPS4 pro zahájení ETI, který je závislý na EDS1 (Gassmann et al., 1999; Wirthmueller et al., 2007; Heidrich a kol., 2012). Listy eij{8}} jsme naočkovali avirulentním Pst DC3000 (AvrRps4) nebo virulentním Pst DC3000, abychom vyhodnotili, zda je EIJ1 zapojen do ETI. Listy eij{13}} vykazovaly větší odolnost vůči virulentnímu Pst DC3000 než listy Col{15}} (obrázek 7A). Nebyl však pozorován žádný významný rozdíl mezi listy Col-0 a eij{18}} v rezistenci vůči avirulentnímu Pst DC3000 (AvrRps4), ačkoli oba genotypy vykazovaly větší rezistenci vůči avirulentnímu Pst DC3000 (AvrRps4) než vůči Pst DC3000 ( Obrázek 3, F a G; Obrázek 7, A), což naznačuje, že EIJ1 nemusí být pro ETI vyvolanou RPS4-nutná. Stanovili jsme také rezistenci rostlin k Pst DC3000 hrcC, který nese defektní sekreční systém typu III a nedokáže vstřikovat efektory do hostitelských buněk k potlačení PTI (Gassmann et al., 1999; Gloggnitzer et al., 2014). Jak eij1-1 mutant, tak Col-0 listy vykazovaly podobnou rezistenci vůči Pst DC3000 hrcC (doplňkový obrázek 13), což naznačuje, že EIJ1 není zapojen do PTI.

Vzhledem k tomu, že jaderná akumulace EDS1 je nezbytná pro TIR-NB-LRR-indukované přeprogramování exprese obranného genu a rezistence (Garcı´a et al., 2010), zkoumali jsme, zda EIJ1 reguluje subcelulární distribuci EDS1 v reakci na ETI. Byly naočkovány listy 3-týden starých rostlin eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG a eij{12}} eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG buď Pst DC3000 nebo Pst DC3000 (AvrRps4), a frakce ochuzené o jádra a obohacené o jádra byly extrahovány při 0 a 4 hp. V souladu s předchozí studií (Garcı´a et al., 2010) byl pozorován nárůst jaderné lokalizace EDS1 v rostlinách eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG inokulovaných Pst DC3000 (AvrRps4), ale ne u těch naočkovaných Pst DC3000. Ztráta funkce EIJ1 však neovlivnila jadernou akumulaci EDS1 vyvolanou ETI (obrázek 7B; viz repliky v doplňkovém souboru 2). To naznačuje, že avirulentní Pst DC3000 (AvrRps4) buď spouští přenos EDS1 do jádra obcházením EIJ1, nebo neznámým způsobem ruší funkci EIJ1. Abychom otestovali tyto možnosti, zkoumali jsme účinek avirulentního Pst DC3000 (AvrRps4) na hladinu EIJ1. Podobně jako výsledky získané s použitím linií nadměrné exprese EIJ1 (obrázek 2H), rostliny eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA naočkované Pst DC3000 vykazovaly zvýšenou akumulaci EIJ1 v rané fázi infekce, ačkoli EIJ1 byl postupně degradován po 8 hpi (obrázek 7C; viz repliky v doplňkovém souboru 2). Akumulace EIJ1 je dostatečná k tomu, aby zabránila Pst DC3000-spuštěnému transportu EDS1 do jádra v časném stádiu infekce (obrázky 5, D a 7, B). V souladu s tímto výsledkem ztráta funkce EIJ1 urychlila jadernou translokaci EDS1 v infikovaných rostlinách (doplňkový obrázek 14). Na rozdíl od toho Pst DC3000 (AvrRps4) zrušil funkci EIJ1 rychlou indukcí degradace proteinu EIJ1, ale ne potlačením transkripce genu EIJ1 (obrázek 7C; doplňkový obrázek 15), čímž podpořil větší jadernou translokaci EDS1 v rané fázi infekce (obrázek 7B ). Pozorování, že rostliny eij1-1 naočkované Pst DC3000 vykazovaly rezistenci srovnatelnou s odolností rostlin Col-0 a eij1-1 naočkovaných avirulentním Pst DC3000 (AvrRps4), tuto hypotézu podporuje. To může alespoň do určité míry vysvětlovat, proč avirulentní kmen, ale ne virulentní kmen, může vytvořit zesílenou rezistenci ke spuštění ETI reakce. Tato pozorování tedy naznačují, že EIJ1 se podílí na reakci spouštěné efektorem virulence v hostitelských buňkách.

Obrázek 6 Relokalizace EIJ1 do cytoplazmy je nezbytná pro rezistenci závislou na EDS1-. (A) Infekce Pst DC3000 mění subcelulární lokalizaci EIJ1. EIJ1-mCherry byla přechodně exprimována v listech N. benthamiana pokapaných Pst DC3000 (OD600=0.1) nebo falešně inokulovaných po dobu 24 hodin. Pruh=10 lm. (B) Infekce Pst DC3000 spouští disociaci EIJ1 z chloroplastu. Celkové proteiny, cytoplazmatické proteiny a chloroplastické proteiny byly extrahovány z 3-týden starých rostlin EIJ1pro: EIJ1-6HA dip inokulovaných Pst DC3000 (OD600=0.1) nebo falešně inokulovaných při 4 hpi a detekován anti-HA protilátkou. Jako cytoplazmatické, jaderné a chloroplastické markery byly použity PEPC, histon H3 a RbcL. Relativní intenzita proteinů s falešným ošetřením je nastavena na 1. Výsledky uvedené v (A) a (B) byly nezávisle třikrát opakovány (doplňkový soubor 2). (C) Imobilizovaný EIJ1 v chloroplastech není schopen obnovit rezistenci eij1-1. Tři týdny staré rostliny byly naočkovány Pst DC3000 (OD600=0.05). Byl stanoven bakteriální titr Pst DC3000 při 0 a 5 dpi. CTS, lokalizační signály chloroplastů. Data jsou průměrem ± SD tří biologických replikátů (soubor doplňkových dat 1). (D) a (E) Přechodná analýza aktivity PR promotoru regulované EIJ1, CTS-EIJ1 a EDS1. Různé konstrukty používané v testech přechodné exprese jsou ukázány v (D). PR1pro: GUS byl kotransformován s efektory nebo prázdným vektorem (kontrola) do listů N. benthamiana pokapaných Pst DC3000 (OD600=0.1) po dobu 24 hodin. Relativní aktivita GUS (GUS/luciferáza), která indikuje hladinu exprese PR1 regulovanou různými efektory, je ukázána v (E). Chybové úsečky představují standardní odchylku trojitých nezávislých vzorků. Data jsou průměrem ± SD ze tří biologických replikátů. Malá písmena označují významné rozdíly (jednosměrná ANOVA, P 5 0.01, soubor doplňkových dat 1).

Obrázek 7 EIJ1 a EDS1 modulují bazální rezistenci rostlin. (A) Bakteriální růst mutantů Col a eij1-1. Tři týdny staré rostliny byly naočkovány Pst DC3000 nebo Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.05). Byl stanoven bakteriální titr Pst DC3000 při 0 a 5 dpi. Data jsou průměrem ± SD ze tří biologických replikátů. Malá písmena označují významné rozdíly (jednosměrná ANOVA, P 5 0.01, soubor doplňkových dat 1). (B) EIJ1 téměř neovlivňuje akumulaci EDS1 v jádrech vyvolanou Pst DC3000 (AvrRps4). Frakce ochuzené o jádra a frakce obohacené o jádra byly extrahovány z 3-týden starých eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG a eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG transgenní rostliny ponořené do Pst DC3000 (OD600=0.1), Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) nebo falešně naočkované při 4 hpi a detekované pomocí anti-FLAG protilátka. Jako cytoplazmatické a nukleární markery byly použity PEPC a histon H3. Relativní intenzita proteinů z rostlin s falešným ošetřením byla nastavena na 1. M, falešný; P, Pst DC3000; R, Pst DC3000 (AvrRps4). (C) Infekce Pst DC3000 (AvrRps4) podporuje degradaci proteinu EIJ1. Celkové proteiny byly extrahovány z 3-týden starých rostlin eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA rostlin naočkovaných Pst DC3000 nebo Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) a detekovány pomocí anti-HA protilátky. Spodní panel ukazuje barvení Coomassie Brilliant Blue (CBB) jako kontrolu nanášení. Reprezentativní výsledky uvedené v (B) a (C) byly nezávisle opakovány ještě dvakrát a sondovány anti-ACTIN protilátkou jako kontrolou nanášení (doplňkový soubor 2). (D) Hypotetický model EIJ1 regulující bazální rezistenci rostlin závislou na EDS1-. Když jsou rostliny napadeny patogeny, EIJ1 se rychle uvolňuje z chloroplastu do cytoplazmy, kde interaguje s EDS1. Interakce EIJ1–EDS1 zabraňuje přesunu EDS1 z cytoplazmy do jádra, a tak omezuje jadernou rezistenci EDS1, což umožňuje modulaci imunitních reakcí zprostředkovaných EDS1-. Šipky a tupé čáry označují aktivaci a represi.

Diskuse

Aby se maximalizovalo přežití, rostliny vyvinuly přesný mechanismus pro optimalizaci růstu a pro obranu proti napadajícím patogenům, i když řada podrobností o těchto mechanismech zůstává nejasných. EDS1 zaujímá klíčové postavení v signální síti přirozené imunity rostliny, protože reguluje rezistenci vůči biotrofním a hemibiotrofním patogenům (Wiermer et al., 2005). V této studii jsme identifikovali gen EIJ1, který kóduje chaperonový protein DnaJ, a ukázali jsme, že EIJ1 reaguje na ranou patogenní infekci a hraje roli ve vrozené imunitě rostlin přímou interakcí s EDS1. Na základě těchto zjištění navrhujeme regulační model pro EIJ1 (obrázek 7D). Když jsou rostliny napadeny patogeny, EIJ1 se rychle uvolňuje z chloroplastu do cytoplazmy, kde interaguje s EDS1. Tato interakce EIJ1–EDS1 zabraňuje přesunu EDS1 z cytoplazmy do jádra, a to omezuje jadernou rezistenci EDS1, což umožňuje modulaci imunitních reakcí zprostředkovaných EDS{13}}, jako je indukce biosyntézy SA a exprese rezistence -příbuzné geny. Když rostliny trpí neustálými stimuly invazních patogenů, EIJ1 je postupně degradován, což vede ke zvýšené jaderné akumulaci EDS1 pro posílení rezistence. Tato zjištění ilustrují zásadní represivní roli EIJ1 během časné reakce hostitele na invazi patogenu, čímž vyplňují mezeru v našem chápání toho, jak je subcelulární lokalizace EDS1 regulována, aby udělovala rezistenci.

Sekvenční analýza odhalila, že EIJ1 je protein DnaJ. Genom Arabidopsis kóduje sedm různých klasických typů proteinů DnaJ (Pulido a Leister, 2018). Předchozí studie ukazují, že proteiny DnaJ hrají důležitou a odlišnou roli v imunitě rostlin. Například sója (Glycine max) GmHSP40 pozitivně reguluje buněčnou smrt a odolnost vůči chorobám (Liu a Whitham, 2013). Naproti tomu protein Os-DjA6 rýže (Oryza sativa L.) negativně reguluje vrozenou imunitu rostliny prostřednictvím ubikvitinace zprostředkované dráhy degradace proteazomu (Zhong et al., 2018). Efektor virulence Hopl1 specifický pro P. syringae, který obsahuje doménu J, je namířen do chloroplastu, kde interaguje s mechanismem reakce rostlin na stres (Jelenska et al., 2007). Tyto studie ukazují, že proteiny DnaJ hrají různé role v obranné reakci rostlin. Tsip1, protein DnaJ N. tabacum homologní s EIJ1, reguluje transkripční aktivaci genů zprostředkovanou Tsi{13}} v reakci na stres (Ham et al., 2006). Tsi1 kóduje transkripční faktor typu APETALA2 (AP2), který funguje jako důležitý regulátor v biotických i abiotických reakcích na stres u N. tabacum (Park et al., 2001). SA spouští relokalizaci Tsip1 z chloroplastu do cytoplazmy, což usnadňuje interakci mezi Tsip1 a Tsi1 a následný vstup komplexu Tsip1–Tsi1 do jádra pro transkripční aktivaci genů souvisejících se stresem (Ham et al., 2006) . Na rozdíl od Tsip1 byl EIJ1 v této studii za normálních podmínek lokalizován do chloroplastu a jádra. Ukázali jsme, že patogenní infekce spouští relokalizaci EIJ1 z chloroplastu do cytoplazmy a že interakce mezi EIJ1 a EDS1 v cytoplazmě inhibuje jadernou rezistenci zprostředkovanou EDS1-. V souladu s tímto zjištěním vykazoval mutant eij1 se ztrátou funkce silnější rezistenci vůči patogenům než divoký typ (Col-0). To potvrzuje, že EIJ1 hraje negativní roli v přirozené imunitě rostlin. Podle předchozích studií jsou koordinované jaderné a cytoplazmatické aktivity EDS1 pro rostliny nezbytné k dokončení přirozené imunitní odpovědi na patogeny (Garci´a et al., 2010; Heidrich et al., 2011). Jaderná lokalizace EDS1 je nutná pro transkripční přeprogramování rezistence indukované TNL, aby se vyvolaly obranné reakce rostlin související s SA a jiné (Wirthmueller et al., 2007). Cytoplazmatický EDS1 pool je také udržován během infekčního procesu pro úplnou rezistenci vůči patogenům (Garcı´a et al., 2010). Tato pozorování vyvolávají významné obavy ohledně toho, jak rostliny přesně regulují alokaci EDS1 mezi cytoplazmou a jádrem pro správné obranné reakce, když jsou napadeny infekcí patogenem. Zde ukazujeme, že přesná alokace EDS1 do různých subcelulárních kompartmentů je částečně regulována EIJ1 prostřednictvím interakce protein-protein. Mutace se ztrátou funkce EIJ1 výrazně podpořila přenos EDS1 do jádra (obrázky 5, D a 7, B), což vedlo ke zvýšené odolnosti vůči chorobám.

Protože EIJ1 byl rychle indukován v rané fázi patogenní infekce a následně degradován během vývoje onemocnění, spekulujeme, že EIJ1 je důležitým negativním regulátorem imunity, který umožňuje rostlinám zdokonalit jejich optimální obranu. Represe aktivity EDS1 zprostředkovaná EIJ1- by mohla zabránit vyvolání zbytečných imunitních reakcí na krátkodobou stimulaci, jako je občasný útok patogenních bakterií. Alternativně mohou patogenní bakterie manipulovat s imunitou hostitele spuštěním disociace EIJ1 z chloroplastu, pravděpodobně sekrecí virulentních efektorů. Nemohli jsme vyloučit možnost, že EIJ1 vykonává v chloroplastu neznámou funkci. Jak víme, SA, rostlinný hormon a signální molekula zapojená do rezistence vůči biotrofním patogenům, je biosyntetizován primárně v chloroplastu a poté exportován do cytoplazmy pomocí EDS5, multidrogového a toxinového transportéru (Serrano et al., 2013). EIJ1 je pravděpodobně negativní regulátor akumulace SA, protože down-reguloval expresi SA biosyntetického genu ICS1 po inokulaci patogenu (obrázek 4E). Kromě transkripční represe zprostředkované EIJ1- prostřednictvím interakce s EDS1 je možné, že EIJ1 také hraje přímou roli v biosyntéze SA nebo transportu SA z chloroplastu neidentifikovaným způsobem. Nebylo by překvapivé, kdyby se v budoucí studii zjistilo, že EIJ1 a proces biosyntézy SA jsou propojeny. Zajímavé je, že EIJ1 byl také lokalizován do jádra. Ačkoli EIJ1 neinteragoval s EDS1 v jádře, pravděpodobně kvůli nedostatku základních kofaktorů nebo modifikací, funkce EIJ1 lokalizovaného v jádře si zaslouží další zkoumání.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Patogenní bakterie produkují intracelulární efektory, které podvrací PTI hostitele zacílením na proteiny rezistence vůči patogenům, jako jsou PRR, zatímco rostlinné cytoplazmatické receptory podobné NOD snímají tyto efektory, aby iniciovaly ETI (Dou a Zhou, 2012; Khan et al., 2016). Předchozí studie a naše výsledky ukázaly, že avirulentní Pst DC3000 (AvrRps4) podporuje transport cytoplazmatického EDS1 do jádra (Garci´a et al., 2010). Naše výsledky navíc neukázaly žádný významný rozdíl v jaderné akumulaci EDS1 vyvolané Pst DC3000 (AvrRps4) a následné rezistenci vůči patogenům mezi mutantními rostlinami Col-0 a eij{12}} (obrázek 7, A a B) . Navíc rezistence vykazovaná mutantou eij1-1 byla srovnatelná s rezistencí vykazovanou rostlinami Col-0 naočkovanými kmenem Pst DC3000 hrcC s defektem sekrečního systému typu III (doplňkový obrázek 12). Kromě toho byla akumulace EIJ1 výrazně nižší v rostlinách naočkovaných avirulentním Pst DC3000 (AvrRps4) než v rostlinách naočkovaných virulentním Pst DC3000 (obrázek 7C), což naznačuje, že EIJ1 je základním regulátorem imunitní reakce spouštěné efektorem virulence v hostitelských buňkách. Protože rostliny eij{27}} naočkované Pst DC3000- napodobovaly fenotyp rezistence rostlin Col-0 naočkovaných Pst DC3000 (AvrRps4) (obrázky 3, F, G, 4, C, D a 7, A), EIJ1 může fungovat jako bariéra, která zabrání indukci ETI virulentními kmeny. Na závěr jsme identifikovali EIJ1, chaperonový protein DnaJ, a ukázali jsme, že se podílí na časné imunitní odpovědi na rostlinné patogeny. Interakce mezi EIJ1 a EDS1 potlačuje jaderné obchodování EDS1, pravděpodobně buď proto, aby se zabránilo krátkodobé stimulaci zbytečnými imunitními reakcemi rostlin, aby se usnadnila patogenní invaze manipulačním mechanismem, nebo obojí. Bez ohledu na základní mechanismus by alela EIJ1 mohla být použita jako účinný potenciální cíl pro modifikaci vrozené imunity rostlin při šlechtění odolném vůči chorobám. Protože EIJ1 neovlivňuje normální růst rostlin, útlum funkce EIJ1 prostřednictvím úpravy genomu může výrazně zvýšit úroveň odolnosti plodin vůči chorobám s malým vlivem na růst.

Reference

Alvarez, ME, Pennell, RI, Meijer, PJ, Ishikawa, A, Dixon, RA, Lamb, C (1998) Meziprodukty reaktivního kyslíku zprostředkovávají systémovou signální síť při vytváření imunity rostlin. Cell 92: 773–784

An, C, Mou, Z (2011) Kyselina salicylová a její funkce v imunitě rostlin. J Integr Plant Biol 53: 412–428

Armbruster, U, Carrillo, LR, Venema, K, Pavlovic, L, Schmidtmann, E, Kornfeld, A, Jahns, P, Berry, JA, Kramer, DM, Jonikas, MC (2014) Iontový antiport urychluje fotosyntetickou aklimatizaci při kolísavém světle prostředí. Nat Commun 5: 5439

Bartsch, M, Gobbato, E, Bednarek, P, Debey, S, Schultze, JL, Bautor, J, Parker, JE (2006) signalizace ZVÝŠENÉ NÁCHYLOSTI NA ONEMOCNĚNÍ nezávislá na kyselině salicylové1 v imunitě Arabidopsis a buněčné smrti je regulována monooxygenázou FMO1 a Nudix hydroláza NUDT7. Plant Cell 18: 1038–1051

Ben Rejeb, K, Lefebvre-De Vos, D, Le Disquet, I, Leprince, AS, Bordenave, M, Maldiney, R, Jdey, A, Abdelly, C, Savoure´, A (2015) Peroxid vodíku produkovaný oxidázami NADPH zvyšuje akumulaci prolinu během stresu ze soli nebo mannitolu u Arabidopsis thaliana. Nový fytol 208: 1138–1148

Bukau, B, Weissman, J, Horwich, A (2006) Molecular chaperones and protein quality control. Buňka 125: 443–451

Caplan, J, Padmanabhan, M, Dinesh-Kumar, SP (2008) Plant NB-LRR imunitní receptory: od rozpoznání k transkripčnímu přeprogramování. Cell Host Microbe 3: 126–135 10.1016/j.chom.2008.02.010

Dodds, PN, Rathjen, JP (2010) Imunita rostlin: směrem k integrovanému pohledu na interakce rostlina-patogen. Nat Rev Genet 11: 539–548

Dou, D, Zhou, JM (2012) Fytopatogenní efektory podvracející hostitelskou imunitu: různí nepřátelé, podobné bojiště. Cell Host Microbe 12: 484–495

Du, Y, Zhao, J, Chen, T, Liu, Q, Zhang, H, Wang, Y, Hong, Y, Xiao, F, Zhang, L, Shen, Q (2013) NbMIP1 proteiny J-domény typu I jsou potřebné jak pro infekci virem tabákové mozaiky, tak pro vrozenou imunitu rostlin. PLoS Pathog 9: e1003659

Fan, H, Hu, Y, Tudor, M, Ma, H (1997) Specifické interakce mezi K doménami AG a AGL, členy rodiny domén MADS vazebných proteinů DNA. Závod J 12: 999–1010

Feys, BJ, Moisan, LJ, Newman, MA, Parker, JE (2001) Přímá interakce mezi signálními proteiny rezistence k onemocnění Arabidopsis, EDS1 a PAD4. EMBO J 20: 5400–5411

Garcı´a, AV, Blanvillain-Baufume´, S, Huibers, RP, Wiermer, M, Li, G, Gobbato, E, Rietz, S, Parker, JE (2010) Vyvážené jaderné a cytoplazmatické aktivity EDS1 jsou vyžadovány kompletní vrozená imunitní odpověď rostliny. PLoS Pathog 6: e1000970

Gassmann, W, Hinsch, ME, Staskawicz, BJ (1999) Gen bakteriální rezistence Arabidopsis RPS4 je členem rodiny genů rezistence vůči chorobám TIR-NBS-LRR. Závod J 20: 265–277

Gloggnitzer, J, Akimcheva, S, Srinivasan, A, Kusenda, B, Riehs, N, Stampfl, H, Bautor, J, Dekrout, B, Jonak, C, Jime'nez-Go'mez, JM (2014) Nesmysl- zprostředkovaný rozpad mRNA moduluje hladiny imunitních receptorů pro regulaci antibakteriální obrany rostlin. Cell Host Microbe 16: 376–390

Ham, BK, Park, JM, Lee, SB, Kim, MJ, Lee, IJ, Kim, KJ, Kwon, CS, Paek, KH (2006) Tabák Tsip1, Zn prstový protein typu DnaJ, je získáván a potencuje Tsi1-zprostředkovaná aktivace transkripce. Rostlinná buňka 18: 2005–2020

Heidrich, K, Blanvillain-Baufume´, S, Parker, JE (2012) Molekulární a prostorová omezení signalizace receptoru NB-LRR. Curr Opin Plant Biol 15: 385–391

Heidrich, K, Wirthmueller, L, Tasset, C, Pouzet, C, Deslandes, L, Parker, JE (2011) Arabidopsis EDS1 spojuje rozpoznávání efektorů patogenů s imunitními reakcemi specifickými pro buněčný kompartment. Science 334: 1401–1404

Hu, Y, Zhou, L, Huang, M, He, X, Yang, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X (2018) Gibbereliny hrají zásadní roli v pozdní embryogenezi Arabidopsis. Nat Plants 4: 289–298

Huang, M, Hu, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X. (2015) Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 zprostředkovává postembryonální vývoj prostřednictvím interakce s FAKTOREM INTERAKČNÍHO FYTOCHROMU4. Plant Cell 27: 3099–3111

Jelenska, J, Yao, N, Vinatzer, BA, Wright, CM, Brodsky, JL, Greenberg, JT (2007) Efektor virulence domény AJ Pseudomonas syringae remodeluje chloroplasty hostitele a potlačuje obranyschopnost. Curr Biol 17: 499–508

Jones, J, Dangl, J (2006) Imunitní systém rostlin. Příroda 444: 323–329

Khan, M, Subramaniam, R, Desveaux, D (2016) Strážců, návnad, návnad a pastí: vnímání patogenů v rostlinách pomocí efektorových senzorů typu III. Curr Opin Microbiol 29: 49–55

Kinkema, M, Fan, W, Dong, X (2000) Nukleární lokalizace NPR1 je nutná pro aktivaci exprese PR genu. Plant Cell 12: 2339–2350

Koch, E, Slusarenko, A (1990) Arabidopsis je citlivá na infekci plísní plísní. Rostlinná buňka 2: 437–445

Lam, E, Kato, N, Lawton, M (2001) Programovaná buněčná smrt, mitochondrie a hypersenzitivní reakce rostlin. Příroda 411: 848–853

Lee, DW, Kim, JK, Lee, S, Choi, S, Kim, S, Hwang, I (2008) Plastidové tranzitní peptidy nukleárně kódované Arabidopsis obsahují vícenásobné sekvenční podskupiny s výraznými sekvenčními motivy zacílenými na chloroplasty. Plant Cell 20: 1603–1622