Echinakosid moduluje cestu CGAS-STING ke zmírnění zánětlivého poškození vyvolaného LPS v alveolárních epiteliálních buňkách (A549)

 

autoři:Jianfeng Luo; Tao Bai
Přidružení:Oddělení 1, Oddělení infekčních nemocí, nemocnice Wuhan Jinyintan, Wuhan 430000, Hubei, Čína

 

Klíčové věci (pro čtenáře výzkumu a vývoje s přírodními složkami a doplňky)

Expozice LPS poškodila alveolární epiteliální buňky A549snížení proliferačních markerů a zvýšení apoptózy a zánětlivých cytokinů.

Echinakosid (ECH) vykazoval na dávce závislou ochranu: zlepšená životaschopnost/proliferace buněk a snížená apoptóza a zánětlivé mediátory.

Mechanicky byly výhody spojeny sdown-regulace signalizační osy cGAS–STING–TBK1–IRF3na úrovni mRNA i proteinu.

Aktivátor dráhy cGAS–STING (RocA) oslabil/antagonizoval ochranné účinky ECHpodporující zapojení dráhy.

Význam pro botanický vývoj: Cistanche(肉苁蓉) je široce uznávána jako rostlina bohatá na echinakosid, což z ní činí praktický materiál, který je třeba vzít v úvahu pro výzkum a vývoj produktů – přičemž je třeba mít na paměti, že tato studie jein vitroa používá purifikovaný ECH.

Tabulka 1. Účinky různých koncentrací ECH a RocA na buňky A549 (OD570_{570}570​, xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Koncentrace (μmol/L)	ECH (OD570_{570}570​)	RocA (OD570_{570}570​)
0	0.45 ± 0.03	0.43 ± 0.04
3	0.42 ± 0.05	0.45 ± 0.06
6	0.43 ± 0.04	0.42 ± 0.05
9	0.46 ± 0.06	0.46 ± 0.07
12	0.44 ± 0.05	0.44 ± 0.05
24	0.47 ± 0.06	0.20 ± 0.03¹

Hodnota F/P:ECH: 0,857 / 0,521; RocA: 22 050 /<0.001
Poznámka:Ve srovnání s 0 μmol/L: ¹ P<0.05P<0.05P<0.05.

 

Abstrakt (přepsaný v angličtině, bod po bodu)

Objektivní

Vyhodnotit zdaechinakosid (ECH)chrání lidské alveolární epiteliální buňky předzánětlivé poškození vyvolané lipopolysacharidem (LPS).a zda tato ochrana souvisí s regulacícGAS–STINGsignální dráha.

Metody (design studie)

Model buňky:Lidská alveolární epiteliální buněčná linieA549.

Testování cytotoxicity/životaschopnosti:MTT test k testování ECH a aktivátoru dráhy cGAS–STING (RocA) pro toxicitu.

Seskupení:

Kontrola (standardní kultura)

LPS (30 mg/l)

LPS + ECH nízká/střední/vysoká dávka (9, 12, 24 μmol/l)

LPS + ECH (24 μmol/L) + RocA (12 nmol/l)

Koncové body:

Proliferace:Barvení EdUaPCNA(Western blot)

Apoptóza:Průtoková cytometrie (Annexin V-FITC/PI); Bax/Bc-2(Western blot)

Zánět:TNF-, IL-6v supernatantu (ELISA)

Údaje o cestě:cGAS, STING mRNA(qRT-PCR);cGAS, STING, TBK1, IRF3 proteiny(Western blot)

 

Tabulka 2. Srovnání míry EdU pozitivní, exprese PCNA, rychlosti apoptózy, exprese Bax/Bcl-2 a hladin TNF-/IL-6 v buňkách A549 mezi skupinami (xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Skupina	EdU-pozitivní sazba	PCNA/GAPDH	Míra apoptózy (%)	Bax/GAPDH	Bcl-2/GAPDH	TNF- (ug/ml)	IL-6 (ng/ml)
Řízení	57.38 ± 3.24	1.67 ± 0.15	4.38 ± 1.09	0.37 ± 0.06	1.63 ± 0.12	4.65 ± 1.08	18.47 ± 1.19
LPS	27.51 ± 1.68¹	0.49 ± 0.08¹	36.75 ± 2.31¹	1.59 ± 0.13¹	0.28 ± 0.06¹	30.71 ± 1.68¹	49.23 ± 2.75¹
ECH-L	33.72 ± 1.96²	0.86 ± 0.10²	29.16 ± 2.27²	1.24 ± 0.11²	0.67 ± 0.08²	22.58 ± 1.52²	41.78 ± 2.46²
ECH-M	40.59 ± 2.40²,³	1.27 ± 0.13²,³	21.93 ± 1.64²,³	0.85 ± 0.09²,³	1.08 ± 0.10²,³	15.83 ± 1.16²,³	32.64 ± 2.18²,³
ECH-H	48.21 ± 2.57²,³,⁴	1.58 ± 0.14²,³,⁴	13.86 ± 1.45²,³,⁴	0.49 ± 0.08²,³,⁴	1.35 ± 0.11²,³,⁴	7.91 ± 1.13²,³,⁴	23.59 ± 1.57²,³,⁴
RocA	35.79 ± 2.38⁵	0.92 ± 0.11⁵	25.74 ± 1.69⁵	0.93 ± 0.10⁵	0.74 ± 0.09⁵	19.76 ± 1.20⁵	36.78 ± 2.61⁵

F hodnota: 118.927; 85.600; 245.724; 131.552; 159.598; 321.852; 161.353
P hodnota:vše<0.001

Poznámky (vícenásobné srovnání):
Ve srovnání sŘízení: ¹ P<0.05P<0.05P<0.05
Ve srovnání sLPS: ² P<0.05P<0.05P<0.05
Ve srovnání sECH-L: ³ P<0.05P<0.05P<0.05
Ve srovnání sECH-M: ⁴ P<0.05P<0.05P<0.05
Ve srovnání sECH-H: ⁵ P<0.05P<0.05P<0.05

 

 

Výsledky (hlavní zjištění)

Ve srovnání s Control,LPS:

Sníženýkladná míra EdU,PCNAaBcl‑2

Zvýšenýrychlost apoptózy,TNF-, IL-6

UpregulovanýcGAS a STING na úrovni mRNA

ZvýšenýProteiny dráhy Bax a cGAS–STING (cGAS, STING, TBK1, IRF3)
(Všechny statisticky významné, P<0.05P<0.05P<0.05.)

Ve srovnání se samotným LPS,ECH (9→12→24 μmol/L)v závislosti na dávce:

Obnovená proliferace(vyšší míra pozitivních EdU a PCNA)

Snížená apoptóza(nižší rychlost apoptózy, nižší Bax, vyšší Bcl‑2)

Potlačený zánět(nižší TNF- a IL-6)

Downregulovaná signalizace cGAS–STING(nižší cGAS/STING mRNA; nižší cGAS, STING, TBK1, IRF3 proteiny)
(Závisí na dávce, P<0.05P<0.05P<0.05.)

RocA kontrovalOchrana ECH v podmínkách zranění LPS (P<0.05P<0.05P<0.05), consistent with cGAS–STING pathway involvement.

Závěr

ECHzvýšená životaschopnost a proliferační aktivitaalveolárních epiteliálních buněk infikovaných LPS apotlačuje apoptózu a zánětlivé reakce. Ochranný mechanismus pravděpodobně souvisí sinhibice/blokáda přeaktivované signalizace cGAS–STING.

 

Pozadí (proč na tom záleží)

U pacientů vystavených nebo infikovaných LPS (hlavní gramnegativní bakteriální složka),akutní poškození plic (ALI)a její těžkou formouARDSjsou klíčovými faktory nemocnosti a úmrtnosti. Charakteristická patologie zahrnuje difúzní poraněníalveolární epitelakapilární endotelcož vede k úniku bariéry a plicnímu edému.

Navzdory pokroku v podpůrné péči,účinné cílené terapie zůstávají omezené, takže identifikace nových kandidátů na drogy a cílů je důležitá.

Echinakosid (ECH)je fenylethanoidní glykosid s uváděnými aktivitami včetně antioxidačních, protizánětlivých, cytoprotektivních a antiapoptotických účinků.
Pro vývojáře přírodních produktů:cistanche (肉苁蓉)je tradiční botanická rostlina, která je často zdůrazňovánabohaté na echinacosid, což z něj činí praktický zdrojový materiál při zkoumání formulací orientovaných na ECH – a zároveň vyžaduje pečlivou standardizaci a translační práci nad rámec buněčných testů.

ThecGAS–STING dráhaje cytosolická osa snímání DNA, která podporuje produkci interferonu typu I a zánětlivých mediátorů. Důkazy tomu nasvědčujínadměrná aktivacecGAS–STING přispívá k zánětlivé a autoimunitní patologii a že potlačení této nadměrné aktivace může pomoci zmírnit zánětlivé poškození plic.

 

Materiály a metody (shrnutí vhodné pro výzkum a vývoj)

Buněčná linie a kultura

Buňky A549 byly kultivovány vDMEM s nízkým obsahem glukózys10 % FBSa1% antibiotikase středními změnami každé 2 dny. Experimenty byly prováděny v~80–90% soutok.

Činidla (vysoká hladina)

ECH(informace o prodejci jsou uvedeny v původním dokumentu)

LPS

RocA(zde se používá jako aAktivátor dráhy cGAS–STING)

Soupravy testů: MTT, EdU, souprava pro apoptózu (Annexin V‑FITC/PI), soupravy ELISA pro TNF‑ a IL‑6

Molekulární testy: extrakce RNA, reverzní transkripce, qRT‑PCR reagencie; protilátky pro Western blot (PCNA, Bax, Bcl‑2, cGAS, STING, TBK1, IRF3, GAPDH)

Výběr dávky (screening životaschopnosti)

ECH (0–24 μmol/L)ukázalžádná významná cytotoxicitav buňkách A549 a proto9/12/24 μmol/Lbyly použity.

RocAuvnitř byl netoxický0–12 nmol/lzatímco vyšší koncentrace snížila životaschopnost;12 nmol/lbyl vybrán.

Indukce a seskupování poranění LPS

LPS poškození bylo indukováno s30 mg/l LPS.

Léčebná ramena byla popsána v abstraktu (kontrola; LPS; LPS+ECH nízký/střední/vysoký; LPS+ECH vysoký+RocA).

Měření výsledků

Proliferace:EdU-pozitivní buňky fluorescenční mikroskopií; PCNA metodou Western blot.

Apoptóza:průtoková cytometrie (Annexin V-FITC/PI); Hladiny proteinů Bax a Bcl‑2.

Mediátory zánětu:TNF- a IL-6 v supernatantu kultury pomocí ELISA.

Výraz cesty:cGAS a STING mRNA pomocí qRT‑PCR s použitím GAPDH jako vnitřní kontroly; proteiny (cGAS, STING, TBK1, IRF3) metodou Western blot.

Statistika:ANOVA s SNK-q post-hoc testováním (GraphPad Prism 9.0), významnost nastavena na P<0.05P<0.05P<0.05.

 

Výsledky (co se změnilo s LPS, ECH a RocA)

1) Okno životaschopnosti/toxicity buněk

ECH byla dobře tolerována až do testovaného rozsahu používaného pro studie mechanismu.

RocA vyžadoval opatrné dávkování; byla zvolena netoxická pracovní koncentrace.

Obrázek 1. Proliferace buněk A549 v každé skupině (barvení EDU, × 200)

 

2) Proliferace byla potlačena LPS a obnovena pomocí ECH

LPS sníženoZačlenění EdUaPCNAexpresi, což ukazuje na sníženou proliferační aktivitu.

ECH zvýšila míru pozitivních EdU a PCNAzpůsobem závislým na dávce.

Přidání RocA snížilo tyto zisky, což naznačuje, že cesta přispívá k efektu ECH pro přežití/proliferaci.

3) Apoptóza se zvýšila s LPS a byla inhibována ECH

LPS zvýšil rychlost apoptózy, zvýšil seBaxa snížil seBcl‑2.

ECH zvrátil tyto změny v závislosti na dávce (nižší rychlost apoptózy a Bax, vyšší Bcl‑2).

RocA posunul fenotyp zpět směrem k apoptóze a oslabil ECH ochranu.

Obrázek 2. Western blot analýza exprese PCNA, Bax a Bcl-2 v každé skupině

 

4) Zánětlivé cytokiny (TNF‑, IL‑6) byly redukovány ECH

LPS zvýšil TNF- a IL-6 v supernatantech.

ECH snižovala oba cytokiny v závislosti na dávce.

RocA je zvýšil ve srovnání se samotnou vysokou dávkou ECH, což je v souladu s reaktivací dráhy zesilující zánět.

5) cGAS a transkripce STING byla indukována LPS a potlačena ECH

LPS se zvýšilcGAS a STING mRNA.

ECH snížila jejich expresi (závislá na dávce).

RocA zvýšil expresi ve srovnání s vysokou dávkou ECH.

Obrázek 3. Srovnání apoptózy buněk A549 v každé skupině

 

6) Proteiny dráhy cGAS–STING byly downregulovány pomocí ECH

LPS se zvýšilcGAS, STING, TBK1 a IRF3proteinová exprese.

ECH snižovala tyto proteiny v závislosti na dávce.

RocA zvýšil hladiny proteinu dráhy oproti samotné vysoké dávce ECH.

 

Tabulka 3. Srovnání exprese proteinu cGAS/STING mRNA a cGAS–STING dráhy v buňkách A549 mezi skupinami (xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Skupina	cGAS mRNA	STING mRNA	cGAS/GAPDH	STING/GAPDH	TBK1/GAPDH	IRF3/GAPDH
Řízení	1.00 ± 0.12	1.00 ± 0.11	0.32 ± 0.07	0.36 ± 0.08	0.29 ± 0.05	0.25 ± 0.06
LPS	2.15 ± 0.16¹	2.28 ± 0.17¹	1.68 ± 0.13¹	1.85 ± 0.16¹	1.57 ± 0.13¹	1.62 ± 0.14¹
ECH-L	1.74 ± 0.13²	1.83 ± 0.14²	1.34 ± 0.12²	1.42 ± 0.13²	1.24 ± 0.11²	1.23 ± 0.12²
ECH-M	1.36 ± 0.11²,³	1.31 ± 0.12²,³	0.82 ± 0.09²,³	1.03 ± 0.11²,³	0.86 ± 0.09²,³	0.78 ± 0.09²,³
ECH-H	0.73 ± 0.09²,³,⁴	0.62 ± 0.08²,³,⁴	0.45 ± 0.08²,³,⁴	0.57 ± 0.09²,³,⁴	0.47 ± 0.08²,³,⁴	0.38 ± 0.07²,³,⁴
RocA	1.58 ± 0.12⁵	1.69 ± 0.15⁵	1.17 ± 0.11⁵	1.28 ± 0.14⁵	1.12 ± 0.10⁵	0.97 ± 0.10⁵

Hodnoty F/P:

cGAS mRNA: 103,612 /<0.001

STING mRNA: 124,857 /<0.001

cGAS/GAPDH: 160,066 /<0.001

STING/GAPDH: 124,141 /<0.001

TBK1/GAPDH: 150,139 /<0.001

IRF3/GAPDH: 158,576 /<0.001

 

Obrázek 4. Exprese proteinu dráhy cGAS-STING v buňkách každé skupiny

 

Diskuse (výklad pro čtenáře produktů a mechanismů)

LPS se běžně používá k modelování zánětlivého poškození plic. Zde LPS přímo poškodil proliferační kapacitu alveolárních epiteliálních buněk a podpořil apoptózu, doprovázenou zvýšenými TNF- a IL-6-dva cytokiny široce spojenými se zánětlivým poškozením plic.

ECH jednal jako acytoprotektivní a protizánětlivé činidlov tomto prostředí in-vitro, v souladu s předchozími zprávami, že ECH může zmírnit oxidační stres, zánět a apoptózu v kontextu poranění plic.

Osa cGAS-STING (a downstream TBK1/IRF3) se zdá být mechanistickým uzlem:ECH snížila markery dráhy cGAS–STINGaRocA otupila výhody ECH, což podporuje hypotézu, že ECH chrání buňky alespoň částečně tímblokování nadměrné aktivace cGAS–STING.

Co to naznačuje pro přirozený botanický vývoj (kontext Cistanche)

Protožecistanche (肉苁蓉)je známý provysoký obsah echinakosiduje logickým botanickým kandidátem při zkoumání formulací zaměřených na ECH zaměřené na zánětlivou rovnováhu a témata ochrany epitelu.

Převedení tohoto na doplňky však vyžaduje opatrnost: tato práce jezaložené na buněčné linii, používáZranění LPSapurifikovaný ECHa nestanovuje lidskou účinnost, perorální biologickou dostupnost, metabolismus nebo klinicky relevantní dávkování.

Omezení a další kroky (jak naznačují autoři)

Zjištění je třeba ověřit vin vivo modely ALI/ARDSpro potvrzení účinnosti a mechanické vazby na cGAS-STING za fyziologických podmínek.

Bylo by zapotřebí další práce, aby bylo možné zmapovat upstream spouštěče a potvrdit, zda jsou účinky přímou inhibicí dráhy oproti sekundárnímu snížení buněčného stresu.

 

Reference (uvedené kompletní, jak je uvedeno)

Li N, Liu B, Xiong R a kol. Deficit HDAC3 chrání před akutním poškozením plic udržováním integrity epiteliální bariéry prostřednictvím zachování kontroly mitochondriální kvality.Redox Biol, 2023;63(1):102746-61.

Long ME, Mallampalli RK, Horowitz JC. Patogeneze pneumonie a akutního poškození plic.Clin Sci (Londýn), 2022;136(10):747-69.

Mokrý AD. Akutní poškození plic – od patofyziologie po léčbu.Physiol Res, 2020; 69 (Suppl 3): S353-66.

Wang W, Jiang S, Zhao Y a kol. Echinakosid: slibné aktivní přírodní produkty a farmakologické látky.Pharmacol Res, 2023;197(1):106951-66.

Pan Y, Liu Y. Echinacosid zmírňuje přestavbu dýchacích cest a zánět u neonatálního myšího modelu astmatu vyvolaného ovalbuminem modulací dráhy SIRT1-NF-κB.Allergol Immunopathol (Madr), 2023;51(4):71-7.

Cui YH, Li KF, Jin B a kol. Echinakosid inhibuje bleomycinem indukované poškození plicních epiteliálních buněk a zánětlivou reakci.Čínský žurnál patofyziologie, 2021;37(11):2024-30.

Xie W, Deng L, Lin M a kol. Sirtuin1 zprostředkovává ochranné účinky echinakosidu proti akutnímu poškození plic vyvolanému sepsí prostřednictvím regulace osy NOX4-Nrf2.Antioxidanty (Basilej), 2023;12(11):1925-45.

Alonso Paiva IM, Santos AR, Brito CB, a kol. Role cGAS/STING dráhy při kontroleBrucella abortusinfekce získaná dýchacími cestami.Front Immunol, 2023;14:1116811.

Zhao J, Zhen N, Zhou Q a kol. NET podporují zánětlivé poškození aktivací dráhy cGAS-STING při akutním poškození plic.Int J Mol Sci, 2023;24(6):5125-45.

Wu X, Jiang Y, Li R a kol. Ficolin B secernovaný alveolárními makrofágovými exozomy zhoršuje bleomycinem indukované poškození plic prostřednictvím ferroptózy prostřednictvím signální dráhy cGAS-STING.Cell Death Dis, 2023;14(8):577-92.

Zhang SW, Cheng SL, Xing QF. Kyselina pachymová zmírňuje poškození epiteliálních buněk tlustého střeva u krys s ulcerózní kolitidou inhibicí signální dráhy cGAS-STING.Journal of Immunology(Čína), 2023;39(8):672-80.

Zhang JJ, Li YY, Qin J. lncRNA LUCAT1 se zaměřuje na miR-203a-3p, aby ovlivnil apoptózu a zánětlivou odpověď v LPS-indukovaných alveolárních epiteliálních buňkách typu II.Journal of Immunology(Čína), 2023; 39 (8): 689-95.

Li J, Deng SH, Li J a kol. Obacunon zmírňuje ferroptózu během akutního poškození plic vyvolaného lipopolysacharidy tím, že upreguluje antioxidační reakce závislé na Nrf2.Cell Mol Biol Lett, 2022;27(1):29-48.

Hong H, Lou S, Zheng F a kol. Hydnokarpin D zmírňuje akutní poškození plic vyvolané lipopolysacharidy prostřednictvím MAPK/NF-κB a Keap1/Nrf2/HO-1 dráhy.Fytomedicína, 2022;101(1):154143-50.

Sasaki M, Kishimoto M, Itakura Y a kol. Mezifázová kultura vzduch-kapalina propůjčuje alveolárním epiteliálním buňkám A549 citlivost na SARS-CoV-2.Biochem Biophys Res Commun, 2021;577:146-51.

Wang Y, Fan Y, Huang Y a kol. TRIM28 reguluje vstup buněk SARS-CoV-2 cílením na ACE2.Cell Signal, 2021;85:110064.

Yang X, Ma L. Post-léčba propofolem inhibuje zánětlivou odpověď v LPS-indukovaných alveolárních epiteliálních buňkách typu II.Exp Ther Med, 2022;23(4):249.

Duan XY, Sun Y, Zhao ZF a kol. Baicalin zeslabuje LPS-indukované poškození alveolárních epiteliálních buněk typu II A549 zeslabením signální dráhy FSTL1 prostřednictvím zvýšení exprese miR-200b-3p.Innate Immun, 2021;27(4):294-312.

Lei X, Liu X, Yu J, et al. 3-methyladenin zmírňuje akutní poškození plic inhibicí oxidačního poškození a apoptózy.Heliyon, 2024;10(13):e33996.

Li M, Song J, Tang X a kol. Kritická role PAI-1 při akutním poškození plic vyvolaném lipopolysacharidy.Adv Med Sci, 2024;69(1):90-102.

Jiang T, Yuan D, Wang R a kol. Echinakosid, slibný inhibitor sortázy A, kombinovaný s vankomycinem proti myším modelům pneumonie vyvolané MRSA.Med Microbiol Immunol, 2023;212(6):421-35.

Yang Y, Liu Y, Wang Y a kol. Regulace SIRT1 a jeho role při zánětu.Front Immunol, 2022;13(1):831168-83.

Jiang Z, Jiang Y, Fan J a kol. Inhibice cGAS zlepšuje akutní poškození plic vyvolané nanočásticemi oxidu zinečnatého.Toxicol Lett, 2023;373(1):62-75.

Domizio JD, Gulen MF, Saidoune F, et al. The cGAS-STING pathway drives type I IFN immunopathology in COVID-19. Příroda, 2022;603(7899):145-51.

Messaoud-nacer Y, Culerier E, Rose S a kol. STING agonista diABZI indukuje PANoptózu a syndrom akutní respirační tísně zprostředkovaný DNA (ARDS).Cell Death Dis, 2022;13(3):269-85.

Wen J, Qin S, Li Y a kol. Flavonoidy získané z lékořice potlačují LPS-indukované akutní poškození plic u myší inhibicí signální dráhy cGAS-STING.Food Chem Toxicol, 2023;175(1):113732.

 

O výrobci extraktů Cistanche (肉苁蓉) (pro vývojáře produktů)

Na bázi Cistanchevývoj přírodních ingrediencí – zejména standardizované extrakty umístěné kolemechinakosid- informace o pozadí a schopnostech výrobce naleznete zde:
https://www.xjcistanche.com/about-us