Echinakosid brzdí maligní progresi buněk MCF-7 rakoviny prsu modulací přenosu signálu AKR1B10/ERK

Abstrakt: Tato studie analyzuje dopadechinakosid(ECH) při proliferaci, metastázování a rezistenci na adriamycin (ADR).rakovina prsu(BC) MCF {{0}} buňky prostřednictvím modulace aldo-ketoreduktázové rodiny 1 člen 10 (AKR1B10)/extracelulárním signálem regulované kinázové (ERK) dráhy. Nejprve byla potvrzena chemická struktura ECH. Buňky MCF-7 byly ošetřeny různými koncentracemi (0, 10, 20, 40 ug·mL-1) ECH po dobu 48 hodin. Western blotting byl použit k analýze exprese proteinů spojených s dráhou AKR1B10/ERK a testu soupravy pro počítání buněk-8 (CCK{18}}) ke stanovení životaschopnosti buněk. Buňky MCF-7 byly shromážděny a klasifikovány do kontrolní skupiny, skupiny ECH, skupiny ECH plus Ov-NC a skupiny ECH plus OvAKR1B10. Poté byl použit Western blotting k analýze exprese proteinů spojených s dráhou AKR1B10/ERK. Ke zkoumání buněčné proliferace byly použity testy CCK-8 a 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU). Buněčná migrace byla hodnocena testem škrábání, testem mezi jamkami a Western blotem. Nakonec byly buňky MCF-7 ošetřeny ADR po dobu 48 hodin, aby se vyvolala odolnost vůči ADR. Životaschopnost buněk byla testována CCK-8 testem a buněčná apoptóza byla odhadnuta na základě termináldeoxynukleoitidyltransferázou zprostředkovaného nick end značení (TUNEL) a Western blotting. Na základě Protein Data Bank (PDB) a molekulárního dokování byla hodnocena vazebná afinita ECH k AKR1B10. Různé dávky ECH snižovaly expresi proteinů spojených s dráhou AKR1B10/ERK způsobem závislým na dávce a snižovaly životaschopnost buněk ve srovnání s kontrolní skupinou. Ve srovnání s kontrolní skupinou blokovalo 40 ug·mL-1 ECH dráhu AKR1B10/ERK v buňkách MCF-7 a inhibovalo proliferaci, metastázy a odolnost buněk vůči ADR. Ve srovnání se skupinou ECH plus Ov-NC skupina ECH plus Ov-AKR1B10 vykázala obnovení některých biologických chování buněk MCF-7. ECH se zaměřil také na AKR1B10. ECH může inhibovat proliferaci, metastázy a rezistenci BC buněk na ADR blokováním dráhy AKR1B10/ERK.

klíčová slova:echinakosid; signalizace AKR1B10/ERK; rakovina prsu; rezistence na adriamycin

Karcinom prsu (BC) je zdaleka nejčastějším ženským zhoubným nádorem, s mediánem věku diagnózy kolem 60 let [1]. Podíl nových případů BC v Číně představuje 12,2 procenta celosvětového podílu a podíl úmrtí na BC ve světě tvoří 9,6 procenta [2]. Genetické a environmentální faktory, jako je strava s vysokým obsahem tuků, příjem alkoholu a nedostatečná fyzická aktivita, jsou rizikovými faktory pro rakovinu prsu [3-4]. Moderní léčba stále zahrnuje chirurgii, radiační terapii a medikamentózní terapii [1]. Mezi běžná klinická léčiva patří cyklofosfamid, 5-fluorouracil, pirarubicin, tamoxifen citrát aj. [5] a existence lékové rezistence v BC buňkách také do určité míry přináší léčbu BC. velká výzva [6]. Zároveň jako heterogenní nádor BC pravděpodobněji metastazuje do orgánů, jako jsou kosti, plíce, játra a mozek, což činí metastatický karcinom prsu z velké části neléčitelným [7]. Cistanche je v mé zemi tradičním léčivým materiálem. Patří do čeledi rostlin a je známá jako „pouštní ženšen“[8].Echinakosid(ECH) je fenylethanoidní glykosid extrahovaný z Cistanche deserticola. Nedávné studie to zdůraznilyechinakosidmá silné antioxidační, protizánětlivé a protirakovinné vlastnosti. Například inhibicí dráhy mTOR/STAT3 může ECH zmírnit zánětlivou odpověď a oxidační stres při poškození jater vyvolaném paracetamolem [9]. Mnoho důkazů potvrdilo, že ECH hraje u BC hlavně nádorovou supresorovou roli a její mechanismus může souviset s down-regulací exprese miR-4306 a miR-4508 [10] nebo blokováním Wnt/-cateninu signalizace [11].

Aldo-ketoreduktáza 1B10 (AKR1B10), člen superrodiny aldo-ketoreduktáz, může pomocí redoxních reakcí převádět toxické látky na netoxické látky a produkovat odpovídající alkoholy, čímž má ochranný účinek na hostitelské buňky [12]. Studie naznačují, že AKR1B10 je exprimován hlavně v normálních lidských tkáních, jako je tlusté střevo a tenké střevo [13]. Další studie odhalily, že AKR1B10 působí hlavně jako onkogen u rakoviny prsu a může se stát potenciálním biomarkerem rakoviny prsu [14-16]. Jako klíčový člen rodiny MAPK extracelulárně regulované proteinkinázy (ERK) řídí různé evolučně konzervované buněčné procesy u metazoanů a dysregulace ERK může vést k různým onemocněním [17]. LI J et al [18] odhalili, že AKR1B10 může podporovat progresi rakoviny prsu aktivací signalizace ERK. Ještě zajímavější je, že webová stránka SwissTargetPrediction předpověděla AKR1B10 jako potenciální cíl echinacey. Není však známo, zda se ECH podílí na progresi rakoviny prsu zprostředkováním signalizace AKR1B10/ERK.

Tato studie se zaměřila na zkoumání specifických účinků ECH na fenotyp maligních buněk BC a objasnění vztahu mezi ECH a dráhou AKR1B10/ERK v buňkách BC.

1 materiál

Lidská normální epiteliální buněčná linie prsu MCF-10A a lidská buněčná linie rakoviny prsu MCF-7 poskytlo Centrum pro buněčné zdroje Shanghai Institutes for Biological Sciences, Čínská akademie věd; Buňky MCF-7 ADR-rezistentní byly zakoupeny od Shanghai Huzhen Industrial Co., Ltd. Bylo zakoupeno médium DMEM/F1 (číslo šarže PM150310), koňské sérum (číslo šarže 164215) a fetální hovězí sérum (číslo šarže 164210). od Wuhan Proceeds Life Technology Co., Ltd.; ECH (číslo šarže 07668) byl zakoupen od Sigma-Aldrich, USA; ADR (číslo šarže KGA8181) byl zakoupen od Jiangsu Kaiji Biotechnology Co., Ltd.; RIPA lyzační roztok (číslo šarže R0020) byl zakoupen od Beijing Soleibao Technology Co., Ltd.; BCA proteinové kvantitativní činidlo (číslo šarže CX0013S) bylo zakoupeno od Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd.; Činidlo CCK-8 (číslo šarže C0037) bylo zakoupeno od Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.; Transfekční činidlo Lipofectamine 2000 (číslo šarže 11668019) bylo zakoupeno od Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.

Plazmidy Ov-AKR1B10 a Ov-NC poskytla společnost Chongqing Youbao Biotechnology Co., Ltd.; EdU reagent (číslo šarže C00003) a souprava TUNEL (číslo šarže C11026-1) byly zakoupeny od Guangzhou Ribo Biotechnology Co., Ltd.; DAPI (číslo šarže 40727ES10) byl zakoupen od Guangzhou Ribo Biotechnology Co., Ltd. od Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.; Matrigel (šarže č. 354230) a transwell komůrka (šarže č. 3450) byly zakoupeny od Corning Company, USA; Paraformaldehyd (šarže č. 158127), krystalová violeť (šarže č. C0775) a roztok Tritonu X-100 (šarže č. T8787) byly poskytnuty společností Sigma Company ve Spojených státech; králičí AKR1B10 (číslo šarže ab192865), fosforylovaný ERK1/2 (p-ERK1/2, číslo šarže ab278538), ERK1/2 (číslo šarže ab184699), E-cadherin (E-cadherin, šarže ab212059), N-ca -cadherin, šarže ab76011), hlemýžď ​​(šarže ab216347), B-buněčný lymfom-2 (Bcl-2, šarže ab182858), protein X související s Bcl-2 (Bcl-2- asociovaná protilátka X, Bax, číslo šarže ab182733) a HPR-značená kozí anti-králičí sekundární protilátka (číslo šarže ab6702) byly zakoupeny od Abcam, USA; ECL luminiscenční kit (číslo šarže SL1350) byl zakoupen od Beijing Cool Lamb Technology Co., Ltd. Software Image-Pro Plus byl zakoupen od Media Cybernetics, USA; Fluorescenční mikroskop Leica DM1000 a inverzní mikroskop Leica DM ILLED byly zakoupeny od Leica Microsystems, Německo; Software SPSS 22.0 byl zakoupen od IBM, USA.

2 způsoby

2.1 Buněčná kultura a manipulace s ní

Buňky MCF{{0}}A byly kultivovány v DMEM/F12 obsahujícím 5 procent koňského séra, 20 ng·mL-1 epidermálního růstového faktoru, 0,5 ug·mL-1 kortizolu, 10 ng ·mL-1 inzulínu, 100 ng·mL-1 kultivačního média toxinu cholery; MCF-7 a MCF-7/ADR buňky

Kultivováno v médiu DMEM/F12 s 10 procentem FBS. Všechna média byla doplněna 1 procentem dvojité protilátky a skladována při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře s 5 procenty CO2. Následně byly buňky MCF-7 intervenovány ECH v různých koncentracích (0, 10, 20, 40 ug·mL-1) po dobu 48 hodin; a 1,0 mg·l-1 ADR bylo aplikováno k udržení lékové rezistence buněk MCF-7/ADR. sex. 2.2 Metoda Western blot Protein v buňkách MCF-7 byl extrahován pomocí RIPA lyzátu a koncentrace proteinu byla stanovena pomocí BCA činidla. Proteiny oddělené 10% SDS-PAGE byly přeneseny pomocí PVDF membrány; po zablokování 5% odstředěným mlékem po dobu 2 hodin při pokojové teplotě byla membrána /10 000), E-cadherin (1/10 000), N-cadherin (1/5 000) , Snail (1/1 000), Bcl-2 (1/1 000), Bax (1/1 000) Primární protilátka byla inkubována přes noc při 4 stupních a následně přidání HPR-značené kozí anti-králičí sekundární protilátky (1/2 000) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Cílový protein byl detekován přidáním ECL luminiscenční soupravy a množství proteinu bylo analyzováno softwarem Image-Pro Plus.

Bohatá na kávu Echinacoside Cistanche pro léčbu rakoviny prsu

2.3 CCK-8 test na životaschopnost buněk

Buňky MCF{{0}}A a MCF-7 byly nasazeny do 96-jamkových destiček pro kultivaci (5×103 buňky/jamka) a po 24 hodinách byly aplikovány různé koncentrace (0, 10, 20, 40 ug·mL-1) ECH Po intervenci, o 48 hodin později, byly ošetřeny 10% objemovou frakcí činidla CCK-8 a buněk životaschopnost byla zjištěna o 2 hodiny později. Aby bylo možné dále prozkoumat účinek ECH na životaschopnost buněk MCF{15}}, byly transfekované nebo netransfekované buňky MCF{16}} kultivovány po dobu 24 hodin a v různých koncentracích (0, 10, 20, 40 ug · K intervenci bylo použito ml-1) ECH. byla přidána 10procentní objemová frakce činidla CCK-8 po 24, 48 a 72 hodinách a metoda detekce životaschopnosti buněk byla stejná jako výše. Aby se prozkoumal účinek ECH na rezistenci buněk MCF-7 k doxorubicinu, buňky rezistentní na MCF-7/ADR byly kokultivovány s ECH po dobu 48 hodin a poté byl pracovní roztok CCK-8 přidán k detekci životaschopnosti buněk.

2.4 Transfekce plazmidu

Buňky MCF{0}} byly nasazeny a kultivovány v 6-jamkových destičkách (5x104/jamka). Když buňky dosáhly 60 až 70 procent konfluence, byly Ov-AKR1B10 a Ov-NC přechodně transfekovány v přísném souladu s instrukcemi pro transfekční činidlo Lipofectamine 2000. Buňky v každé skupině byly transfekovány a transfekce byla dokončena po 48 hodinách.

2.5 Barvení EdU pro detekci buněčné proliferace

Poté, co byly buňky MCF{{0}} ošetřeny ECH a transfekovány plazmidy, bylo do každé jamky přidáno 20 umol·L-1 EdU a inkubováno při 37 stupních po dobu 2 hodin. Následně byly buňky fixovány a permeabilizovány 4% paraformaldehydem a 0,5% Tritonem X-100, v daném pořadí. Nakonec byly EdU-pozitivní buňky obarvené DAPI detekovány pod fluorescenčním mikroskopem.

2.6 Test hojení ran pro detekci migrace buněk

Buňky MCF{{0}} v log fázi růstu byly přidány do 6-jamkových destiček, a když buňky dosáhly 90% konfluence, použijte 200 µl sterilní špičku pipety k vytvoření proužku a promyjte 3 krát s PBS. Šířka rány byla měřena v čase 0 a 48 h pod inverzním mikroskopem a byl stanoven počet přenesených buněk.

2.7 Test Transwell pro detekci buněčné invaze

Buňky MCF-7 ošetřené ECH a transfekované plasmidem byly nasazeny do horní komory transwell obsahující Matrigel a do spodní komory transwell bylo přidáno 500 ul média DMEM obsahujícího 10 procent FBS. Po 24 hodinách byly povrchové buňky setřeny vatovými tampony a buňky byly fixovány a obarveny paraformaldehydem, respektive krystalovou violetí, a invazivní buňky byly spočítány pod mikroskopem.

2.8 Barvení TUNEL pro detekci apoptózy

Po zásahu 15 µmol L-1 ADR byly buňky MCF-7/ADR rezistentní na ECH ošetřené a transfekované plasmidem nasazeny do 96-jamkových destiček a fixovány 4% paraformaldehydem a {{ 8}},5 procenta Tritonu X-100 Po permeabilizačním ošetření byl přidán detekční roztok TUNEL a reakce byla prováděna při 37 stupních po dobu 45 minut podle pokynů sady a buněčná jádra DAPI byla obarvena . Pro pozorování buněčné apoptózy pod fluorescenčním mikroskopem bylo náhodně vybráno pět zorných polí.

2.9 Molekulární dokování

Trojrozměrná struktura proteinu AKR1B10 (PDB ID: 1ZUA) byla získána z databáze PDB (https://www.rcsb.org/). Použijte software PyMOL 2.2.0 k odstranění vody z aktivních složek a odstranění irelevantních původních ligandů, poté převeďte chemickou strukturu ECH do formátu mol2 pomocí softwaru OpenBabel 2.2.1 (http://openbabel.org/wiki) a nakonec použijte Autodock 4.2 provede molekulární dokování a pro vizualizaci vybere pozici s nejnižší volnou energií (-10,8 kcal·mol-1).

2.10 Statistická analýza

V této studii byl k analýze a zpracování experimentálních dat použit software SPSS 22.0 a vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (x ± s). Pro srovnání mezi skupinami byla použita jednosměrná analýza rozptylu. Když P<0.05, the difference was statistically significant.

3 výsledky

3.1 ECH inhibuje signalizaci AKR1B10/ERK v buňkách MCF-7 Za prvé, výsledky Western blottingu odhalily, že se zvýšením expoziční dávky ECH se hladiny proteinů AKR1B10 a pERK1/2/ERK1/2 v MCF{{11 }} buněk se snížil a klesající trend byl závislý na dávce P<0.001) (Fig. 1). It can be speculated that ECH may participate in the malignant progression of BC by regulating AKR1B10/ERK signaling.

Obr.1 Účinekechinakosidna transdukci signálu AKR1B10/ERK v buňkách MCF-7 (x̄  s, n=3)

3.2 Nadměrná exprese AKR1B10 zvrátila inhibiční účinek ECH na proliferaci buněk MCF-7

Experimentální data CCK{{0}} ukázala, že ve srovnání s normálními buňkami MCF-10A, vystavení různým koncentracím ECH (0, 10, 20, 40 ug·mL{{6} }) vedlo ke snížení aktivity rakovinných buněk MCF-7 závislém na koncentraci (P< 0.05), and when the mass concentration of ECH was 40 μg·mL-1, the cell activity decreased most significantly, so 40 μg·mL-1 ECH was used for subsequent experiments. To further verify whether ECH regulates BC development by regulating AKR1B10/ERK signaling, MCF-7 cells were first transfected with the Ov-AKR1B10 plasmid. After transfection of Ov-AKR1B10, the expression level of AKR1B10 was significantly increased (P<0.001). Western blotting results showed that transfection of Ov-AKR1B10 plasmid induced ECH exposure-induced reduced AKR1B10 and p-ERK1/2 protein levels again increased (P<0.001). In addition, the experimental data of CCK-8 and EdU demonstrated that the inhibitory effect of ECH treatment on the proliferation of MCF-7 cells could be alleviated by the up-regulation of AKR1B10 (P<0.05) (Fig. 2). Thus, overexpression of AKR1B10 rescued the inhibitory effect of ECH on the proliferative capacity of BC cells.

Obr. 2 Vliv echinosidu na proliferaci buněk MCF-7 regulací exprese AKR1B10 (fluorescenční barvení, ×200; x̄  s, n=3)

3.3 Nadměrná exprese AKR1B10 zvrátila inhibiční účinek ECH na migraci buněk MCF-7 Podobně ve srovnání s kontrolní skupinou vedlo podávání ECH k významnému snížení počtu migrace a invaze buněk (P<0.001); In contrast, increased expression of AKR1B10 resulted in enhanced cell migration and invasion (P<0.05). In addition, compared with the control group, the protein levels of N-cadherin and Snail were significantly decreased after ECH treatment, while the level of E-cadherin was significantly increased (P<0.001); The protein levels of cadherin and Snail increased, while the level of E-cadherin decreased (P<0.001) (Fig. 3). In conclusion, up-regulation of AKR1B10 expression rescued the inhibitory effect of ECH administration on BC cell migration and invasion.

Obr.4 Vliv echinosidu na ADR rezistenci buněk MCF-7 regulací exprese AKR1B10 (fluorescenční barvení, ×200; x̄  s, n=3)

4. Diskuze

Karcinom prsu označuje nekontrolované množení epiteliálních buněk mléčné žlázy působením různých karcinogenních faktorů a je také hlavní příčinou úmrtí na rakovinu u žen [1]. Nádorové metastázy jsou jednou z nejvíce ohrožujících charakteristik nádorů a jsou také hlavní příčinou dlouhodobého vyléčení nádorů [19]. Chemoterapie je běžnou metodou klinické léčby karcinomu prsu [20]. S neustálým pokrokem a aktualizací metod a konceptů léčby karcinomu prsu se prognóza karcinomu prsu významně zlepšila [20]. Vznik lékové rezistence však značně omezuje klinickou účinnost léků [21]. Studie zjistily, že asi 90 procent pacientek s metastatickým karcinomem prsu a 50 procent pacientek s pokročilým karcinomem prsu vyvine rezistenci vůči lékům [22]. ADR je antracyklinové antibiotikum, které se široce používá v klinické léčbě metastatického nebo recidivujícího karcinomu prsu působením na chemickou strukturu DNA a může účinně snížit míru recidivy a mortalitu pacientek s karcinomem prsu [23]. Tato studie se proto zaměřila na proliferaci, metastázy a ADR rezistenci BC buněk, aby hluboce odhalila regulační mechanismus progrese BC a hledala potenciální molekulární cíle pro intervenci.

Echinacea je fenylethanoidová sloučenina získaná z oddenků přírodních bylin Cistanche deserticola a Echinacea purpurea. Má různé farmakologické účinky, například antioxidační, antidepresivní, protizánětlivé, antivirové, protinádorové a antibakteriální [24-25]. Nedávné studie uvádějí, že ECH může inhibovat proliferaci, metastázy a angiogenezi buněk rakoviny vaječníků regulací PI3K/Akt dráhy [26]; ECH může uplatnit svou protirakovinnou aktivitu u rakoviny jater aktivací dráhy TGF-1/Smad [27]. ECH může bránit růstu nádoru BC inaktivací signální dráhy Wnt/-catenin [11]. SwissTargetPrediction v této studii poprvé předpověděla, že AKR1B10 bude potenciálním cílem ECH. Autoři proto spekulují, že ECH se může podílet na progresi onemocnění BC regulací signálních drah souvisejících s AKR1B{11}}. Až dosud bylo zjištěno, že exprese AKR1B10 je zvýšená u různých druhů rakoviny a hraje roli v podpoře rakoviny [28]. Kromě toho může AKR1B10 zhoršit rozvoj rakoviny močového měchýře, adenokarcinomu plic a BC aktivací signalizace ERK [18, 29-30]. Ektopická exprese AKR1B10 v buňkách rakoviny prsu podporuje fosforylaci ERK 1/2 k aktivaci signální dráhy ERK [18]. Signální dráha ERK podporuje degradaci extracelulární matrix aktivací MMP, zejména MMP2, čímž podporuje invazi nádorových buněk a metastázy nádoru [31-33]. Výsledky tohoto experimentu také ukázaly, že exprese proteinů souvisejících s dráhou AKR1B10/ERK se po léčbě různými koncentracemi ECH snížila v závislosti na dávce, což naznačuje, že ECH se může účastnit regulačního mechanismu BC inhibicí AKR1B10/ERK cesta. Kromě toho expozice ECH také vedla k různému stupni snížení životaschopnosti BC buněk. K dalšímu prokázání tohoto bodu tato studie transfekovala plazmid s nadměrnou expresí AKR1B10 do buněk MCF-7 BC a zjistila, že inhibiční účinky léčby ECH na dráhu AKR1B10/ERK a buněčnou proliferaci, migraci a invazi a epiteliálně-mezenchymální přechod byly nadměrně exprimovány od AKR1B10 zachráněna. Kromě toho u buněk rezistentních na MCF-7/ADR vedla expozice ECH ke snížení IC50 a zvýšení počtu apoptotických buněk; zatímco nadměrná exprese AKR1B10 v tomto nastavení opět zvýšila IC50 a snížila produkci apoptotických buněk. Na konci experimentu byl také plně ověřen vztah cílení mezi ECH a AKR1B10. Výše uvedené experimentální výsledky ukazují, že

Nadměrná exprese AKR1B10 dosahuje antagonistického účinku na ECH-suprimovaný vývoj BC.

Závěrem lze říci, že podávání ECH může zmírnit proliferaci, migraci, invazi, EMT a ADR rezistenci BC buněk a mechanismus může souviset s cílením AKR1B10 a inhibicí signální dráhy AKR1B10/ERK. Tato studie zpočátku objasnila potenciální mechanismus ECH u BC a poskytla cenný experimentální základ a teoretickou podporu pro aplikaci ECH v lécích proti BC. V této studii však stále existují určité nedostatky. Za prvé, tento experiment nezahrnoval analýzu dopadu ECH na míru přežití a prognózu pacientů s BC; za druhé, v této studii chyběly pokusy na zvířatech in vivo k dalšímu ověření role ECH v růstu nádorů BC. V budoucích studiích bude klinický význam ECH v léčbě rakoviny prsu dále zkoumán.

Podpěra, podpora:

wallence.suen@wecistanche.com 0015292862950