Duální modulační účinky diosminu na procesy tvorby ledvinových kamenů šťavelanu vápenatého: krystalizace, růst, agregace, adheze krystalických buněk, internalizace do renálních tubulárních buněk a invaze přes extracelulární matrici
Mar 16, 2022
další informace:ali.ma@wecistanche.com
Supaporn Khamchuna,b,c,1, Sunisa Yoodeea,1, Visith Thongboonkerda,*
aJednotka lékařské proteomiky, Úřad pro výzkum a vývoj, Lékařská fakulta Nemocnice Siriraj, Mahidol University, Bangkok 10700, Thajsko
bKatedra lékařské technologie, School of Allied Health Sciences, University of Phayao, Phayao 56000, Thajsko
cUnit of Excellence in Integrative Molecular Biomedicine, School of Allied Health Sciences, University of Phayao, Phayao 56000, Thailand
Klíčová slova: Bioaktivní sloučenina, Flavonoid, Inhibitor, Modulátor, Nefrolitiáza, Promotor, Urolitiáza
ABSTRAKTNÍ
Diosminje přírodní flavonový glykosid (bioflavonoid) nacházející se v ovoci a rostlinách s několika farmakologickými aktivitami. Je široce používán jako doplněk stravy nebo terapeutické činidlo při různých onemocněních/poruchách. Ačkoli se doporučuje, důkaz o jeho ochranných mechanismech protiledvinakamenné onemocnění (nefrolitiáza/urolitiáza), zejména monohydrát oxalátu vápenatého (CaOx) (COM), který je nejčastějším typem, zůstal nejasný. V této studii jsme tedy systematicky hodnotili účinkydiosmin(při 2,5–160 nM) na různých stupníchledvinaprocesy tvorby kamenů, včetně krystalizace COM, růstu krystalů, agregace, adheze krystal-buňka, internalizace do renálních tubulárních buněk a invaze přes extracelulární matrix (ECM). Výsledky to ukázalydiosminměl na dávce závislé modulační účinky na všechny zmíněné procesy ledvinových kamenů COM.Diosminvýznamně zvýšil počet krystalů COM a hmotnost během krystalizace, ale snížil velikost a růst krystalů. Zatímcodiosminpodporoval agregaci krystalů, inhiboval adhezi krystal-buňka a internalizaci do renálních tubulárních buněk. Nakonec diosmin podpořil invazi krystalů prostřednictvím ECM. Naše data poskytují důkazy prokazující jak inhibiční, tak podpůrné účinky diosminu na COMledvinaprocesy tvorby kamene. Na základě těchto duálních modulačních aktivit diosminu je jeho antiurolitiázová role pochybná a je třeba věnovat pozornost jeho použití vledvinakamenná nemoc.
1. Úvod
Diosmin(3′,5,7-trihydroxy-4′-methoxyflavon-7-rhamnoglukosid) je přírodní bioflavonoid běžně se vyskytující v různých rostlinách a ovoci, zejména v Citrus spp. [1,2]. Může být syntetizován nebo odvozen z jiného flavonoidu, hesperidinu [1,2]. Diosmin samotný nebo v kombinaci s hesperidinem je široce používán jako flebotropní lék k léčbě žilních a lymfatických poruch, jako je chronická žilní nedostatečnost a hemoroidy [3,4]. Kromě toho diosmin vykazuje několik dalších biologických a farmakologických aktivit, včetně antioxidačních a protizánětlivých aktivit [5,6], antimutagenních a antineoplastických vlastností [7,8], antibiotických účinků [9], antihyperglykemických vlastností [ 10], a ochranné účinky proti multiorgánovému poškození, tzn.
kardiovaskulární [11], retinální [12],ledvinapoškození jater a mozku [13].
ledvinykamenné onemocnění (neboli nefrolitiáza/urolitiáza) je způsobeno pevnými konkrementy vyvinutými a uloženými v ledvinách a postihuje lidi ve všech oblastech zeměkoule s vysokou mírou recidivy [14–17]. Mezi všemi různými kauzálními krystaly je šťavelan vápenatý (CaOx), zejména monohydrátová forma (COM), nejpatogenní a nejběžnější krystalickou složkou nacházející se u kamenů (pacienti s ledvinovými kameny) [18]. Mechanicky mají krystaly COM nejúčinnější adhezivní schopnost a nejvíce cytotoxických účinků na renální tubulární epiteliální buňky [19,20]. Během patogeneze konkrementu mají Randallův model plaku i intratubulární hypotéza společné rysy procesů tvorby COM kamenů, včetně krystalizace COM, růstu, agregace, retence povrchovou adhezí na renálních tubulárních buňkách nebo ledvinové pánvičce, internalizace do buněk a invaze do renální intersticium přes extracelulární matrix (ECM) [21,22].
V poslední době se mnoho studií soustředilo na objevy léčiv využívajících léčivé rostliny/ovoce a jejich bioaktivní sloučeniny s cílem zabránit tvorbě nových a/nebo opakujících se kamenů. Řada předchozích zpráv ukázala, že některé bioaktivní sloučeniny, zejména fenolické sloučeniny (polyfenol, flavonoid, flavonglykosid atd.) extrahované z několika léčivých rostlin/ovocí, mají preventivní účinky proti patogenním mechanismůmledvinakamenné onemocnění in vitro i in vivo [23–25]. Mezi těmito prospěšnými látkami několik zpráv naznačovalo, že diosmin může zabránit ukládání krystalů CaOx v tkáni ledvin na zvířecích modelech [26,27]. Jeho přesná modulační role (inhibice nebo podpora) a mechanismy (fáze nebo procesy tvorby kamenů) při tvorbě ledvinových kamenů COM však nebyly zkoumány. Tato studie tedy systematicky hodnotila účinkydiosmin(při 2,5–160 nM) na různých stupníchledvinaprocesy tvorby kamenů, včetně krystalizace, růstu krystalů, agregace, adheze krystal-buňka, internalizace do renálních tubulárních buněk a invaze prostřednictvím ECM.
Klikněte naDávkování Cistanche tubulosa pro funkci ledvin
2. Materiály a metody
2.1. Příprava diosminu
Diosmin(Tokyo Chemical Industry; Tokio, Japan) byl rozpuštěn ve 100% dimethylsulfoxidu (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) a byly připraveny pracovní alikvoty v konečných koncentracích 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 a 160 nM pro zkoumání jeho účinků na krystaly COM. Kromě toho byl ve všech experimentech jako negativní kontrola použit 100% DMSO.
2.2. Buněčná kultura
MDCK renální tubulární epiteliální buněčná linie odvozená z distálního tubulárního segmentu nefronu (ATCC; Manassas, VA) byla propagována v Eagleově minimálním esenciálním médiu (MEM) (Gibco; Grand Island, NY) doplněném 10% fetálním bovinním sérem (FBS), 60 U/ml penicilinu G (Sigma-Aldrich) a 60 ug/ml streptomycinu (Sigma-Aldrich). Buňky byly udržovány ve zvlhčeném inkubátoru s 5 procenty CO2 při 37 °C.
2.3. COM krystalizační test
Krystalizace COM byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve [28,29]. Stručně, 500 ul 10 mM CaCl2⋅2H20 v krystalizačním pufru (obsahujícím 10 mM Tris-HCl a 90 mM NaCl) (pH 7,4) bylo přidáno do každé jamky 24-jamkové destičky (Corning Inc.; Corning, NY). Stejný objem (4 ul) krystalizačního pufru (slepá kontrola), DMSO (negativní kontrola) nebodiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 nebo 160 nM) byl smíchán s CaCl2. Nakonec bylo přidáno 500 ul 1,0 mM Na2C204 v krystalizačním pufru, aby byly konečné koncentrace CaCl2 a Na2C204 na 5 mM, respektive 0,5 mM. Směs byla inkubována při 25 °C po dobu 1 hodiny a poté zkoumána. Krystalové snímky byly náhodně zachyceny z alespoň 15 vysoce výkonných polí (HPF) pod mikroskopem Nikon Eclipse Ti-S s invertovaným fázovým kontrastem (Nikon; Tokio, Japonsko). Velikost a počet krystalů byly měřeny z alespoň 15 HPF pro každý vzorek pomocí softwaru NIS Element D verze 4.11 (Nikon). Hmotnost krystalů byla vypočtena z alespoň 100 krystalů v 15 HPF pomocí následujícího vzorce: Hmotnost krystalů (µm2/HPF)=Průměrná velikost krystalů v každém poli (µm2) × Počet krystalů v každém poli (/HPF) ( 1)
2.4. Test růstu krystalů COM
Test růstu krystalů byl proveden tak, jak bylo popsáno dříve [30,31].
Stručně řečeno, stejný objem (500 ul) 10 mM CaCl2⋅2H2O a 1,0 mM Na2C2O4 v krystalizačním pufru byl smíchán (1:1) (obj./obj.) v každé jamce { {12}}jamková destička. Směs byla inkubována při 25 °C po dobu 1 hodiny, aby byla umožněna úplná krystalizace. V tomto okamžiku (T0) se použije stejný objem (4 ul) krystalizačního pufru (slepá kontrola), DMSO (negativní kontrola) popř.diosmin(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 nebo 160 nM) byl přidán do každé jamky a směs byla dále inkubována po dobu 60 minut (T60). V T0 a T60 byly snímky krystalů zachyceny náhodně z alespoň 15 HPF pod mikroskopem Nikon Eclipse Ti-S s inverzním fázovým kontrastem. Velikosti krystalů v T0 a T60 byly měřeny pomocí softwaru NIS Element D verze 4.11 (Nikon), zatímco růst krystalů (reprezentovaný Δ Velikost krystalů) byl vypočten z alespoň 100 krystalů v 15 HPF pomocí následujícího vzorce: Δ Velikost krystalů (µm2)=Velikost krystalu při T60 − Velikost krystalu při T0 (2)
2.5. Test agregace krystalů COM
Test agregace krystalů byl proveden tak, jak bylo popsáno dříve [32,33]. Krystaly COM byly vytvořeny, jak je uvedeno výše v testu růstu krystalů, ale s větším objemem v 50-ml kónické zkumavce (Corning Inc.) a poté sklizeny centrifugací při 2000 g po dobu 5 minut. Supernatant byl odstraněn, zatímco COM krystaly byly promyty třikrát methanolem. Po další centrifugaci při 2000 g po dobu 5 minut byl methanol odstraněn a krystaly byly sušeny na vzduchu přes noc při 25 °C. Krystaly COM (1000 ug suché hmotnosti) byly resuspendovány v 1 ml krystalizačního pufru v každé jamce 6-jamkové destičky (Corning Inc.). Stejný objem (4 ul) krystalizačního pufru (slepá kontrola), DMSO (negativní kontrola) nebodiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 nebo 160 nM) byl přidán do suspenze COM krystalů v každé jamce. Destička byla nepřetržitě třepána v třepacím inkubátoru (Zhicheng; Shanghai, Čína) při 150 otáčkách za minutu a 25 °C po dobu 1 hodiny. Poté byla zkoumána a zobrazena pod mikroskopem Nikon Eclipse Ti-S s inverzním fázovým kontrastním světelným mikroskopem tvorba agregátu krystalů COM (definovaného jako „sestava tří nebo více jednotlivých krystalů COM, které jsou pevně spojeny dohromady“ [32]). Počet COM krystalických agregátů byl počítán z alespoň 15 náhodných HPF na jamku.
2.6. Test adheze COM krystal-buňka
Test adheze krystal-buňka byl proveden tak, jak bylo popsáno dříve [34,35]. Stručně, krystaly COM byly vytvořeny, jak je uvedeno výše, v 50-ml kónické zkumavce a poté sklizeny centrifugací při 2000 g po dobu 5 minut. Supernatant byl odstraněn, zatímco COM krystaly byly promyty třikrát methanolem. Po další centrifugaci při 2000 g po dobu 5 minut byl methanol odstraněn a krystaly byly sušeny na vzduchu přes noc při 25 °C. Krystaly byly dekontaminovány UV zářením po dobu 30 minut před zásahem do buněk.
Buňky MDCK (v hustotě 2 x 105 buněk/jamka) byly nasazeny a pěstovány v každé jamce 6-jamkové destičky (Corning Inc.) po dobu 48 hodin, aby se získala konfluentní monovrstva. Kultivační médium bylo poté obnoveno před přidáním krystalů COM (100 ug suchých krystalů na ml kultivačního média). Stejný objem (4 ul) krystalizačního pufru (slepá kontrola), DMSO (negativní kontrola) nebodiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 nebo 160 nM) byl přidán do každé jamky. Buňky byly dále inkubovány ve zvlhčeném inkubátoru s 5 procenty CO2 při 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté byly buňky pětkrát důkladně promyty PBS a zobrazeny pod mikroskopem Nikon Eclipse Ti-S s inverzním fázovým kontrastem. Počet zbývajících krystalů COM přilnutých k povrchu renálních tubulárních buněk byl spočítán z alespoň 15 náhodných polí na jamku.
Cistanche pro funkci ledvin
2.7. Test internalizace COM krystalu
Fluorescenčně značené krystaly COM byly vytvořeny tak, jak bylo popsáno dříve [36,37]. Složení/koncentrace chemikálií použitých pro krystalizaci byly stejné jako výše uvedené pro prosté (neznačené) krystaly, ale 0,1 µg/ml fluorescein isothiokyanát (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) byl přidán do roztoku CaCl2⋅2H2O před smícháním s Na2C2O4. Následné kroky (krystalizace a sklizeň) byly provedeny jak je uvedeno výše, ale ve tmě.
K vyhodnocení internalizace krystalů do renálních tubulárních epiteliálních buněk byly MDCK buňky (v hustotě 2 x 105 buněk/jamka) nasazeny a pěstovány v každé jamce 6-jamkové destičky (Corning Inc.) po dobu 48 hodin, aby se získal splývající monovrstva. Buněčná monovrstva byla inkubována s krystaly COM značenými FITC (1000 ug krystalů/ml média) ve zvlhčeném inkubátoru s 5 procenty CO2 při 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté byly buňky promyty PBS a inkubovány s roztokem trypsin-EDTA, aby se odstranily neinternalizované (jak adherentní, tak neadherentní) krystaly. Procento buněk s internalizovanými krystaly bylo kvantifikováno z celkem 10 000 získaných událostí pomocí průtokového cytometru (BD Accuri C6) (BD Biosciences; San Jose, CA). Buňky inkubované s prostými (neznačenými) krystaly COM byly použity pro přednastavení šumu a prahu pro pozitivní fluorescenční signál. Buňky s pozitivními fluorescenčními signály byly poté spočítány a použity pro výpočet procent.
2.8. Invaze COM krystalů prostřednictvím ECM testu
Krystaly COM byly připraveny tak, jak je popsáno výše pro agregaci krystalů a testy adheze krystal-buňka. Test krystalové invaze byl proveden podle protokolu stanoveného dříve [38,39]. Stručně řečeno, celkem 20 µg krystalů COM potažených krystalizačním pufrem (slepá kontrola), DMSO (negativní kontrola), albuminem (Sigma-Aldrich) (pozitivní kontrola) popř.diosmin(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 nebo 160 nM) byly přidány do 200 ul MEM. Následně bylo smícháno 200 ul 0,3 pM Lys-plasminogenu (Fitzgerald Industries international; Acton, MA) v PBS a inkubováno s komplexem krystal-protein při 37 °C po dobu 1 hodiny. Nenavázaný plasminogen byl odstraněn centrifugací při 2000 g po dobu 5 minut a peleta byla jednou promyta PBS. Poté bylo 100 ul 0,15 pM urokinázového aktivátoru plasminogenu (uPA) (Fitzgerald Industries International) v PBS smícháno s komplexem krystal-protein-plasminogen/plasmin. Směs byla poté přidána na vršek matricového gelu uvnitř ECM migrační komory a inkubována při 37 °C. Po 24-hodinové inkubaci byl roztok, který zůstal v horní části migrační komory, odstraněn pomocí gázy nebo hedvábného papíru. Napadené COM krystaly uvnitř matricového gelu byly poté zobrazeny pomocí světelného mikroskopu s režimem diferenciálního interferenčního kontrastu (DIC) (Nikon H600L). Vzdálenost invaze krystalů byla měřena a zprůměrována z alespoň 15 polí s nízkou spotřebou energie (LPF) ve stejné komoře pomocí softwaru NIS Element D verze 4.11 (Nikon).
2.9. Statistická analýza
Všechny výše uvedené experimenty byly provedeny v triplikátech (tři nezávislé experimenty) a kvantitativní data jsou uvedena jako průměr ± SEM. Vícenásobná srovnání byla provedena pomocí jednocestné analýzy rozptylu (ANOVA) s Tukeyho post-hoc testem. Pro zjištění vztahu mezi proměnnými byl proveden Pearsonův korelační test. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru SPSS (verze 18) (IBM SPSS; Armonk, NY). Hodnota P menší než 0,05 byla považována za statisticky významnou.
3. Výsledky
3.1. Vliv diosminu na krystalizaci COM
Krystalizace je jedním ze základních raných krokůledvinaprocesy tvorby kamenů všech typů. Po 1- h krystalizace s nebo bezdiosminpři různých koncentracích (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 nebo 160 nM) byla měřena velikost a počet krystalů COM a byla vypočtena hmotnost krystalů. Krystalizační pufr a ředidlo DMSO sloužily jako slepé a negativní kontroly, v daném pořadí. Data ukázala, že všechny dávky (2,5–160 nM) disominu významně snížily velikost krystalů, ale zvýšily počet krystalů v závislosti na dávce ve srovnání se slepými a negativními kontrolami (obr. 1A–1C). V souladu s počtem krystalů se hmotnost krystalů zvyšovala v závislosti na dávce (obr. 1D). Celkově tato data naznačují, že diosmin podporuje krystalizaci COM (neokrystaly).
3.2. Vliv diosminu na růst krystalů COM
Modulační účinekdiosminRůst krystalů na COM byl hodnocen měřením změny velikosti krystalů (A Velikost krystalů) po 60- min další inkubace po dokončení počátečního krystalizačního kroku, kdy neokrystaly chyběly. Výsledky ukázaly, že všechny dávky (2,5–160 nM) disominu významně snížily velikost Δ krystalů v závislosti na dávce ve srovnání se slepým pokusem a negativními kontrolami (obr. 2). Tato zjištění naznačují, že diosmin inhibuje růst krystalů COM.
3.3. Vliv diosminu na agregaci krystalů COM
Kromě růstu krystalů je dalším důležitým krokem agregace jednotlivých krystalů, které k sobě těsně přilnouledvinapatogeneze kamenů. Vysoký stupeň agregace krystalů může v konečném důsledku vést ke zvětšení konkrementu a obstrukci malého renálního tubulárního lumenu. Ve srovnání se slepými a negativními kontrolami,diosminpři 10–160 nM se v závislosti na dávce zvýšil počet agregátů krystalů COM (obr. 3). Tyto výsledky naznačují, že diosmin podporuje agregaci krystalů COM.
Cistanche pro funkci ledvin
3.4. Vliv diosminu na adhezi COM krystal-buňka
Retence kauzativních krystalů je jedním z klíčových kroků proledvinatvorba kamenů a může být vyvolána adhezí krystal-buňka, která zabraňuje vylučování krystalů spolu s odtokem moči. Hodnotili jsme tak modulační aktivitudiosminna adhezi COM krystal-buňka. Data odhalila, že diosmin v koncentraci 5–160 nM významně snížil adhezivní schopnost COM krystalů na renálních tubulárních buňkách způsobem závislým na dávce ve srovnání se slepými a negativními kontrolami (obr. 4). Tato data ukazují, že diosmin inhibuje adhezi COM krystal-buňka.
3.5. Účinek diosminu na internalizaci krystalů COM do renálních tubulárních buněk
Po adhezi mohou být některé krystaly COM internalizovány do renálních tubulárních buněk a způsobit několik následných buněčných odpovědí [37,40]. Internalizace krystalů byla hodnocena pomocí FITC-značených COM krystalů a kvantifikována průtokovou cytometrií. Prosté COM krystaly (bez značení) byly použity pro odečtení technického šumu a pro zajištění, že intenzita fluorescence byla ze signálu FITC. Ve srovnání se slepou a negativní kontrolou bylo procento buněk s internalizovanými krystaly významně sníženodiosminpři 10–160 nM způsobem závislým na dávce (obr. 5). Zjištění naznačují, že disomin inhibuje internalizaci krystalů COM do renálních tubulárních buněk.
3.6. Vliv diosminu na invazi COM krystalů prostřednictvím ECM
Invaze krystalů prostřednictvím ECM je patogenní/destruktivní proces běhemledvinapatogeneze kamenů, které mohou vyvolat různé zánětlivé reakce a kaskády, a tím zhoršit mechanismy onemocnění. Tento jev jsme zkoumali pomocí zavedeného protokolu založeného na plasminogen-plasminové aktivitě komplexu krystal-protein [38,39]. Výsledky ukázaly, že všechny dávky disominu (2,5–160 nM) významně zvýšily invazi COM krystalů přes ECM způsobem závislým na dávce (obr. 6). Zajímavě,diosminpři 160 nM by mohl podporovat invazi COM krystalů srovnatelnou s albuminem, což je známý silný promotor pro invazi COM krystalů [41] (obr. 6). Tyto výsledky ukazují, že diosmin silně podporuje invazi COM krystalů přes ECM.
Obr. 1. Účinekdiosminna krystalizaci COM. Krystalizační test byl proveden se stejným objemem (4 ul) krystalizačního pufru (slepá kontrola), DMSO (negativní kontrola) nebo diosminu (2,5–160 nM). (A): Krystalová morfologie v každé podmínce po 1-h krystalizaci. Původní zvětšení bylo 400× pro všechny panely. (B): Velikost krystalu. (C): Číslo krystalu. (D): Krystalová hmota (viz vzorec 1 v "Materiály a metody") byla analyzována z alespoň 100 krystalů v 15 HPF. Každý sloupec představuje průměr ± SEM dat odvozených ze 3 nezávislých experimentů. *=str< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
Obr. 2. Účinekdiosminna růstu COM krystalů. Test růstu krystalů byl proveden po dokončení krystalizace (aby se zabránilo neokrystalizaci) se stejným objemem (4 ul) krystalizačního pufru (slepá kontrola), DMSO (negativní kontrola) nebo diosminu (2,5–16 0 nM). (A): Krystalová morfologie v každé podmínce v T0 a T60. Původní zvětšení bylo 400× pro všechny panely. (B)-(J): Histogramy velikostí krystalů měřené z jednotlivých krystalů při TO a T60 v každé skupině. (K): A velikost krystalů (viz vzorec 2 v "Materiály a metody") byla analyzována z alespoň 100 krystalů v 15 HPF. Každý sloupec představuje průměr ± SEM dat odvozených ze 3 nezávislých experimentů. *= p < 0,05="" vs.="" prázdná="" kontrola;="" #="p">< 0,05="" vs.="">
Obr. 3. Účinekdiosminna agregaci krystalů COM. Test agregace krystalů byl proveden se stejným objemem (4 ul) krystalizačního pufru (slepá kontrola), DMSO (negativní kontrola) nebo diosminu (2,5–160 nM). (A): Mikrofotografie agregovaných krystalů COM (označené tečkovanými kroužky). Původní zvětšení bylo 400 × pro všechny panely. (B): Počet krystalických agregátů byl počítán z alespoň 15 náhodných HPF v každé jamce. Každý sloupec představuje průměr ± SEM dat odvozených ze 3 nezávislých experimentů. *=str< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
Obr. 4. Účinekdiosminna adhezi COM krystal-buňka. Test adheze krystal-buňka byl proveden se stejným objemem (4 ul) krystalizačního pufru (slepá kontrola), DMSO (negativní kontrola) nebo diosminu (2,5–160 nM). (A): Mikrofotografie zbývajících krystalů, které těsně přilnuly k buněčné monovrstvě po odstranění nenavázaných krystalů intenzivním promytím PBS. Původní zvětšení bylo 200 × pro všechny panely. (B): Počet přilnutých krystalů byl spočítán z alespoň 15 náhodných polí v každé jamce. Každý sloupec představuje průměr ± SEM dat odvozených ze 3 nezávislých experimentů. *= str<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
Obr. 5. Účinekdiosminna internalizaci COM krystalu do renálních tubulárních buněk. Test internalizace krystalů byl proveden pomocí FITC-značených COM krystalů (FITC-COM), zatímco prosté (neznačené) COM krystaly byly použity pro odečtení pozadí/šumu. Test byl proveden se stejným objemem (4 ul) krystalizačního pufru (slepá kontrola), DMSO (negativní kontrola) nebo diosminu (2,5–160nM). (A): Průtoková cytometrická bodová analýza velikosti (osa y) a intenzity fluorescence FITC (osa x) buněk po odstranění neinternalizovaných krystalů pomocí 0,1 procenta trypsinu/2,5 mM EDTA. (B): Procento buněk s internalizovanými FITC-značenými COM krystaly. Každý sloupec představuje průměr ± SEM dat odvozených ze 3 nezávislých experimentů. *= str<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
Obr. 6. Účinekdiosminna invazi COM krystalů přes ECM. Invaze krystalů pomocí testu ECM byla provedena pomocí krystalů COM potažených krystalizačním pufrem (slepá kontrola), DMSO (negativní kontrola), albuminem (pozitivní kontrola) nebo diosminem (2,5–160 nM). (A): Mikrofotografie krystalů COM, které pronikly nebo migrovaly přes migrační komoru ECM. Původní zvětšení bylo 100× pro všechny panely. (B): Vzdálenost invaze krystalů byla měřena z alespoň 15 náhodných LPF v každé komoře. Každý sloupec představuje průměr ± SEM dat odvozených ze 3 nezávislých experimentů. *= str<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. Diskuze
Onemocnění ledvinových kamenů je způsobeno tvorbou kamenů uvnitřledvinaa pelvocalyceal systém. Mezi běžné procesy tvorby ledvinových kamenů patří krystalizace COM, růst, agregace, retence adhezí krystal-buňka a invaze přes renální intersticium bohaté na ECM [21,22]. Existuje několik pokusů zabránit tomuto onemocnění pomocí různých léků a/nebo doplňků výživy. Řada nedávných důkazů uvádí, že flavonoidy, flavonové glykosidy a další sloučeniny extrahované z citrusových plodů mohou mít preventivní účinky na onemocnění ledvinových kamenů a další poruchy [23–25]. Mezi těmito,diosmin, přírodní flavonový glykosid a derivát hesperidinu, který se nachází hlavně v citrusových plodech [1,2], se předpokládá, že hraje preventivní roli proti poranění a poškozeníledvinatkáně [13,42]. Jeho antiurolitiázová role byla navíc popsána v několika předchozích studiích na zvířecích modelech [26,27]. Nicméně příznivé účinky a základní mechanismy diosminu v prevenci ledvinových kamenů zůstaly mlhavé. Zkoumali jsme tak modulační aktivitu diosminu na krystalech COM. Systematické analýzy byly provedeny na různých fázích KOMledvinatvorba kamenů, včetně krystalizace, růstu krystalů, agregace, adheze krystal-buňka, internalizace do renálních tubulárních buněk a invaze prostřednictvím ECM.
Po perorálním podánídiosminjeho plazmatická hladina u lidí se pohybuje od {{0}},5 do 200 ng/ml (nebo 0,8–300 nM) [43,44]. Maximální plazmatická koncentrace (Cmax) je přibližně 50 ng/ml (nebo 85 nM) [43,44]. Proto byly dávky diosminu použité v naší studii (2,5–160 nM) ve farmakologicky relevantním rozmezí pro jeho farmakokinetiku. Vzhledem k tomu, že DMSO byl použit jako ředidlo k úplnému rozpuštění diosminu podle doporučení, DMSO byl v této studii použit jako negativní kontrola navíc ke slepé kontrole, aby bylo zajištěno, že nedochází k žádným účinkům samotného ředidla, které by mohly interferovat s interpretací dat. Ve všech testech data ukázala, že nebyly pozorovány žádné významné účinky DMSO a všechna kvantitativní data odvozená z negativní kontroly byla srovnatelná s těmi ze slepé kontroly.
Krystalizační test COM odhalil, že všechny koncentracediosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 a 160 nM) mohl snížit velikost krystalů COM, ale na druhou stranu zvýšit počet krystalů. Protože krystalová hmota je konečným produktem jak velikosti, tak počtu krystalů a je relevantnější pro vyjádření stupně krystalizace COM, hodnotili jsme, zda diosmin ovlivnil tento krystalový index. Data ukázala, že všechny koncentrace diosminu měly podpůrný účinek na hmotnost krystalů COM, což je v souladu s údaji o počtu krystalů. Po krystalizaci mohou krystaly COM dále růst do větší velikosti pro další krokledvinatvorba kamenů.
Na rozdíl od krystalizace vykazoval diosmin ve všech koncentracích inhibiční účinek na růst krystalů COM způsobem závislým na dávce. Některé předchozí studie uvádějí, že rozpustnost krystalů CaOx lze zvýšit deriváty hydroxyanthrachinonů s glykosylací [45]. Kromě toho se přítomnost cukrů v takových bioaktivních sloučeninách může vázat s volným vápenatým iontem, pravděpodobně díky hydroxylovým skupinám v molekulární struktuře, a tím inhibovat tvorbu krystalů CaOx [45,46]. Diosmin může také ovlivnit přechod solubilizovaných vápenatých a oxalátových iontů na krystalické částice COM v renální tubulární tekutině v procesu krystalizace COM založeného na tomto mechanismu.
Nicméně agregace krystalů COM byla podpořena 10–160 nMdiosmin, což implikuje schopnost diosminu působit jako spojovací nebo adhezivní molekula pro získávání jednotlivých krystalů, aby se spojily a vytvořily krystalové agregáty. Tato vazba má také za následek progresi adhezivních můstků mezi jednotlivými krystaly a může vyvolat tvorbu velké struktury krystalů COM, které snadno přispívají k ukládání kamenných nidus uvnitřledvina[32].
Retence COM krystalů prostřednictvím adheze krystalů na povrchu renálních tubulárních buněk byla stanovena jako další důležitý krok pro tvorbu ledvinových kamenů [47]. Naše data odhalila, že diosmin by mohl snížit adhezivní schopnost krystalů COM vázat se na apikální povrchy renálních tubulárních buněk MDCK. Některé předchozí studie ukázaly, že glykosaminoglykany (polysacharidové sloučeniny) potažené na krystalech CaOx nebo exprimované na renálních tubulárních buňkách mohou interferovat s adhezivní schopností krystalů CaOx na renální tubulární buňky [48]. Navíc exprese krystalových receptorů na renálních tubulárních buňkách je jedním z klíčových mechanismů určujících adhezi krystal-buňka [21]. Zatímco krystaly CaOx indukují poškození apikálních membrán, zejména mikroklků, některé polyfenoly, jako je epigalokatechin galát (EGCG), mohou zabránit adhezi krystal-buňka a poškození buněk [49]. Navíc bylo již dříve popsáno, že flavonoidy v různých rostlinných extraktech zvyšují hladinu pH moči, což vede k inhibici adheze krystal-buňka [50,51]. Možná,diosminmůže také zmírnit takové buněčné poškození vyvolané COM, a tím snížit adhezi krystal-buňka.
Bylo prokázáno, že internalizace krystalů COM se objevuje hlavně endocytózou prostřednictvím makropinocytózy zprostředkované aktinovým cytoskeletem [40]. Bylo popsáno, že flavonoidy, jako je kvercetin, ovlivňují aktinový cytoskelet nezbytný pro makropinocytózu [52,53]. Naše zjištění ukázala, že diosmin významně snížil schopnost buněk MDCK internalizovat krystaly COM. Takový inhibiční účinek diosminu může být spojen se sestavením nebo organizací aktinového cytoskeletu uvnitř buněk, který přímo ovlivňuje dráhu makropinocytózy [54,55].
Po internalizaci byly krystaly COM degradovány endolysozomy, což vedlo ke zvýšení volných kalciových a oxalátových iontů v renálním intersticiu [37]. Takové zvýšení kalciových a oxalátových iontů může vést k nekrystalizaci COM v renálním intersticiu [56,57]. Přítomnost intersticiálních krystalů COM může být navíc způsobena defekty těsného spojení a paracelulárních adhezních bariér, což vede ke zvýšené paracelulární permeabilitě a translokaci krystalů [58–60]. Tyto krystaly pak mohou přes ECM proniknout do renálního intersticia a následně spustit několik zánětlivých reakcí a poškození tkáně [58–60]. V této studii jsme pozorovali, že invaze krystalů COM přes migrační komoru ECM byla vyvolána všemi koncentracemi diosminu. Diosmin se může vázat na povrchy krystalů COM a interagovat se systémem plasminogen-plasmin, který řídí migraci krystalů v migrační komoře ECM [38,39].
Cistanche pro ledviny
Protožediosminindukovaly jak inhibiční, tak podpůrné účinky na různé různé procesy tvorby COM kamenů, proto jsme jejich vztah určili pomocí Pearsonova korelačního testu. Korelační analýza odhalila, že počet krystalů nepřímo koreluje jak s velikostí krystalu, tak s růstem krystalu (A velikost krystalu) (obr. 7A a B). Velikost krystalu silně koreluje s růstem krystalu (obr. 7C), ale nepřímo koreluje s hmotností krystalu (obr. 7D). Nakonec krystalová hmota silně koreluje jak s počtem krystalů, tak s agregací krystalů (obr. 7E a F). Z korelační analýzy data naznačují, že počet krystalů a hmotnost krystalů jsou pro vyjádření krystalizace relevantnější než velikost krystalů (obr. 7A, D a E). Kromě toho velikost neokrystalů během krystalizace souvisí s růstem předem vytvořených krystalů (obr. 7C), zatímco stupeň krystalizace (jak se odráží v počtu krystalů a hmotnosti krystalů) úzce souvisí se stupněm agregace krystalů (obr. 7E a F). Tyto korelace jsou však s největší pravděpodobností specifické pro účinky diosminu, zatímco účinky jiných modulátorů mohou nebo nemusí mít stejné korelace. Například fibronektin snižuje krystalickou hmotu a inhibuje růst krystalů, ale podporuje agregaci krystalů [31]. Kromě toho intaktní životaschopná Escherichia coli zvyšuje velikost a hmotnost krystalů, ale nemá žádný vliv na počet krystalů [33]. Tato data ukazují, že korelace mezi různými COM krystalovými testy nejsou univerzální pro všechny modulátory.
Nakonec jsme shrnuli výsledky získané z různých testů a integrovali je s patogenními mechanismyledvinakamenné onemocnění (viz schémata na obr. 8). Z korelační analýzy vyplývá, že diosmin podporuje krystalizaci (obr. 8A). Mezi krystalizací a růstem krystalůdiosminudržuje rovnováhu tím, že podporuje krystalizaci, ale na druhé straně inhibuje růst krystalů (obr. 8B). Pokud jde o všechny účinky na samotné krystaly COM (bez ohledu na buňky a ECM, které také zasahují), je podpůrná aktivita diosminu výraznější než jeho inhibiční aktivita na krystaly COM, protože podporuje krystalizaci i agregaci krystalů, ale inhibuje pouze růst krystalů ( Obr. 8C). Přestože se krystalizace zvyšuje, velikost krystalů se zmenšuje a je spojena s inhibicí růstu (obr. 7C). Tato data jsou v souladu s výsledky uváděnými Kavanaghem et al. [61–63], což ukazuje, že zvýšení krystalizace vede k poklesu přesycení vápenatých a oxalátových iontů v roztoku, a tím ke snížení růstu. Růst krystalů však není jediným faktorem určujícímledvinapatogeneze kamenů [64], zvláště když je krystalová hmota zahlcena a je spojena se zvýšením agregace krystalů (obr. 7F), která může zvýšit šanci krystalových materiálů uvíznout v malých tubulárních segmentech (v intratubulární hypotéze), čímž se zvýší možnost tvorby kamenů. Kromě toho předchozí studie ukázala, že údaje jsou v souladu s našimi zjištěními, což naznačuje, že zvýšení počtu krystalů je spojeno se zvýšením agregace krystalů a zvětšením konkrementu [63].
Obr. 7. Korelační analýza. (A)–(F): Korelace mezi počtem krystalů COM, velikostí krystalů, Δ velikostí krystalů, hmotností krystalů a počtem krystalových agregátů byly analyzovány Pearsonovým korelačním testem.
Obr. 8. Schémata shrnující modulační účinkydiosminna COMledvinaprocesy tvorby kamene. (A): Účinky diosminu na krystalizaci COM. (B): Účinky diosminu na krystalizaci COM a růst krystalů. (C): Účinky diosminu na krystalizaci, růst a agregaci COM. (D): Účinky diosminu na celý proces tvorby ledvinových kamenů COM.
Vezmeme-li v úvahu interakce s renálními tubulárními buňkami a ECM, celkový obraz duálních účinkůdiosminna COM tvorba ledvinových kamenů je mnohem jasnější (obr. 8D). Diosmin inhibuje adhezi krystal-buňka, čímž snižuje internalizaci krystalů do buněk. To lze vysvětlit tím, že menší velikost krystalů COM má menší adhezivní schopnost vázat renální tubulární buňky ve srovnání s většími, jak uvádí naše nedávná studie [34] a předchozí studie jiné skupiny [65]. Menší adhezivní schopnost menších krystalů COM je způsobena jejich menší adhezivní silou k buněčnému povrchu a menším počtem receptorů krystalů COM navázaných na ně, jak bylo stanoveno mikroskopií atomové síly a analýzou proteomu [34]. Diosmin také inhibuje internalizaci krystalů. Všimněte si, že proces internalizace je dvousečná zbraň, která vyžaduje pečlivou interpretaci. Internalizace neboli endocytóza v jednom z obranných mechanismů, které buňky využívají k eliminaci krystalů endolysozomy. Degradace intaktních krystalů však vytváří volné ionty vápníku a oxalátu, které se mohou přesunout z intracelulárního kompartmentu do renálního intersticia, kde mohou vytvářet neokrystaly [56,57]. Na druhou stranu diosmin podporuje invazi krystalů přes ECM, což je jeden z mechanismů důležitých pro patogenezi ledvinových kamenů (zejména v modelu Randallova plaku) [58–60]. Celkově obr. 8D shrnuje všechny duální modulační účinky diosminu na COMledvinaprocesy tvorby kamene. Je třeba poznamenat, že rovnováhu těchto podpůrných a inhibičních účinků nelze přesně vypočítat (na rozdíl od matematické rovnice). Kromě toho existuje několik dalších endogenních a exogenních faktorů, které mohou také zasahovat do procesů tvorby kamenů. Konečně, diosmin také vykazuje několik nepřímých účinků na tvorbu ledvinových kamenů, včetně jeho antioxidačních a protizánětlivých vlastností [5,6], které je třeba vzít v úvahu. Proto konečný výsledek těchto duálních modulačních účinkůdiosminna COMledvinatvorba kamenů vyžaduje další výzkum in vivo a prospektivní studii s velkou kohortou.
5. Závěry
V souhrnu zde uvádíme duální účinky diosminu na modulaci krystalů COM způsobem závislým na dávce. I když inhibuje růst krystalů COM, adhezi krystal-buňka a internalizaci do renálních tubulárních buněk,diosminpodporuje krystalizaci COM, agregaci a invazi prostřednictvím ECM. Proto je jeho antiurolitiázová role pochybná a je třeba dávat pozor na jeho použití při onemocnění ledvinových kamenů.
prohlášení o autorském příspěvku CRediT
Supaporn Khamchun: Konceptualizace, Metodologie, Software, Validace, Formální analýza, Vyšetřování, Kurátorství dat, Psaní – originální návrh, Vizualizace, Sunisa Yoodee: Konceptualizace, Metodologie, Software, Validace, Formální analýza, Vyšetřování, Kurátorství dat, Psaní – originální návrh, Vizualizace, Navštivte Thongboonkerd: Konceptualizace, Metodologie, Software, Validace, Zdroje, Psaní – kontrola a editace, Supervize, Administrace projektu, Získávání finančních prostředků.
Prohlášení o střetu zájmů
Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.
Poděkování
Jsme vděční za technickou pomoc Kittiya Suwannakud. Tato práce byla podpořena Národní radou pro výzkum a inovační politiku v oblasti vysokého školství (NXPO) prostřednictvím PMU-B a Thajského výzkumného fondu (IRN60W0004). VT je také podporována grantem „Chalermphrakiat“, Lékařská fakulta nemocnice Siriraj.
Reference
[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,Diosmin– izolační techniky, stanovení v rostlinném materiálu a farmaceutických formulacích a klinické použití, Nat. Prod. Commun. 8 (2013) 545–550.
[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, Metabolismus a farmakologické aktivity přírodní, zdraví prospěšné sloučeniny diosminu, Food Funct. 11 (2020) 8472–8492.
[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon: hodnocení účinků na kvalitu života u chronické žilní nedostatečnosti, Angiologie 57 (2006) 131–138.
[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Mikronizovaná čištěná flavonoidní frakce: přehled jejího použití u chronické žilní nedostatečnosti, žilních vředů a hemoroidů, Drugs 63 (2003) 71–100.
[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Protizánětlivá, antioxidační a antiapoptotická aktivita diosminu u ulcerózní kolitidy vyvolané kyselinou octovou, Hum. Exp. Toxicol. 37 (2018) 78–86.
[6] M. Berkoz, Diosmin potlačuje prozánětlivé mediátory v makrofázích RAW264.7 indukovaných lipopolysacharidy prostřednictvím signálních drah NF-kappaB a MAPKs, Gen. Physiol. Biophys. 38 (2019) 315–324.
[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin indukují apoptózu prostřednictvím modulace STAT-3 signalizace u 7,12 dimethylbenz(a)anthracenem indukované škodlivé karcinogeneze bukálního vaku, Biomed. Pharm. 83 (2016) 1064–1070.
[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, Diosminem indukovaná senescence, apoptóza a autofagie v buňkách rakoviny prsu různého stavu p53 a aktivity ERK, Toxicol. Lett. 265 (2017) 117–130.
[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, Kombinace repurponovaného léčiva diosmin s amoxicilinem-kyselina klavulanová způsobuje synergickou inhibici růstu mykobakterií, Sci. Rep. 9 (2019) 6800.
[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, Antihyperglykemický účinek diosminu, citrusového flavonoidu, je indukován prostřednictvím endogenního beta-endorfinu u diabetických potkanů typu I, Clin. Exp. Pharm. Physiol. 44 (2017) 549–555.
[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,Diosminpředléčení zlepšuje srdeční funkci a potlačuje oxidační stres v srdci potkana po ischemii/reperfuzi, Eur. J. Pharm. 736 (2014) 131–137.
[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin chrání sítnici krys před ischemickým/reperfuzním poškozením, J. Ocul. Pharm. Ther. 28 (2012) 459–466.
[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Ochranné účinky hesperidinu a diosminu proti játrům, ledvinám vyvolaným akrylamidem, a oxidativní poškození mozku u potkanů, Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 26 (2019) 35151–35162.
[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, pravidlo AD, Stanovení skutečného břemeneledvinakamenná nemoc, Nat. Rev. Nephrol. 16 (2020) 736–746.
[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Nefrolitiáza, Prim. Péče 47 (2020) 661–671.
[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Renální kameny, Ann. Clin. Biochem 56 (2019) 15–27.
[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, Složení kamenů a vaskulární kalcifikace u pacientů s nefrolitiázou, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.
[18] G. Schubert, Rozbor kamene, Urol. Res. 34 (2006) 146–150.
[19] A. Vinaiphat, S. Aluksanasuwan, J. Manissorn, S. Sutthimethakorn, V. Thongboonkerd, Odezva renálních tubulárních buněk na různé typy a dávky krystalů šťavelanu vápenatého: integrativní analýza proteomové sítě a funkční vyšetřování, Proteomics 17 (2017 ), 1700192.
[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Analýza proteinové sítě a funkční studie cytotoxicity indukované krystaly oxalátu vápenatého v renálních tubulárních epiteliálních buňkách, Proteomics 18 (2018), 1800008.
[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Nefrolitiáza: molekulární mechanismus tvorby ledvinových kamenů a kritická role modulátorů, Biomed. Res. Int. 2013 (2013), 292953.
[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Mechanismy tvorby kamene, Clin. Rev. Bone Miner. Metab. 9 (2011) 187–197.
[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, Ochranné role flavonoidů a rostlinných extraktů bohatých na flavonoidy proti urolitiáze: přehled, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 59 (2019) 2125–2135.
[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, Dietní rostliny pro prevenci a léčbuledvinakameny: preklinické a klinické důkazy a molekulární mechanismy, Int. J. Mol. Sci. 19 (2018) 765.
[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, The mechanistic insight of polyphenols in kalcium oxalate urolitiase mitigation, Biomed. Pharm. 106 (2018) 1292–1299.
[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, Hodnocení ochranných účinků diosminu (citrusový flavonoid) u chemicky indukované urolitiázy u experimentálních potkanů, Pharm. Biol. 54 (2016) 1513–1521.
[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,Diosminsnižuje ukládání oxalátu vápenatého a degeneraci tkání u nefrolitiázy u potkanů: stereologická studie, korejský J. Urol. 54 (2013) 252–257.
[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, Faktory určující typy a morfologie krystalů šťavelanu vápenatého: molární koncentrace, pufrování, pH, míchání a teplota, Clin. Chim. Acta 367 (2006) 120–131.
[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Proteomická analýza krystalem indukované cytotoxicity monohydrátu oxalátu vápenatého v distálních renálních tubulárních buňkách, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.
[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, Elongační faktor Tu on Escherichia coli izolovaný z moči pacientů s ledvinovými kameny podporuje růst a agregaci krystalů šťavelanu vápenatého, Sci. Rep. 7 (2017) 2953.
[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Modulační účinky fibronektinu na krystalizaci oxalátu vápenatého, růst, agregaci, adhezi na renální tubulární buňky a invazi přes extracelulární matrix, J. Biol. Inorg. Chem. 24 (2019) 235–246.
[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Definování a systematické analýzy agregačních indexů pro hodnocení stupně agregace krystalů šťavelanu vápenatého, Front. Chem. 5 (2017) 113.
[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum je zodpovědný za podporu účinků životaschopných Escherichia coli na krystalizaci šťavelanu vápenatého, růst krystalů a agregaci krystalů, Front. Microbiol 10 (2019) 2507.
[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Diferenciálně vázané proteiny a adhezivní schopnosti krystalů monohydrátu oxalátu vápenatého s různými velikostmi, Int. J. Biol. Macromol. 163 (2020) 2210–2223.
[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, Surface heat shock protein 90 slouží jako potenciální receptor pro krystal oxalátu vápenatého na apikální membráně renálních tubulárních epiteliálních buněk, J. Biol. Inorg. Chem. 21 (2016) 463–474.
[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, Neradioaktivní značení krystalů šťavelanu vápenatého pro výzkum interakce a internalizace krystal-buňka, Anal. Metody 2 (2010) 1536–1541.
[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, Krystaly monohydrátu oxalátu vápenatého internalizované do renálních tubulárních buněk jsou degradovány a rozpouštěny endolysozomy, Chem. Biol. Komunikujte. 246 (2016) 30–35.
[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Nový test pro hodnocení podpůrných účinků proteinů na invazi krystalů šťavelanu vápenatého přes extracelulární matrix na základě aktivity plasminogenu/plasminu, Talanta 101 (2012) 240–245.
[39] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Krystaly oxalátu vápenatého zvýšily sekreci enolázy-1 z renálních tubulárních buněk, což následně zvýšilo invazi krystalů a monocytů přes renální intersticium, Sci. Rep. 6 (2016) 24064.
[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Makropinocytóza je hlavním mechanismem pro endocytózu krystalů šťavelanu vápenatého do renálních tubulárních buněk, Cell Biochem. Biophys. 67 (2013) 1171–1179.
[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod: databáze proledvinakamenné modulační proteiny s experimentálními důkazy, Sci. Rep. 10 (2020) 15109.
[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, Účinky diosminu na poškození jater a ledvin vyvolané aflatoxiny, Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 24 (2017) 27931–27941.
[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, Srovnávací biologická dostupnost dvoudiosminformulace po perorálním podání zdravým dobrovolníkům, Molecules 23 (2018) 2174.
[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Farmakokinetika flavanonových glykosidů po požití jednotlivých dávek čerstvě vymačkané pomerančové šťávy versus komerčně zpracovaná pomerančová šťáva u zdravých lidí, J. Agric . Food Chem. 62 (2014) 12576–12584.
[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Syntéza glykosidových derivátů hydroxyanthrachinonu se schopností rozpouštět a inhibovat tvorbu krystalů šťavelanu vápenatého. Potenciální sloučeniny v terapii ledvinových kamenů, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 1001–1007.
[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Studie krému na bázi myo-inositol hexafosfátu k prevenci dystrofické kalcinózy cutis, Br. J. Dermatol. 152 (2005) 1022–1025.
[47] V. Thongboonkerd, Proteomika interakcí krystal-buňka: model pro výzkum ledvinových kamenů, Cells 8 (2019) 1076.
[48] CF Verkoelen, Krystalová retence při onemocnění ledvinových kamenů: zásadní úloha glykosaminoglykanu hyaluronanu? J. Am. Soc. Nephrol. 17 (2006) 1673–1687.
[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Microvilární poranění v renálních tubulárních epiteliálních buňkách indukované krystalem oxalátu vápenatého a ochranná role epigalokatechin-3-galátu, FASEB J. 31 (2017) 120 –131.
[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, Total flavonoids of Desmodium styracifolium zeslabuje tvorbu hydroxy- L-prolinem indukovaná kalciumoxalátová urolitiáza u potkanů, Urolitiáza 46 (2018) 231–241.
[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Systematické hodnocení účinků pH moči na krystalizaci šťavelanu vápenatého, adhezi krystal-buňka a internalizaci do renálních tubulárních buněk, Sci. Rep. 7 (2017) 1798.
[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Inhibiční účinek na fagocytózu Candida albicans vyvolaný předléčením kvercetinem prostřednictvím interference aktinového cytoskeletu, J. Tradit. Brada. Med. 33 (2013) 804–809.
[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, Quercetin inhibuje LPS-indukovanou migraci makrofágů potlačením dráhy iNOS/FAK/paxilin a modulací cytoskeletu, buněčné adheze . Migrovat. 13 (2019) 1–12.
[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, Recyklace membrán zprostředkovaná makropinocytózou řídí migraci neurální lišty dodáním F- aktinu na lamellipodium, Proc. Natl. Akad. Sci. USA 117 (2020) 27400–27411.
[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, F-aktin vázající RapGEF GflB je vyžadován pro účinnou makropinocytózu u Dictyostelium, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.
[56] A. Khan, Prevalence, patofyziologické mechanismy a faktory ovlivňující urolitiázu, Int. Urol. Nephrol. 50 (2018) 799–806.
[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, Mechanismy tvorby lidských ledvinových kamenů, Urolitiáza 43 (Suppl 1) (2015) 19–32.
[58] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Mitochondriální dysfunkce aledvinakamenná nemoc, Přední. Physiol. 11 (2020), 566506.
[59] SR Khan, Histologické aspekty modelu tvorby kamenů s pevnými částicemi: studie na zvířatech, Urolitiáza 45 (2017) 75–87.
[60] VY Bird, SR Khan, Jak se tvoří kameny? Je možné sjednocení teorií o tvorbě kamene? Oblouk. Esp. Urol. 70 (2017) 12.–27.
[61] JP Kavanagh, Metody studia krystalizace šťavelanu vápenatého a jejich aplikace při výzkumu urolitiázy, Scanning Microsc. 6 (1992) 685–704, diskuse 704-5.
[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, Kinetika krystalizace oxalátu vápenatého při různých koncentracích lidské a umělé moči, s konstantním poměrem vápníku k šťavelanu, Urol. Res. 27 (1999) 231-237.
[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, krystalurie a agregace: klíčové složky pro zvětšení kamenů, Urol. Res. 36 (2008) 11–15.
[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Reverzní inženýrství ledvin: modelování krystalizace monohydrátu oxalátu vápenatého v nefronu, Med. Biol. Ing. Počítat. 48 (2010) 649–659.
[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, Vliv intrakrystalického a povrchově vázaného osteopontinu na připojení krystalů dihydrátu oxalátu vápenatého k buňkám psí ledviny Madin-Darby (MDCK) v ultrafiltrované lidské moči, BJU Int. 109 (2012) 1100–1109.
