Objev a identifikace potenciálních antimelanogenních aktivních složek Bletilla Striata

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 a Hongjiang Chen1,2*

Abstraktní

Pozadí:Bletilla striata je hlavním lékem mnoha klasických přípravků na bělení pokožky v tradiční čínské medicíně (TCM) a v poslední době je široce používána v kosmetickém průmyslu. Jeho účinné látky jsou však stále nejasné a jeho vláknité kořeny nejsou efektivně využívány. Cílem této studie je objevit a identifikovat její potenciální antimelanogenní aktivní složky pomocí modelu zebrafish a molekulárního dokování.

Metody:Theantioxidantaktivity byly hodnoceny 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylovou (DPPH) aktivitou pohlcující radikály, 2,2′-azino-bis-(3-ethylbenthiazolin-6-sulfonovou kyselinou) (ABTS ) aktivita zachycující radikály a redukce železaantioxidantvýkon (FRAP). Anti-melanogenní aktivita byla hodnocena pomocítyrosinázainhibičníaktivitain vitro a inhibice melaninu u zebřiček. Chemické profily byly provedeny ultra-vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií v kombinaci s kvadrupólovou tandemovou hmotnostní spektrometrií s časem letu (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Mezitím byly potenciální antimelanogenní aktivní složky dočasně identifikovány molekulárním dokováním.

Výsledek:95% ethanolový extrakt z vláknitých kořenů B. striata (EFB) měl nejsilnější inhibiční aktivitu vůči DPPH, ABTS, FRAP a tyrosináze, s IC 50 5,94 mg/l, 11,69 mg/l, 6,92 mmol FeSO4/g, a 58,92 mg/l, v daném pořadí. Kromě toho EFB a 95% ethanolový extrakt z hlíz B. striata (ETB) významně snížily syntézu melaninu u zebrafishembryí v závislosti na dávce. Z EFB a ETB bylo předběžně identifikováno 39 chemických složení, včetně 24 stilbenoidů. Molekulární dokování ukázalo, že 83 (včetně 60 stilbenoidů) a 85 (včetně 70 stilbenoidů) sloučenin vykazovalo silnější vazebné afinity k tyrosináze a adenylát cykláze.

Závěr:Současná zjištění podpořila zdůvodnění použití EFB a ETB jako přírodních bělících činidel ve farmaceutickém a kosmetickém průmyslu.

Klíčová slova: Bletilla striata, Antioxidant, Anti-melanogenní aktivita, UPLC-Q-TOF-MS/MS, Zebrafish, Molecular docking

Kliknutím zobrazíte vedlejší účinky a výhody antioxidantu

Pozadí

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. F. je bylinná vytrvalá rostlina široce rozšířená v Asii, jako je Čína, Korea a Japonsko [1]. Sušená hlíza B. striata, také známá jako Baiji, poprvé zaznamenaná v Shennongově Classic of Materia Medica, byla v Číně po tisíce let široce používána jako tradiční čínská medicína (TCM). Čínský lékopis uvádí, že má schopnost svírat při hemostáze a analgezii, proto byl široce používán k léčbě hematemezy, hemoptýzy, traumatického krvácení, vředů, otoků a popraskané kůže [2, 3]. Farmakologické studie prokázaly, že B. striata má široké spektrum biologických aktivit, jako je hojení ran [4, 5], protivředové [6, 7], hemostatické [8],proti-zánět[9], antioxidant[10], antibakteriální [11], protichřipkový virový [12] a proti stárnutí [13]. Současně B. striata obsahuje různé třídy chemického složení, včetněpolysacharidy[14], bibenzyly, fenanthreny, antrachinony,flavonoidya 2-isobutylmaláty [3, 15] atd.

B. striata je hlavní lék mnoha klasických přípravků na bělení kůže v TCM [16] a v poslední době je široce používán v kosmetickém průmyslu [17]. Jeho účinné látky jsou však stále nejasné a dokonce i některé výsledky výzkumu byly opačné. Například výsledky výzkumu, které uvedl Chenet al. ukázal, že 95% ethanolový extrakt z B. striata má vyšší inhibiční aktivitu vůči tyrosináze než jeho vodní extrakt s mírou inhibice 68,36 procent in vitro[18], zatímco výsledek Huanga et al. prokázali, že inhibiční aktivita vodního extraktu B. striata na tyrosinázu byla silnější než inhibiční aktivita 95% ethanolového extraktu v rámci míry inhibice 62 procent in vitro [19]. Výsledky výzkumu Luetala[20]a Linghuetala[21] prokázaly, že jak vodní, tak 95% ethanolový extrakt B. striata, zejména jeho chloroformová frakcionace, může inhibovat růst buněk B16 a vyvolat jejich apoptózu způsobem závislým na koncentraci.

Protože in vitro testy inhibice tyrosinázy a melanomových buněčných linií nezahrnovaly složité fyziologické podmínky in vivo a absorpce, metabolismus, distribuce a vylučování testovaného vzorku, mnoho vzorků vykazovalo významnou inhibiční aktivitu proti buněčným liniím tyrosinázy a melanomu in vivo, nicméně in vivo vykazovaly slabou účinnost nebo dokonce neúčinnost [22,23]. Glabridin vykazoval významnou inhibiční aktivitu tyrosinázy s IC50 0.43μmol/l, což bylo 176krát silnější než u kyseliny kojové. Nešlo však o žádné inhibiční účinky na pigmentaci zebřiček in vivo[24].

Mezitím byly vláknité kořeny B. striata (FB) vedlejšími produkty generovanými během zpracování B. striatatuber (TB). Moderní výzkumy ukázaly, že FB obsahuje podobné sloučeniny s TB a s vyšším obsahem fenolu [25]. Navíc antibakteriální [26], antioxidační a antityrosinázové aktivity extraktu FB byly silnější než aktivity extraktu TBC [25]. Zdroje FB však nebyly efektivně využívány a byly opuštěny na zemědělské půdě, což vedlo k plýtvání FB zdroji a znečištění životního prostředí [27].

Zebřička (Danio rerio), malá tropická sladkovodní ryba, je nově vznikajícím zvířecím modelem pro farmakologii

a toxikologický výzkum in vivo s mnoha výhodami včetně nízkých nákladů, krátkého životního cyklu, vysoké průhlednosti, snadné údržby, vysoké plodnosti a požadovaného menšího počtu testovacích vzorků [28, 29]. Kromě toho má zebrafish na povrchu melaninové pigmenty, což umožňuje jednoduché pozorování procesu pigmentace, a byla široce používána v antimelanogenní studii [28, 30].

V této studii jsme porovnávali antioxidační a tyrosinázové inhibiční aktivity surového polysacharidového a 95% ethanolového extraktu TBC a FB in vitro a antimelanogenní aktivity na modelu zebrafish. Mezitím byly potenciální antimelanogenní aktivní složky dočasně identifikovány molekulárním dokováním. Zjistili jsme, že 95% ethanolový extrakt TB (ETB) a FB(EFB) má významné antioxidační a antityrosinázové aktivity a může snížit syntézu melaninu u embryí zebrafish v závislosti na dávce. ETB a EFB lze tedy použít jako přírodní bělící činidla ve farmaceutickém a kosmetickém průmyslu.

Metody

Chemikálie a činidla

Tyrosináza, 3-(3,{2}}dihydroxyfenyl)-L-alanin (L-DOPA) a arbutin byly zakoupeny od společnosti Aladdin reagent company (Shanghai, China).2,2-difenyl{{8 }}pikrylhydrazyl (DPPH), 2,2′-azino-bis-(3-ethylbenthiazolin-6-sulfonová kyselina) (ABTS),6-hydroxy-2,5,7 ,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina (Trolox) a 2,4,6-tris (2-pyridyl)-s-triazin (TPTZ) byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Acetonitril a methanol (HPLC čistota) byly zakoupeny od Tedia (Fairfield, OH, USA). Deionizovaná voda byla připravena vodním systémem Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, USA).

Postup sběru a extrakce rostlin

B. striata byla odebrána od Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd. (Quzhou, Zhejiang, Čína). Poukazové vzorky byly uloženy v Herbáři Zhejiang Pharmaceutical College (přístupové číslo 190615). Celá rostlina byla rozdělena na hlízy a vláknité kořeny. Následně byly nakrájeny na malé kousky a sušeny vakuovou lyofilizací, resp.

Vysušené a práškové vzorky (TB a FB) byly třikrát extrahovány 95% ethanolem (pokaždé 1,5 hodiny). Extrakt byl zfiltrován pomocí filtračního papíru What man (č. 1). Filtrát byl zahuštěn do sucha na rotační odparce (Hei-VAP, Heidolph, Německo) při 50 stupních a následně vysušen vakuovou vymrazovací sušárnou. Výtěžky ethanolové extrakce TB (ETB) a FB (EFB) byly 5,21 a 6,53 procenta. Drdoly byly použity k extrakci surového polysacharidu dispergováním v 80stupňové vodě po dobu 4 hodin a precipitací ethanolem [31]. Výtěžky polysacharidů TB (PTB) a FB (PFB) byly 14,75 a 6,45 procent, v daném pořadí.

extrakt z cistanche

Chemický rozbor

Chemická analýza byla provedena pomocí ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie kombinované s kvadrupólovou tandemovou hmotnostní spektrometrií s časem letu (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Chromatografická separace byla provedena na zařízení Waters Acquity UPLC (Waters Corp., Milford, MA, USA) s kolonou WatersBEH Shield RP C18 (100×2,1mm, 1,7μm) při 3{ {43}} stupně. Mobilní fáze se skládala z 0,1 procenta kyseliny mravenčí ve vodě (A) a acetonitrilu (B), s lineárním gradientem: 0–3 min, 5–16 procent B; 3–8min, 16–30 procent B; 8–10 min, 30–35 procent B; 10–15 min, 35–55 procent B; 15–18 min, 55–80 procent B; 18–19 min, 80–5 procent B; 19–20 min, 5 procent B. Průtok byl 0,3 ml/min a injekční objem byl 2 μl.

Experimenty TOF-MS/MS byly provedeny pomocí hmotnostní spektrometrie AB SCEIX Triple TOF 5600 (AB SCIEX, Foster City, CA, USA) vybavené ionizací elektrosprejem (ESI). MS detekce byla provedena metodou negativní ionizace. Parametry byly nastaveny následovně: teplota zdroje a desolvace byly 100 stupňů a 450 stupňů; průtok desolvačního plynu byl 900 l/h; kapilární napětí bylo 2kV; napětí kužele bylo 40 V; energie srážky byla 22 eV; a plné skenovací spektrum bylo od 100 do 2000 Da.

Antioxidační testy DPPH pohlcující radikálovou aktivitu

Aktivita vychytávání radikálů DPPH byla stanovena v souladu s Ali et al. s mírnými úpravami [32]. Stručně řečeno, 50 μl roztoku testovacího vzorku bylo smícháno s 150 μLDPPH ethanolovým roztokem (0,2 mM) v 96-jamkových destičkách a ponecháno ve tmě po dobu 30 minut . Absorbance směsi při 517 nm (A1) byla hodnocena spektrofotometrem pro mikrodestičky (Thermo Fisher Scientific, America). Slepý roztok bez testovaného vzorku smíchaného s roztokem DPPHethanolu byl nastaven jako pozitivní skupina (A0). Slepý roztok bez DPPH smíchaný s roztokem testovaného vzorku byl nastaven jako slepá skupina (A2). Všechny experimenty byly provedeny trojmo. Rychlost vychytávání radikálů DPPH byla vypočtena pomocí následujícího vzorce:

Míra vychytávání radikálů DPPH ( procenta ) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 procent .

Aktivita vychytávání radikálů ABTS

Kapacita vychytávání radikálů ABTS byla měřena pomocí metody popsané Ali et al. [32]. Stručně, 7mMABST vodný roztok byl smíchán s 2,45mM persíranem draselným v poměru 1:1 (obj./obj.) a inkubací při teplotě místnosti ve tmě po dobu 16 hodin, aby se získal ABST plus zásobní roztok. Zásobní roztok byl zředěn fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS), aby se upravila absorbance (0.72±0.2) při 734 nm. 20 μl testovaných vzorků v různých koncentracích bylo důkladně promícháno se 180 μl roztoku ABTS plus. Reaktivní směsi byly udržovány ve tmě po dobu 5 minut a následně byla změřena absorbance (B1) při 734 nm. Absorbance směsí bez testovaného vzorku a ABST plus byly nastaveny jako B a B, v daném pořadí. Všechny experimenty byly provedeny trojmo. Rychlost vychytávání radikálů ABTS byla vypočtena podle následujícího vzorce:

Míra vychytávání radikálů ABTS ( procenta ) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 procent .

Test antioxidační síly redukující železo (FRAP)

Redukční aktivita trojmocného železa byla stanovena podle postupů Kosakowska et al. [33]. 300mM acetátový pufr, 10mM TPTZ (2,4,6-tris (2-pyridyl)-s-triazin) a 20mM FeCl3 byly smíchány při (objem/objem/objem) poměr 10:1:1 pro přípravu pracovního činidla. 100 μl každého roztoku testovaného vzorku bylo smícháno se 100 μl pracovního činidla TPTZ, inkubováno při 37 stupních po dobu 20 minut a absorbance byla stanovena při 593 nm. Mezitím byla k přípravě kalibrační křivky použita řada standardních roztoků FeSO4 v koncentračních rozmezích 0–1000 ug/ml. Železitá redukční kapacita byla vypočtena při tvorbě intenzivního komplexu Fe2 plus -TPTZ modré. Výsledky byly vyjádřeny jako Fe2 plus antioxidační kapacita (mmol FeSO4/g extraktu).

Inhibiční aktivita tyrosinázy

Inhibiční aktivity tyrosinázy byly stanoveny spektrofotometrickou metodou s použitím L-DOPA jako substrátu [34]. Stručně řečeno, 50 μl roztoků vzorků v různých koncentracích bylo smícháno s 50 μL tyrosinázy (200 jednotek/ml, rozpuštěné ve fosfátovém pufru o pH 6,8) v 96-jamce destičky a inkubovány po dobu 15 minut při 25 stupních. Reakce byla poté zahájena přidáním L-DOPA (50 ul). Po inkubaci 30 minut při 25 stupních byla stanovena absorbance při 490 nm (Aa) pomocí multiskan sky mikrodestičkového spektrofotometru (ThermoFisher Scientific, America). Podobně byla současně detekována absorbance jamek se vzorkem bez tyrosinázy (Ab) a kontrolních jamek s enzymem, ale bez vzorku (Ab). Inhibiční aktivita tyrosinázy byla vypočtena pomocí rovnice, jak je uvedeno níže:

Míra inhibice tyrosinázy ( procenta )=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 procent.

IC50 byla vypočtena pomocí rovnice GraphPad Prism, jak je uvedeno níže:

Y=min plus (max − min)/1 plus 10(x−logIC50)× sklon kopce

X představuje koncentraci inhibitoru; Y představuje inhibiční data (procenta) spolu s jejich minimálními (min) a maximálními (max) hodnotami; Sklon kopce je faktor sklonu.

Cistanche inhibuje aktivitu tyrosinázy.

Inhibice melaninu u zebřiček

Divoké zebřičky linie AB (poskytované společností Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, provincie Zhejiang) byly umístěny v rybí vodě (0,2 procent instantní mořské soli v deionizované vodě, pH 6,9–7,2, vodivost 48{ {18}}–510 mS/cm a tvrdost 53,7–71,6 mg/l CaCO3) ve fotoperiodách 14/10 h světlo/tma při konstantní teplotě 28 ± 0,5 stupně a krmení živou žíravou garnátem dvakrát denně. Zebrafishembrya byla získána z přirozeného tření a shromážděna během 30 minut. Test zebrafish byl akreditován Asociací pro hodnocení a akreditaci péče o laboratorní zvířata (AAALAC). Tato studie byla schválena IACUC (Institutional Animal Careand Use Committee) společnosti Hunter Biotechnology, Inc. a číslo schválení IACUC bylo 001458.

Embrya ve fázi 6 hodin po oplodnění (hpf) byla ošetřena každým extraktem v šesti koncentracích (10, 30, 62,5,125, 250 a 500 mg/l) po dobu 72 hodin, aby se vyhodnotila maximální neletální koncentrace (MNLC ). Výsledkem bylo, že MNLC všech extraktů byly více než 62,50 mg/l. 10 embryí bylo umístěno do 6-jamky a byly vystaveny testovaným vzorkům v koncentracích 10 a 30 mg/l od 6 hpf do 54 hpf (48h expozice ). DMSO (0,05 procent, obj./obj.) a arbutin (10 a 30 mg/l) byly použity jako normální a pozitivní kontrola.

Synchronizovaná embrya byla odebrána a pozorována pod stereomikroskopem (SZX7, Olympus, Japonsko) vybaveným digitálním fotoaparátem (VertA1, Čína). Akumulace melaninu, přímo korelovaná s plochami pigmentace zebrafish, byla vypočtena pomocí programu GNUImage Manipulation Program (GIMP verze 2.10.2) a vyjádřena jako procento s ohledem na negativní kontrolu (akumulace melaninu 100 procent) [28, 30].

Studie molekulárního dokování

158 sloučenin izolovaných z B. striata v literatuře[2], včetně 19 glykosidů, 28 bibenzylů, 19 fenan-threnů, 18 bifenanthrenů, 23 dihydrofenanthrenů, 5 anthokyanů, 11 steroidů, 8 triterpenoidů, 12 fenolových kyselin a 10 dalších sloučenin byly použity jako ligandy. 3D struktury byly nakresleny ChemBio3D a byly optimalizovány pomocí MM2 a Autodock Tools. 3D krystalová struktura tyrosinázy (PDBID:5M8N) a adenylátcyklázy (PDB ID:5IV3) byly získány z RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Všechny molekuly vody a heteroatomy byly odstraněny z krystalových struktur pomocí Chimera a MGL Tools. Konečně Autodock

Vina byla použita k dokování receptorového proteinu s ligandy s malou molekulou. Parametry dokovacího místa receptorového proteinu byly nastaveny jako -36,700, 7,034, -19,104 a -17,467, -22,807, 2,786, v tomto pořadí, podle původního ligandu mimosinu a LRE1 [35]. Aby se dosáhlo vyšší výpočetní přesnosti, bylo generováno 20 parametrů vyčerpání pro každý receptor a konformace s nejvyšší afinitou byla vybrána jako konečná dokovací konformace a vizualizována v Pymol2.3. Mezitím byly původní ligandy mimosin a LRE1 brány jako pozitivní kontrola [36].

Predikce in silico ADMET

První 3 zásahy z B. striata měly lepší vazebnou afinitu s tyrosinázou a adenylátcyklázou, byly podrobeny analýze ADMET. QikProp v Schrodingersuite byl použit k výpočtu jejich fyzikálních vlastností a charakteristik souvisejících s léčivem, včetně molekulové hmotnosti (MW), předpokládaného rozdělovacího koeficientu oktanol/voda (QPlogPo/w), předpokládané rozpustnosti ve vodě (QPlogS), předpokládané zdánlivé Caco-2 buňky permeabilita pro střevní a krevní bariéru (QPPCaco), předpokládaný koeficient rozdělení mozku/krve (QPlogBB), předpokládaná permeabilita kůže (QPlogKp), předpokládaná IC50 pro blokádu HERGK plus kanálů (QPlog HERG) a předpokládaná lidská orální absorpce. Vlastnosti byly hodnoceny na základě Lipin-skiho pravidla pěti a literatury [37, 38].

Simulace molekulární dynamiky

Aby bylo možné prozkoumat stabilitu a dynamické fluktuace komplexu ligand-protein v simulovaném biologickém prostředí a dále ověřit výsledky dokování, byla jako ligand pro simulační studii molekulární dynamiky (MD) vybrána sloučenina blestrin D (75). výsledek molekulárního dokování. Komplex blestrinu D s tyrosinázou a adenylátcyklázou byly provedeny MD simulace a spuštěny po dobu 100 ns, s použitím vodního režimu TIP3P. Hodnoty střední kvadratické odchylky (RMSD) atomů páteře proteinu vzhledem k původní struktuře byly vypočteny za účelem zkoumání stability proteinu v průběhu simulačního období [39].

Výsledek

Chemické složení

Typické chromatogramy základního píku ETB a EFB jsou uvedeny na obr. 1. K identifikaci složek byl použit software PeakView. Molekulární vzorec byl přesně přiřazen v rámci hmotnostní chyby 10 ppm. Přesná molekulová hmotnost a fragmenty byly použity k identifikaci složek podle literatury a volné databáze chemických struktur, jako je ChemSpider a Massbank. V důsledku toho bylo z EFB a ETB předběžně identifikováno 39 chemických složení, včetně 24 stilbenoidů (bibenzyly, fenantreny a jejich deriváty), 6 glykosidů, 4 fenolové kyseliny, 3 chinony, 1 steroid a 1 další sloučenina. Současně byla provedena jejich relativní semikvantifikace měřením ploch píku každé sloučeniny v režimu MS pomocí extrahovaných iontových chromatogramů [40]. koncentrace) byly shrnuty v tabulce 1.

Antioxidační kapacita

Je dobře známo, že ultrafialové záření A (UVA) může vyvolat produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) a zprostředkovávat nadměrnou melanogenezi v kožních buňkách. Přírodní polyfenol byl inhibitorem tvorby ROS a mohl být zodpovědný za antimelanogenní aktivitu rostlinných extraktů [41 , 42]. V této studii byla tedy antioxidační kapacita hodnocena prostřednictvím DPPH, aktivity ABTS vychytávání radikálů a testu FRAPay. Výsledky (tabulka 2 a obr. 2) ukázaly, že EFB (IC50=5.94 mg/l) má nejsilnější aktivitu vychytávání radikálů DPPH in vitro ve srovnání s PTB(IC50=548.24 mg/l) , PFB (IC50=285,81 mg/l) a ETB (IC50=65,25mg/l). Podobný trend byl pozorován u testu ABTS a FRAP. 95% ethanolové extrakty TB a PB měly silnější antioxidační aktivitu in vitro než jejich surové polysacharidy. Navíc EFB vykazuje silnější antioxidační aktivitu než ETB, což bylo v souladu s výsledky předchozího výzkumu [25].

Inhibiční aktivita tyrosinázy

Tyrosináza byla klíčovým enzymem omezujícím rychlost v cestě biosyntézy melaninu a byla široce používána k identifikaci potenciálu přírodních produktů s antimelanogenetickým účinkem [43]. Výsledky (obr. 3) ukázaly, že ETB a EPB měly silnější inhibiční aktivitu vůči tyrosináze než PTB a PPB in vitro, což bylo v souladu s výsledky předchozího výzkumu [25]. EFB vykazoval silnější inhibiční aktivitu tyrosinázy v závislosti na dávce (mezi 20 a 200 mg/l) s IC50=58,92 mg/l než ETB(IC50=75,44mg/l) a pozitivní sloučenina arbutin(IC{ {11}},02 mg/l).

Inhibice melaninu u zebřiček

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), což znamená, že 0,05% DMSO vehikulum neovlivnilo produkci melaninu v embryích zebřičky. Po vystavení testovaným vzorkům a arbutinu po dobu 48 hodin však embrya zebrafish vykazovala různé stupně ukládání melaninu (obr. 3B, 4), s výjimkou skupiny PFB 10 mg/l. Je patrné, že relativní obsah melaninu ve skupinách ETB 10 mg/l (78,38 procenta) a 30 mg/l (64,72 procenta) byl významně nižší než ve skupinách PTB 10 mg/l (93,06 procenta) a 30 mg/l (82,02 procenta) (p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Molekulární dokování

Tyrosináza je enzym omezující rychlost v biosyntéze melaninu: hydroxylace tyrosinu na 3,4-dihydroxyfenylalanin (DOPA) a oxidace DOPA todopachinonu. Proto byla tyrosináza považována za kritický cíl pro vývoj inhibitorů melanogeneze [44]. Kromě toho je adenylatecykláza klíčovým enzymem cAMP-indukované melanogeneze. Vazba melanotropinového alfa polypeptidu (-MSH) na receptory MC1R vyvolala aktivaci adenylátcyklázy, zvýšení hladiny cAMP, up-regulaci exprese genu tyrosinázy a následně zvýšení syntézy melaninu [45]. Proto jsme provedli studii molekulárního dokování 158 sloučenin dříve izolovaných z B. striata [2] s tyrosinázou a adenylátcyklázou. Vazebné energie studovaných ligandů s tyrosinázou a adenylatecyklázou byly shrnuty v tabulce S1. 83 (včetně 60 stilbenoidů) a 85 (včetně 70 stilbenoidů) sloučenin vykazovalo silnější vazebnou afinitu k tyrosináze a adenylátcykláze, ve srovnání s původními ligandy mimosin (− 6,4 kcal/mol) a LRE1 (− 8,5 kcal /mol). 1,8-bis(p-hydroxybenzyl)-4-methoxyfenantren-2,7-diol (56), blestrin D (75) a 2,7-dihydroxy -1,6-bis(p-hydroxybenzyl)-4-met-oxy-9,10-dihydrofenantren (93) byly tři nejvyšší ligandy směrem k tyrosináze s vazebnou energií −10,2, 10,0 a 9,7 kcal/mol, v daném pořadí. Zatímco blestrin D(75), blestrin B (73) a 3,3′-dihydroxy-5-methoxy-2,5′,6-tris(p-hydroxybenzyl)bibenzyl (42) byly první tři ligandy k adenylátcykláze s vazebnou energií − 12,1, − 11,9 a − 11,6 kcal/mol, v tomto pořadí. Jejich teoretické vazebné afinity a interakce ligand-aminokyselina byly shrnuty v tabulce 3.

Stálo za zmínku, že blestrin D (75), bifenantrenová sloučenina, vstoupil do vazebné kapsy tyrosinázy a adenylátcyklázy (obr. 5) a vykazoval významné vazebné afinity k tyrosináze i adenylátcykláze. Van der Wallsovy interakce přispívají k celkové hodnotě energetické interakce, zatímco hydroxylová skupina vytváří vodíkové vazby s aminokyselinovými zbytky Glu 451, Arg114 tyrosinázy, respektive Val 167 adenylátcyklázy (tabulka 3 a obr. S1). Sloučenina 93 také vykazovala významné vazebné afinity směrem k tyrosináze prostřednictvím tvorby 6 vodíkových vazeb s aminokyselinovými zbytky Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 a Gln236.

Predikce in silico ADMET

Předpokládané hodnoty několika důležitých parametrů spolu s jejich přijatelným rozsahem byly shrnuty v tabulce 4. Kromě QPlogS 3,3′,5-trimethoxybibenzyl, blestrinu B a blestrinu D a QPlogBB 3,3′,{{6} } trimethoxybibenzyl, všechny ostatní vypočítané ADMET vlastnosti tří nejlepších zásahů byly v očekávaných rozmezích, mezitím QPlog HERG všech tří nejlepších zásahů byl menší než -5, což naznačuje, že byly potenciálně použitelné pro lidi. QPlog Kp všech tří nejlepších zásahů pro tyrosinázu i adenylatcyklázu, s výjimkou 3,3′,5-trimethoxybibenzylu, byly v příznivém rozmezí, což naznačuje, že tyto sloučeniny mohou snadno pronikat do kůže.

Molekulárně dynamická simulace

Graf RMSD ukázal, že hodnoty RMSD komplexu protein-ligand významně nekolísaly po celou dobu simulace. Hodnoty RMSD (obr. 6A) blestrinu D s tyrosinázou a komplexem adenylátcyklázy byly stanoveny v rozmezí od 1,5 do 2,8 Á, respektive od 2.0 do 3,6 Á. Hodnota RMSF odrážející flexibilitu každého zbytku během simulací. Zbytky s vyššími hodnotami RMSF odhalily, že jsou flexibilnější (obr. 6B). Bylo zjištěno, že hodnoty RMSF aminokyselinových zbytků v oblastech smyčky velmi kolísají. Zatímco aktivní zbytky místa si udržely malou hodnotu RMSF (méně než 1.0Å), jako jsou Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 a Arg230 v tyrosináze a Val167, Leu102, Phe45, Lys95 a Leu166 v adenylase což ukazuje, že vázací kapsy byly udržovány stabilní. Molekulární interakce blestrinu D s tyrosinázou a adenylátcyklázou byly ukázány na obr. 7.

Vazebné volné energie byly vypočteny metodou molekulární mechaniky zobecněné porodní plochy (MM-GBSA) [39]. Předpokládaná vazebná volná energie blestrinu D s tyrosinázou a adenylatecyklázou byla -96,94 kcal/mol a -139,69 kcal/mol, což znamená, že vazebné interakce byly spontánní (tabulka 5). Kromě toho příspěvky upřednostňující vazbu ligandu byly nepolární solvatační interakce, van der Waalsova a elektrostatická interakce.

Stojí za zmínku, že typů a obsahů chemických složek v EFB bylo více než v ETB. Plochy píku všech identifikovaných sloučenin v EFB byly přibližně dvojnásobné než v ETB. Mili-tarine byl nejhojnější sloučeninou v obou EFB a ETB, která měla významné antioxidační, protizánětlivé a neuroprotektivní aktivity, a byla vybrána jako chemické markery pro kontrolu kvality B. striata ve vydání Chinese Pharmacopoeia2020 [46]. Relativní plocha píku militarinu u EFB (38,39×106) byla mírně vyšší než u ETB (30,48×106). Gastrodin je dobře známá sloučenina v mnoha čínských bylinných léčivech, jako je Gastrodia elata, která vykazuje významné inhibiční účinky na tyrosinázu a vychytávání radikálů [30]. Relativní plocha píku gastrodinu v EFB (1,43 × 106) byla mírně nižší než v inETB (2,17 × 106).

95% ethanolové extrakty TB a PB měly silnější antioxidační aktivitu in vitro než jejich surové polysacharidy. Navíc EFB vykazuje silnější antioxidační aktivitu než ETB, což bylo v souladu s výsledky předchozího výzkumu [25]. Tento jev lze přičíst tomu, že EFB obsahuje vyšší hladinu antioxidačních sloučenin, jako je militarin a stilbenoidy (přírodní rostlinné polyfenoly). Například relativní plocha píku 4,8,4′,8′-tetramethoxy-[1,1′-bifenantrenu]-2,7,2′,7′-tetrolu, bifenantrenu se čtyřmi fenolickými hydroxylovými skupinami, bylo 9,15×106 na FB, zatímco to bylo 0,01×106 inTB.

V této studii PPB a PTB vykazovaly mírnou aktivitu inhibice tyrosinázy v závislosti na dávce. Ukázalo se však, že ve vodném extraktu PB (obsahuje PPB) nebyla detekována žádná aktivita [25]. Tento jev může být způsoben odlišnou přípravou vzorku. Vodný extrakt PB byl použit k vyhodnocení inhibiční aktivity tyrosinázy v Jiangově experimentu [25], zatímco v této studii byl vodný extrakt precipitován ethanolem, aby se získal surový polysacharid.

V poslední době se při hodnocení antimelanogenetického účinku in vivo široce používá model zebrafish [47, 48]. Arbu-tin, hydrochinon-glukosidová sloučenina existující v různých rostlinách, která byla komerčně používána v kosmetickém průmyslu, byl nastaven jako pozitivní kontrola. Antimelanogenetické aktivity ETB a EFB byly silnější než u arbutinu, což naznačuje, že ETB a EFB lze použít jako činidla zesvětlující pokožku v kosmetickém průmyslu.

Relativní plocha píku blestrinu D v EFB (1,91 × 106) je přibližně čtyřikrát větší než v ETB (0,46 × 10). Relativní plocha píku sloučeniny 56 (8,73 × 106) a 93 (0,64 × 106) v EFB je také významně vyšší než v ETB (méně než 0,01 × 106 a 0,10 × 106). To může být jeden z důvodů, proč EFB vykazuje silnější antimelanogenní účinky než ETB. Je zajímavé poznamenat, že tři hlavní ligandy tyrosinázy a adenylátcyklázy patří mezi stilbenoidy (bibenzyly, fenantreny a jejich deriváty). Stilbenoidy jsou přírodní rostlinné polyfenoly, které v posledních letech přitahují velký zájem kvůli jejich pozoruhodným biologickým aktivitám, jako je protizánětlivá, antimikrobiální a antioxidační aktivita [49]. Nejběžnějším stilbenoidem je resveratrol. Předchozí výzkum ukázal, že resveratrol a jeho deriváty mohou významně inhibovat katalytickou aktivitu, genovou expresi a posttranslační modifikace tyrosinázy. Ukázalo se tedy, že jsou potenciálně užitečné jako činidla zesvětlující pokožku a proti stárnutí v kosmetice [41, 50].

Cistanche se ukázal jako potenciálně užitečný jako činidla zesvětlující pokožku a proti stárnutí v kosmetice.

Pro více informací klikněte na obrázek.

Závěry

V této studii byla systematicky zkoumána antioxidační a antimelanogenní aktivita surového polysacharidu z B. striatatuber (PTB) a vláknitých kořenů (FPB) a 95% ethanolového extraktu z B. striata tuber (ETB) a vláknitých kořenů (EFB). . Výsledky ukázaly, že EFB má nejsilnější DPPH, ABTS radikálovou aktivitu a aktivitu redukující trojmocné železo. Kromě toho mohou ETB a EFB významně snížit aktivitu tyrosinázy in vitro a syntézu melaninu embryí zebřiček v závislosti na dávce. Molekulární dokování ukázalo, že existuje velké množství sloučenin, většinou náležejících ke stilbenoidům, vykazujících silnější vazebné afinity k tyrosináze a adenylátcykláze ve srovnání s vazebnou afinitou původního ligandu. Současné poznatky podpořily důvody pro použití ETB a EFB jako přírodních bělících činidel ve farmaceutickém a kosmetickém průmyslu.