Vývoj obohaceného oleje s polyfenoly extrahovanými z odpadních vod olivového mlýna, část 1

Abstraktní:Extrakce olivového oleje produkuje významné zbytkové odpadní vody z olivových mlýnů (OMW). Složení OMW se liší podle druhu oliv, stupně zralosti ovoce a způsobu extrakce (tradiční systém jednoho lisování nebo kontinuální systémy založené na odstřeďování olivové dužiny). V zemích produkujících olivy je OMW důležitý pro životní prostředí a ekonomiku a je také levným zdrojem polyfenolických sloučenin s vysokými antioxidačními vlastnostmi. Vlastnosti olivového oleje, jako jsou jeho antiaterogenní, protizánětlivé, anti-aging a imunologické modulační účinky, byly připisovány jeho polyfenolům. V této studii byla k získání polyfenolických sloučenin z OMW použita metoda extrakce bodu zákalu (CPE). Celková micelární fáze ze tří regenerací byla 24,2 procenta a celkové polyfenoly (po sonikaci) byly 50}4 mg GAE/kg. Navíc přidání polyfenolů získaných z OMW zlepšilo olivový olej a prodloužilo jeho skladovatelnost, aniž by se změnily jeho organoleptické vlastnosti. Po 0,5% obohacení micelárních disperzí došlo ke změně 42,2 procenta polyfenolů. Proto se navrhuje, že metoda CPE by mohla vést k lepšímu nakládání s odpady v průmyslu olivového oleje a zlepšit nutriční kvalitu potravinářských výrobků.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Cystanche fenylethanoidové glykosidy mají silnou schopnost vychytávání volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermií, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a dokáže vychytávat reaktivní formy kyslíku, bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý opravný účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na Anti-aging Cistanche Para Que Serve

【Další informace: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Klíčová slova: antioxidanty; extrakce bodu zákalu; potravinářský průmysl; obohacení; odpadní voda z olivového mlýna; olivový olej; polyfenoly; zotavení

1. Úvod

Poptávka po olivovém oleji celosvětově neustále roste. V oblasti Středozemního moře, která je celosvětově největší oblastí produkující olivy, vzniká obrovské množství zemědělsko-průmyslových odpadních vod z průmyslu zpracování oliv [1,2]. Zbytky odpadních vod z mlýnů na olivy (OMW) se skládají z pevného odpadu – skládajícího se z olivové dřeně – a také z tekutého odpadu – sestávajícího ze zeleniny a další vody vzniklé během dekantace. OMW má tmavě hnědou barvu (která může zčernat) a výrazné, silné aroma připomínající olivy [3]. Vedlejší produkty z mlýna na olivy mají v zemích produkujících olivy environmentální a ekonomický význam. OMW vytváří vysoké úrovně znečišťujících látek díky své vysoké organické zátěži a vysokému obsahu fytotoxických a antibakteriálních polyfenolických látek, které odolávají biologické degradaci [4]. Zpracování a likvidace OMW se stávají vážným ekologickým problémem. Země produkující olivový olej tak čelí vážné výzvě najít ekologické a ekonomicky životaschopné řešení pro manipulaci a likvidaci OMW.

Inovativní a ekologicky šetrnou technologií pro extrakci bioaktivních látek, zejména z potravin, je extrakce bodu zákalu (CPE). Jedná se o techniku, kde jsou chemické nebo biologické složky extrahovány pomocí neiontových povrchově aktivních látek, které při zahřátí na (nebo vyšší) kritickou teplotu mají tendenci se oddělovat od objemového roztoku a vytvářet mraky [5]. Povrchově aktivní látky se specificky používají jako extrakční činidla během procesu CPE. Za správných okolností extrakce probíhá při teplotě pod bodem zákalu – když se povrchově aktivní látka zakalí (tj. je méně rozpustná než původní vzorek nebo dokonce nerozpustná) – což vede k oddělení dvou fází: vodné fáze a povrchově aktivní látky. -bohatá fáze. Díky zákalovým procesům tato technika vede k předkoncentraci analytů (jako jsou polyfenoly) ve fázi bohaté na povrchově aktivní látky [6]. Dále bylo prokázáno, že sloučeniny solubilizované micelou byly chráněny před oxidací [7].

Polyfenolické sloučeniny, cukry a organické kyseliny tvoří většinu OMW. OMW má také bohaté zdroje, jako je draslík a další minerální živiny, které lze znovu využít jako hnojivo [8]. OMW by však mohl být přirozeným zdrojem antioxidantů díky vysokému obsahu polyfenolických sloučenin. Polyfenoly olivového oleje mají potenciálně prospěšné nutriční vlastnosti pro své antioxidační a biologické aktivity, jako jsou antialergické, protizánětlivé, protirakovinné a antihypertenzní [9,10]. Nízký redoxní potenciál polyfenolů, který jim umožňuje působit jako redukční činidla darováním vodíku nebo elektronů a vychytáváním volných radikálů, je základem jejich antioxidační aktivity [7].

Výrobci oleje se snaží vyrábět potravinářské produkty, které si udrží svou nutriční hodnotu a trvanlivost po delší dobu. Tyto faktory činí suplementaci antioxidantů běžnou technikou pro snížení oxidace lipidů při výrobě potravin [11]. Aby se zabránilo oxidaci v potravinách obsahujících tuky a oleje, byly jako potravinářské přísady použity syntetické antioxidanty včetně butylovaného hydroxytoluenu (BHT), terc-butylhydrochinonu (TBHQ) a butylovaného hydroxyanisolu (BHA). Bylo však odhaleno, že tyto chemické antioxidanty byly spojovány s řadou zdravotních rizik, včetně rakoviny a karcinogeneze [12].

Nedávný výzkum ukázal, že přírodní antioxidanty mohou zabránit oxidaci jedlého oleje [11–13]. Obohacení olivového oleje o polyfenolické látky může zvýšit trvanlivost olivového oleje, aniž by to ovlivnilo jeho organoleptické vlastnosti. Poměr antioxidant/prooxidant však závisí na mnoha faktorech, zejména na dávce (např. koncentraci) a načasování (např. na délce skladování) a je to velmi choulostivý proces, který lze snadno změnit [14]. V důsledku toho regenerace polyfenolických sloučenin nejen poskytuje ekonomickou příležitost, ale také snižuje environmentální zátěž odpadních vod.

Cílem této studie bylo za prvé získat polyfenolické látky z OMW pomocí metody CPE a za druhé obohatit olivový olej získanými polyfenolickými látkami. Stabilita polyfenolů je důležitým parametrem tohoto obohacení. Pro tento účel byly studovány emulgátory, jako je lecitin.

2. Materiály a metody

2.1. Materiály

V tomto šetření byl použit vzorek odpadní vody z mlýnů na olivy (Olea europaea var. Koroneiki) z regionu Preveza (Epirus, Řecko). Vzorek OMW byl konkrétně odebrán průmyslem olivového oleje, zmražen a dodán do naší laboratoře ve stejný den. Olivový olej z místního trhu v Karditsa (Thesálie, Řecko) byl použit jako matrice pro kontrolní vzorek, složený z panenského a rafinovaného olivového oleje.

2.2. Reagencie

The 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH• ) and α-tocopherol were purchased from Alfa Aesar (Karlsruhe, Germany). Sodium chloride, citric acid, lecithin of soya (>97 procent), diethylether a isooktan byly získány od Carlo Erba (Milano, Itálie). Bezvodý uhličitan sodný a hydroxid sodný byly od Penty (Praha, Česká republika). Absolutní ethanol, methanol, Folin-Ciocalteuovo činidlo a monohydrát kyseliny gallové byly od společnosti Panreac (Barcelona, ​​Španělsko). Cyklohexan a n-hexan byly od Sigma-Aldrich (Steinheim, Německo). Deionizovaná voda použitá v experimentech byla vyrobena pomocí deionizační kolony.

2.3. Extrakce polyfenolů z OMW

Byla použita metoda zvaná extrakce bodu zákalu (CPE). Metoda CPE je založena na představě, že když koncentrace povrchově aktivní látky v roztoku překročí koncentraci kritické micelární disperze, může generovat micelární disperze [6]. Obrázek 1 ukazuje experimentální kroky metody CPE. Nejprve bylo nutné vzorek rozmrazit, než bylo možné oddělit pevné látky pomocí odstředivky (Digicen 20-R, Orto Alresa, Madrid, Španělsko) po dobu 10 minut při 4500 ot./min. Po sebrání supernatantu byla přidána kyselina citrónová (50 procent), aby se pH upravilo na 3,5. Celý vzorek byl rozdělen do tří částí, přičemž do každé z nich byl přidán lecitin jako povrchově aktivní látka v koncentracích 1 procento, 3 procenta a 5 procent, v daném pořadí, spolu s 30 procenty soli. K míchání bylo použito intenzivní magnetické míchadlo. Po 20 minutách byl roztok centrifugován po dobu 5 minut při 4500 ot./min. Horní micelární (povrchově aktivní) fáze (SP) a spodní vodná (vodná) fáze (WP) byly zkoumány odděleně. V tomto okamžiku došlo k prvnímu získání polyfenolických disperzí. S vodní fází obsahující neextrahované analyty byla metoda CPE provedena ještě dvakrát za stejných podmínek (2. a 3. výtěžek). Potraviny 2023, 12, x PRO PEER REVIEW 3 of 13 Absolutní etanol, metanol, Folin-Ciocalteuovo činidlo a monohydrát kyseliny gallové pocházely od společnosti Panreac (Barcelona, ​​Španělsko). Cyklohexan a n‐hexan byly od Sigma‐Aldrich (Steinheim, Německo). Deionizovaná voda použitá v experimentech byla vyrobena pomocí deionizační kolony

2.4. Stanovení výkonnosti metody CPE

2.4.1. Celkový obsah polyfenolů

Podle Chatzilazarou et al. [15] byla k fotometrickému stanovení celkového obsahu polyfenolů (TPC) použita metoda Folin–Ciocalteu. Stručně, 0,5 g micelárních disperzí a 0,5 ml Folin-Ciocalteuova činidla bylo přidáno do 25-ml odměrné baňky. Po 3 minutách byl přidán 1 ml Na2C03 (35 procent, hmotn./hmotn.). K naplnění baněk na potřebnou úroveň objemu byla použita deionizovaná voda a poté byly uloženy ve tmě po dobu 60 minut. K měření absorpce při 750 nm byl použit spektrofotometr Shimadzu UV{12}} UV/Vis (Kyoto, Japonsko). Standardní roztoky (1–10 mg/l) byly použity k vytvoření standardní křivky kyseliny gallové. TPC byl vyjádřen jako mg ekvivalentů kyseliny gallové (GAE) na kg micelárních disperzí.

Metoda DPPH Katsoyannos et al. [16] byl s určitými úpravami použit k vyhodnocení aktivity vychytávání radikálů polyfenolů extrahovaných ve fázi povrchově aktivní látky, jakož i těch, které jsou stále přítomné ve vzorku po úpravě CPE (vodná fáze). Stručně řečeno, 1 ml, 0,1 mM roztok methanolického DPPH byl přidán ke 4 ml roztoku vzorku (500, 1000 a 2000 mg/l). Směs byla důkladně protřepána a poté byla ponechána stát při teplotě místnosti ve tmě po dobu 30 minut, přičemž byla měřena absorbance při 517 nm. Vzorec použitý ke stanovení procenta inhibice byl: procento inhibice=100 × (Akontrola – vzorek)/Akontrola, kde Akontrola a vzorek jsou absorbance. Z aktivit vychytávání (procenta) vs. koncentrace odpovídající vzorkové křivky byla stanovena IC50.

2.5. Obohacení olivového oleje o micelární disperze

Pomocí ultrazvukové sondy (Misonix Sonicator S3000, Qsonica, LLC, Newtown, CT, USA) a protokolu sonikace (75 procent energie po dobu 60, 75 a 90 minut s 0,5 pulzem cyklů), byla zkoumána redukce velikosti micelárních buněk. Metoda CPE byla použita k regeneraci micelárních disperzí, které byly poté přidány do olivového oleje pro jeho zlepšení. Pro obohacení byly použity koncentrace 0,5, 1 a 5 procent.

2.6. Analýza kvality obohaceného olivového oleje

Podle nařízení Komise (EHS) č. 2568/91 [17] byla vyvinuta metoda stanovení volných mastných kyselin (FFA) v olivovém oleji.

2.6.2. Index lomu 

K měření indexu lomu vzorku byl použit refraktometr (Quartz/Digital Abbe refractometer, Medline Scientific Limited, Oxon, UK). Přístroj byl kalibrován destilovanou vodou, která měla index lomu 1,3333 při 20 ◦C.

2.6.3. Kolorimetrie

Kolorimetr byl použit pro stanovení barvy vzorků olivového oleje (Lovibond CAM-System 500, The Tintometer Ltd., Amesbury, UK). Pro stanovení barvy CIELAB byl vzorek (25 ml) umístěn do 50ml kádinky a umístěn do kolorimetru. Byl definován psychometrický index světlosti L* a chrominanční souřadnice a* a b*. Navíc vzorec pro výpočet sytosti neboli C* byl následující: C*=[(a*)2 plus (b*)2] 1/2.

2.6.4. Spektrofotometrické vyšetřování v ultrafialovém záření

Metoda ultrafialového spektrofotometrického zkoumání byla provedena pomocí spektrofotometru podle prováděcího nařízení Komise č. 299/2013 [18].

2.6.5. Rancimatova metoda

Podle Lalase et al. [19] byla k testování oxidační stability vzorků olivového oleje použita metoda Rancimat. Přesněji řečeno, reakční nádoby Rancimat 743 (Metrhom LTD, Herisau, Švýcarsko) byly naplněny přibližně 3 g každého olivového oleje. Zvolenými parametry byla teplota 90 ◦C a průtok vzduchu 15 l/h. Bod, kdy se rychlost oxidace rychle mění a vytváří silný inflexní bod na oxidační křivce, je známý jako indukční čas a je reprezentován hodnotou indexu stability olivového oleje. Toto byla indukční doba (IP), která byla uvedena v hodinách. Tento vzorec byl navíc použit k výpočtu ochranného faktoru (PF): PF=(IP s antioxidantem)/(IP bez antioxidantu). Inhibice oxidace lipidů je indikována ochranným faktorem větším než jedna a antioxidační aktivita je zlepšena vyšší hodnotou PF.

2.6.6. Diferenční skenovací kalorimetrie

Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) měří teploty a tepelné toky spojené s přechody v materiálech jako funkce času a teploty. Tato měření zahrnují jak kvantitativní, tak kvalitativní údaje o fyzikálních a chemických změnách zahrnujících endotermické nebo exotermické procesy, stejně jako změny tepelné kapacity. K posouzení oxidační stability oleje byl použit DSC [20]. Ke zvážení 5 mg ± 0,5 mg oleje byla použita speciální hliníková pánev. Byla také přidána prázdná miska (referenční). Průtok kyslíku byl 20 ml/min a oxidační podmínky byly naprogramovány v Diamond DSC (PerkinElmer Inc., Shelton, CT, USA). Vzorek a reference byly umístěny na DSC a termogram byl zahájen při 40 ◦C po dobu 1 minuty, následně při 300 ◦C rychlostí 10 ◦C/min. Teplota počátku oxidace (Tmax) určuje počáteční teplotu oxidace.

2.6.7. Extrakce polyfenolických sloučenin z obohacených olivových olejů

Extrakce polyfenolů z olivových olejů byla provedena tak, jak je popsáno v Kalantzakis et al. [21]. Vzorky olivového oleje (1 g) byly rozpuštěny ve 2 ml n-hexanu a 2 ml roztoku 60:40 (v/v) methanol/voda. Konečný roztok byl centrifugován při 4500 otáčkách za minutu po dobu 5 minut po intenzivním míchání. Získala se frakce rozpustná v methanolu/vodě (polární) vzorků olivového oleje a použila se tak, jak byla.

2.6.8. Celkový obsah polyfenolů

Jak již bylo zmíněno, celkový obsah polyfenolů (TPC) byl stanoven metodou Folin–Ciocalteu. TPC byl vyjádřen jako mg ekvivalentů kyseliny gallové (GAE) na kg olivového oleje.

2.6.9. Aktivita na odstraňování radikálů

Metoda DPPH, jak již bylo zmíněno, byla použita k vyhodnocení aktivity pohlcování radikálů polyfenolů extrahovaných ze vzorků olivového oleje. Schopnost zachycovat radikál DPPH byla vyjádřena jako procento inhibice a IC50 byla vypočtena z vychytávacích aktivit (procenta) vs. koncentrace odpovídající křivky vzorku.

2.7. Statistická analýza

Výsledky jsou uvedeny pro průměr a standardní odchylku (SD) tří současných testů. Pomocí statistického softwarového balíku IBM SPSS Statistics (verze 26) (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) byla provedena jednocestná ANOVA, aby se určilo, zda existují nějaké statisticky významné rozdíly mezi středními hodnotami. Byla použita významná úroveň p < 0,05.

3. Výsledky a diskuse

3.1. Regenerace polyfenolů

Byla provedena vodná fáze koncentrace lecitinu, kde byl stejný postup použit pro izolaci polyfenolů. Vzhledem k nízké koncentraci lecitinu 1 procento nevznikla žádná povrchově aktivní micela. Na druhé straně, když byla vysoká koncentrace 5% lecitinu, snížilo to jejich rozpustnost ve vodě a vedlo k vytvoření dvou fází. Jak ekvilibrační teplota (45 ◦C), tak obsah soli (30 procent) byly konstantní (třetí výtěžek). Celková micelární fáze tří výtěžků je vyjádřena pomocí sloupce Total SP (obrázek 2).

Kromě toho byly ke zkoumání zmenšení velikosti micel použity postupy sonikace (75procentní energie energie po dobu 60, 75 a 90 min s pulzním cyklem 0,5) s ultrazvukovou sondou. Nakonec bylo k oleji přidáno 0,5 procenta polyfenolových disperzí získaných metodou CPE, aby se zlepšil. Tento výsledek lze vysvětlit Víctor-Ortega et al. [22], kteří zjistili, že solubilizace fenolických sloučenin na micelách povrchově aktivních látek se při vyšších koncentracích povrchově aktivních látek nasytila ​​a retence polyfenolů se snížila. Kromě toho, podle Sliwa a Sliwa [23], když je koncentrace surfaktantu pod kritickou micelární koncentrací (CMC), je rozpustnost účinné látky nízká.

V Katsoyannos et al. [24] studie, kdy bylo aplikováno 6 procent povrchově aktivní látky Triton X‐114, technika CPE v OMW (po odstranění mastných sloučenin) poskytla výtěžnosti vyšší než 60 procent. V jiné studii Gortzi et al. [25] ukázali, že při použití jednoduchého a následného CPE dosáhla celková výtěžnost fenolu z OMW s různými koncentracemi Genapolu X‐080 (2, 5 a 20 procent, v/v) až 89,5 procenta. Navíc Katsoyannos et al. [16] použili dvoukrokový CPE s 5 procenty plus 5 procenty Tween 80, aby získali až 94,4 procenta celkových fenolů z OMW. Konečně v Alibade et al. [6] studie, lecitin byl použit jako povrchově aktivní látka, zatímco CPE byl použit k regeneraci fenolických sloučenin z odpadu z vinného kalu (WSL). Fáze bohaté na povrchově aktivní látky vykazovaly silnou antioxidační aktivitu. Jejich zjištění ukazují, že CPE a lecitin lze využít k úspěšné separaci polyfenolů z WSL.

3.2. Obohacení olivového oleje o polyfenoly z odpadních vod olivového oleje

Změna v organoleptických vlastnostech micelárních disperzí byla pozorována po 0,5 % w/v obohacení (zákal). Tato modifikace vedla ke konečnému výběru 3% obohacení lecitinem. Pro dosažení lepších výsledků bylo první zotavení kombinováno s druhým a třetím. Navíc se sonikace osvědčila při snižování micelárních disperzí. Olejový systém reagoval negativně na množství 1 procento a 5 procent. Po několika hodinách obohacení byla ve vzorcích oleje vidět sraženina.

Počáteční vzorek byl podroben metodě CPE, která způsobila pokles koncentrace polyfenolu z 3448 mg na 346 mg GAE/kg (obrázek 3). Na molekulární úrovni umožnilo snížení počtu vodíkových vazeb mezi polyfenoly a vodou zabudování polyfenolů do micely na úkor její solubilizace [26]. Micely byly poté ošetřeny sonikací a methanolem, aby se extrahovaly polyfenoly, čímž se zvýšil obsah polyfenolu na 1562 mg GAE/kg. Konečná koncentrace polyfenolů byla 504 mg GAE/kg (po sonikaci), což ukazuje, že pokles micelární disperze má za následek pokles koncentrace celkových polyfenolů [27]. Navíc prodloužená doba působení ultrazvuku způsobuje, že se částice rozpouštějí v rozpouštědle, čímž se snižuje hodnota TPC [28].

【Další informace: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】