Stanovení echinakosidu ve vodním extraktu Cistanche Herba pomocí HPLC

Abstraktní:

Cíl Metoda HPLC byla vytvořena prostanovení echinakosiduvvodní extrakt z Cistancheherba.

Metody Echinakosid byl stanoven pomocí HPLC. Separace byla provedena na koloně Inertsil ODS-SP C18 s mobilní fází sestávající z acetonitrilu (A) a 0,4% roztoku kyseliny fosforečné (B), gradientovou elucí. Detekční vlnová délka byla nastavena na 333 nm a teplota kolony byla 30 stupně. Průtok byl 1,0 ml·min-1 a injekční objem byl 10 μl. Výsledky Lineární vztah echinakosidu v rozmezí koncentrací 44.{11}}.276 4 ug ·mL- 1 byl dobrý(r=0.999 8). Výtěžnosti byly 94,59 %-105,31 % (RSD= 2,93 %, n=9). Obsah echinakosidu ve vodních extraktech z Cistanche herba byl 15,527, 7,347, 12,267 mg·g-1. Závěr Zavedená metoda HPLC s dobrou opakovatelností je přesná, jednoduchá a proveditelná. Je vhodný pro stanovení echinakosidu ve vodním extraktu Cistanche herba.

Klíčová slova:HPLC;vodní extrakt z Cistanche herba; echinakosid; určení obsahu

Cistanche deserticola je tonikum tradiční čínské medicíny běžně používané v klinické praxi a je známé jako „pouštní ženšen“ [1]. Cistanche deserticola zaznamenaná ve vydání čínského lékopisu z roku 2015 je sušený dužnatý stonek se šupinatými listy Cistanche deserticola YC Ma nebo Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Je teplá, sladká i slaná a vrací se do meridiánů ledvin a tlustého střeva. Má účinky vyživování jangu ledvin, doplnění esence a krve a zvlhčení střev a projímadla [2]. "Shen Nong's Materia Medica," říká, že může "tonizovat střed, vyživovat pět vnitřních orgánů, posilovat jin a vyživovat esenci". Cistanche deserticola obsahuje především fenylethanoidní glykosidy, iridoidy a jejich glykosidy, lignany a jejich glykosidy, polysacharidy, esterové sloučeniny a alkaloidy [3]. Fenylethanolové glykosidy jsou hlavními účinnými složkami Cistanche deserticola. Mezi nimi jsou echinacosid a verbascosid uvedeny v Cistanche deserticola v čínském lékopisu.

Indikativní složky pro identifikaci a stanovení obsahu. Farmakologické studie [4] ukazují, že Cistanche deserticola má různé farmakologické účinky, jako je projímadlo, ochrana jater, antiosteoporóza, antioxidant, stárnutí a únava. Vodný extrakt Cistanche deserticola může podporovat expresi genu kostního morfogenetického proteinu 2 v krysích osteoblastech, kyselou fosfatázu rezistentní na tartrát, osteokalcin v séru myší po ovariektomii a geny Smad1, mad5, transformační růstový faktor- atd. v kostní dřeni. , má účinky proti osteoporóze [5-6].

Echinacea může podporovat proliferaci osteoblastů a podporovat diferenciaci mezenchymálních kmenových buněk kostní dřeně kultivovaných in vitro na osteoblasty [7-9]. V posledních letech se objevilo mnoho výzkumných zpráv o stanovení obsahu echinakosidu a verbascosidu v etanolovém extraktu Cistanche deserticola a jeho složených přípravcích [10-12], ale existuje jen málo zpráv o stanovení obsahu složek indexu v Cistanche deserticola vodný extrakt. V této studii byla ke stanovení obsahu echinaceasidu ve vodném extraktu z Cistanche deserticola použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC).

1 materiál

1.1 Nástroje

LC-20AT vysokoúčinná kapalinová chromatografie, SPD-20A detektor, SIL-20autosampler, CTO-10ASvp kolonová pec, LC roztoková kapalinová chromatografie, Shimadzu Corporation of Japonsko; MES125P-OCE-DU elektronické analytické váhy, Sartorius Company, Německo; SHZ-D (Ⅲ) cirkulační vodní víceúčelová vakuová pumpa, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; Cirkulační systém chlazení rotačního výparníku RC2B SO25, rotační výparník RV 10 D S96, společnost IKA, Německo; DK-S26

Elektrická vodní lázeň s konstantní teplotou, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; Stroj na ultračistou vodu řady UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Léčivé materiály a činidla

Léčivý materiál Cistanche deserticola byl zakoupen od Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., číslo šarže: 1801001, 1806001, 181001. Tu Xingming, hlavní tradiční čínský lékárník ve Třetí přidružené nemocnici Guangzhou University of Chinese Medicine, jej identifikoval jako sušený dužnatý stonek se šupinatými listy Cistanche deserticola YCMa. Vzorek je uložen ve zkušebně léků Třetí přidružené nemocnice Guangzhou University of Chinese Medicine; Referenční látka Glycoside Echinacea, obsah 89,7 %, China Institute of Food and Drug Control, číslo šarže: 111670-

201706; acetonitril je chromatograficky čistý (Merck, Německo); methanol a kyselina fosforečná jsou analyticky čisté (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); voda je ultračistá voda.

2 Metody a výsledky

2.1 Příprava vodního extraktu z Cistanche deserticola

Vezměte hrubý prášek léčivého materiálu Cistanche deserticola, přidejte 10násobek množství destilované vody, zahřejte a pod zpětným chladičem pro extrakci dvakrát, pokaždé 1 hodinu, přefiltrujte, filtrát spojte a filtrát zakoncentrujte na rotační odparce na obsah surové drogy 0,100 g·mL-1 a skladujte ji při 4 stupních pro pozdější použití.

2.2 Chromatografické podmínky a vhodnost systému

Chromatografická kolona: Inertsil ODS SP C18 kolona (150 mm x 4,6 mm, 5 μm); mobilní fáze: acetonitril (A)-0,4% roztok kyseliny fosforečné (B), gradientová eluce: 0 ~ 5 min, 17%

A; 5 ~ 25 min, 20% A; 25 ~ 30 min, 17 % A; detekční vlnová délka: 333 nm; teplota kolony: 30 stupňů; průtok: 1,0 ml·min-1;

Objem nástřiku: 10 μL. Za těchto chromatografických podmínek je separace mezi píky echinakosidu a sousedních složek větší než 1,5 a počet teoretických pater založených na píku echinaceasidu by neměl být menší než 4, 000. Chromatogram je na obrázku 1.

2.3 Příprava roztoku

2.3.1 Roztok referenční látky Odvažte vhodné množství referenční látky echinacosidu, přesně ji zvažte, vložte do odměrné baňky o objemu 10 ml, přidejte methanol, aby se rozpustil, a připravte roztok referenční látky obsahující 898,794 ug echinaceaside na ml, 4 stupně Uschovejte pro pozdější použití.

2.3.2 Zkušební roztok

Přesně odměřte 2.0 ml vodného extraktu Cistanche deserticola, odpařte do sucha ve vodní lázni, přidejte methanol, aby se rozpustil, zřeďte na objem v 10 ml odměrné baňce, dobře protřepejte a přefiltrujte získat 0,22 μm mikroporézní membránu.

2.4 Zkoumání lineárního vztahu

Přesně změřte {{0}},25, 0,50, 1.00, 2.00, 2,50, 3.00 ml referenčního roztoku podle bodu 2.3.1, umístěte jej do 5ml odměrné baňky, přidejte methanol na doplnění objemu a dobře protřepejte, abyste získali gradientovou koncentraci 44.{17} }, 89.{19}}. 179.758 8, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL-1 referenční roztok, filtrován přes 0,22 μm mikroporézní membránu. Změřte podle chromatografických podmínek podle bodu 2.2 a zaznamenejte plochu píku. Proveďte lineární regresi s hmotnostní koncentrací referenční látky jako úsečkou (X, ug·mL-1) a plochou píku jako ordinátou (Y) a získáte regresní rovnici: Y=13 185 .0X-32 273.0, r=0.999 8. Výsledky ukazují, že echinacea má dobrý lineární vztah v rozmezí koncentrací 44.{41}} ~ 539.276 4 ug·mL-1.

2.5 Zkouška přesnosti

Vezměte 539.276 4 ug ·mL- 1 referenčního roztoku, vstříkněte a měřte 6krát kontinuálně podle chromatografických podmínek podle bodu 2.2 a zaznamenejte plochu píku. Výsledky ukázaly, že RSD oblasti píku echinakosidu bylo 1,81 %, což ukazuje na dobrou přesnost přístroje.

2.6 Test stability

Přesně odměřte 2.0 ml vodného extraktu Cistanche deserticola, odpařte do sucha ve vodní lázni, přidejte methanol, aby se rozpustil, nařeďte na 10 ml odměrnou baňku, dobře protřepejte, přefiltrujte přes {{ 7}}.22 μm mikroporézní membrána, dodržujte chromatografické podmínky podle bodu 2.2 a umístěte na 0 a 2, v tomto pořadí. , 4, 8, 12, 24 h měření injekce, zaznamenejte plochu píku. Výsledky ukázaly, že RSD plochy píku echinakosidu bylo 1,16 %, což ukazuje, že testovaný roztok měl dobrou stabilitu během 24 hodin.

2.7 Zkouška opakovatelnosti

Přesně odměřte 2,{1}} ml vodního extraktu Cistanche deserticola a připravte paralelně 6 testovacích roztoků podle metody v 2.3.2. Nastříkněte vzorky pro měření podle chromatografických podmínek podle bodu 2.2 a zaznamenejte plochu píku. Výsledky ukázaly, že ŘSD zechinakosidhmotnostní koncentrace byla 1,28 %, což ukazuje na dobrou opakovatelnost metody.

2.8 Test obnovy vzorku

Přesně odměřte 9 porcí 1.0 ml vodního extraktu Cistanche deserticola, přidejte 0,8, 1.0 a 1,2 ml referenčního roztoku (1,552 mg·mL{{11 }}), odpařit do sucha ve vodní lázni, přidat methanol k rozpuštění a upravit do 10ml odměrné baňky; Dobře protřepejte a přefiltrujte přes 0,22 μm mikroporézní membránu, abyste připravili testovací roztoky s vysokou, střední a nízkou koncentrací. Připravte paralelně 3 kopie každé koncentrace. Změřte podle chromatografických podmínek podle 2.2. Zaznamenejte plochu píku a vypočítejte výtěžnost vzorku. Hodnotit. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

2.9 Stanovení obsahu vzorku

Přesně odměřte 3 porce 2.0 ml vodného extraktu Cistanche deserticola, odpařte do sucha ve vodní lázni, přidejte methanol, aby se rozpustil, zřeďte do 10 ml odměrné baňky, dobře protřepejte a přefiltrujte 0,22 μm mikroporézní membránu a měřte podle chromatografických podmínek podle 2.2. Zaznamenejte plochu píku a vypočítejte obsah echinaceaside. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 1 Výsledky testů výtěžnosti echinakosidu

Tabulka 2 Výsledky stanovení obsahu echinakosidu ve vodním extraktu Cistanche herba