Sestavení transkriptomu De Novo a objevení genu Cistanche Deserticola Fleshy Stem-Ⅱ

Funkční klasifikace všech vyjádřených transkriptů na základě genové ontologie a KEGG databází

Anotace genové ontologie (GO) byla získána z anotačního souboru UniProt a asociačního souboru identit. Celkem bylo k 1745 funkčním termínům přiřazeno 20 907 transkriptů, což představuje 32,69 % z celkových exprimovaných sekvencí. Z celkových funkčních termínů GO tvořily přiřazení k biologickému procesu většinu (1 116, 63,95 %), dále buněčná složka (329, 18,85 %) a molekulární funkce (300, 17,20 %). Přiřazené funkce exprimovaných transkriptů pokrývaly širokou škálu kategorií GO a 10 nejlepších GO termínů s nejvíce anotovanými transkripty bylo uvedeno v tabulce 3. Poskytujeme distribuci všech exprimovaných transkriptů ve třech kategoriích genové ontologie (molekulární funkce, buněčná složka a biologický proces) v doplňkovém souboru (S3 Dataset). Termíny GO související s vazebnými funkcemi a aktivitou transferázy byly převážně zastoupeny v kategorii molekulárních funkcí. Co se týče vazebných funkcí, nejhojnější byla vazba kationtů (4 394 transkriptů), následovaná nukleotidovou/nukleosidovou vazbou (v průměru 3 404 transkriptů) a vazbou na proteiny (2 422 transkriptů). Zatímco ve skupině s transferázovou aktivitou je nejvíce těch s přenášejícími skupinami obsahujícími fosfor (2 256 transkriptů, 65,77 %). V kategorii buněčných komponent byly transkripty více lokalizovány intracelulárně (průměrně 10 581 transkriptů), zatímco v kategorii biologických procesů byly transkripty více zapojeny do metabolického procesu biopolymeru (v průměru 6 683 transkriptů), následovala regulace buněčného procesu (4 841 transkriptů ), genová exprese (4 678 transkriptů) a transport (3 512 transkriptů).

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO PREVENCI ALZHEIMEROVÉ NEMOCI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Pro dolování genů zapojených do biosyntézy ligninu a PhG bylo prohledáno 21 358 neredundantních potenciálních proteinových sekvencí oproti genovým sekvencím 13 rostlinných organismů v databázi KEGG a byly přiřazeny k 275 KEGG drahám s alespoň 5 zásahy. Top 10 drah s nejvíce zarovnanými sekvencemi je uvedeno v tabulce 4. Většina drah byla zapojena do primárních metabolických procesů, jako je metabolismus aminokyselin nebo proteinů (ko01230, ko04141 a ko04120), metabolismus sacharidů (ko01200 a ko00500) a metabolismus nukleotidů nebo metabolismus nukleosidů (ko03018, ko00230 a ko00240). Kromě toho existuje 27 sekundárních drah souvisejících s metabolismem (obr. 2), jako je biosyntéza terpenoidní páteře, biosyntéza fenylpropanoidů, biosyntéza karotenoidů, biosyntéza isochinolinových alkaloidů a biosyntéza tropanu, piperidinu a pyridinových alkaloidů. Tyto výsledky poskytují další indikaci, že v ní probíhaly aktivní metabolické procesyC. deserticolakmenová tkáň. Všechny exprimované transkripty spojené s KEGG drahami byly uvedeny v doplňkovém souboru (S4 Dataset). Ačkoli existují některé významně změněné cesty mezi C. deserticola a jinými rostlinami, jako je rýže (S5 Dataset), naším hlavním cílem v této studii je odhalit celý transkriptomový profil stonku C. deserticola a zobrazit související cesty biosyntézy PhGs které by mohly být užitečné pro vedení kultivace.

Kandidátské geny kódující enzymy zapojené do biosyntézy ligninu

Lignin je druhý nejrozšířenější přírodní suchozemský polymer v rostlinné říši, tvoří až jednu třetinu materiálu nacházejícího se ve stěnách rostlinných buněk. Jako důležitá složka buněčných stěn pomáhají ligniny transportu vody, poskytují mechanickou podporu a strukturální integritu a chrání proti patogenům a býložravcům. Tyto role ligninu jsou velmi cenné při podpoře podzemního erektivního růstu C. deserticola v poušti. V této studii jsme prezentovali kompletní obraz drah biosyntézy ligninu u C. deserticola (obr. 3), ve kterých jsou ligninové monomery biosyntetizovány z fenylalaninu řadou enzymatických reakcí, včetně hydroxylace, methylace, redukce a oxidativní polymerace. Enzymy související s biosyntézou ligninu byly detekovány u tří převážně syntetizovaných forem ve vaskulární tkáni (p-hydroxyl-fenyl (H), guaiacyl (G) a syringyl (S) lignin) a 5-hydroxyl-guaiacyl lignin, který byl pouze identifikován v COMT (kyselina kávová 3-O-methyltransferáza, EC 2.1.1.68) deficitních (jako jsou knock-down) rostliny.

Fenylalanin-ammonia-lyáza (PAL, EC 4.3.1.24) je prvním klíčovým enzymem v dráze biosyntézy ligninu (obr. 3), který přeměňuje fenylalanin na kyselinu skořicovou neoxidační deaminací. Celkem bylo sekvenováno 6 297 PAL čtení a 7 PAL transkriptů bylo sestaveno v C. deserticola (tabulka 5). Porovnáním podobnosti sekvencí jsme zjistili, že 4 z nich (comp28550_c1_seq1/2/3/5) měly více než 95% podobnost se známou sekvencí mRNA C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), zatímco comp28550_c1_seq4 a comp25940_c0_seq1 měly 77% a 82% podobnosti. Predikce ORF odhalila, že 5 transkriptů mělo potenciál kódujících proteiny a neslo je doména lyázy aromatických aminokyselin (PF00221.14). Mezi nimi pouze transkript comp{33}}c1_seq4 mohl kódovat kompletní proteinovou sekvenci 718 aminokyselinových zbytků. Bylo hlášeno, že PAL byl kódován malou multigenovou rodinou ve většině rostlinných druhů, jako jsou 4 v Arabidopsis thaliana, 5 v Populus trichocarpa, 3 v Scutellaria baicalensis a 7 Cucumis sativus atd. Naše fylogenetická analýza naznačila, že tam byly 4 PAL-kódující geny v C.

deserticola a pojmenovali jsme je CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 a CdPAL4 (obr. S2). 4-kumarát-CoA ligáza (4CL, EC 6.2.1.12) a trans-cinnamátová 4-monooxygenáza (CYP73A, EC 1.14.13.11) jsou dva enzymy zodpovědné za přeměnu kyseliny skořicové na dikumarol-CoA dvěma obrácenými postupy objednávky. Jsou také v páteřích a jejich hodnoty FPKM exprese jsou 39,57 a 51,93.

Čtyři typy ligninů byly biosyntetizovány různými cestami, které byly řízeny třemi klíčovými enzymy, cinnamoyl-CoA reduktázou (CCR, EC 1.2.1.44), šikimát o-hydroxycinnamoyltransferázou (HCT, EC 2.3.1.133) a ferulátem{{1{ {56}}}} hydroxyláza (F5H, EC 1.14.-.-). CCR byl popsán jako kontrolní bod ligninové dráhy [50, 51], která katalyzovala X-CoA (X včetně dikumarolu, caffeoylu, feruloylu, 5-hydroxyl-feruloylu a sinapoylu) na Y-aldehyd (Y včetně p -cougar, caffeoyl, coniferyl, 5-hydroxyl-coniferyl a snap), zatímco HCT katalyzoval p-kumaroyl-CoA na kyselinu p-kumaroylshikimovou/kyselinu p-kumaroylchinovou. Tyto dva enzymy, stejně jako přepínač, regulovaly biosyntézu P-hydroxyl-fenyl ligninů nebo dalších tří typů ligninů. F5H byl další přepínač větve, který reguloval syringyl lignin a 5-hydroxyl-guaiacyl lignin. Mezi další důležité enzymy patří 3-O-methyltransferáza kyseliny kávové (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-methyltransferáza (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) a cinnamyl-alkohol dehydrogenáza (CAD, EC 1.1.1.199). ) byly také detekovány vyjádřené. Podrobné informace o expresi jsou uvedeny v tabulce 6. Tyto enzymové geny identifikované v této studii poskytnou cenný zdroj pro funkční genomické studie v této důležité léčivé rostlině. 10 genů souvisejících s dráhou biosyntézy ligninů v tabulce 6 bylo vybráno pro ověření RT-qPCR pro potvrzení našich výsledků RNAseq (obr. 4) a jejich vysoké korelace (Pearsonův korelační koeficient: 0,90343) indikovaly vysokou přesnost a reprodukovatelnost naší analýzy transkriptomu. Dataset S1 uvádí sekvence primerů použité v této analýze.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kandidátské geny kódující enzymy zapojené do biosyntézy PhGs

Fenylethanoidní glykosidy (PhGs) jsou známy jako primární aktivní složky v C. deserticola s aktivitami zlepšujícími sexuální potenci, zachycujícími volné radikály a proti stárnutí. Tři chemické složky PhG jsou organická kyselina, sacharid a fenyletanol aglykon (obr. 3). Organické kyseliny včetně kyseliny kávové, kyseliny ferulové a kyseliny kumalové jsou produkty dráhy biosyntézy fenylpropanoidů. Složky sacharidů včetně glukózy a rhamnózy jsou produkty metabolických drah uhlohydrátů, jako je metabolismus škrobu a sacharózy, metabolismus cukrů aminů a nukleotidů, metabolismus fruktózy a manózy atd. Cesta biosyntézy fenyletanolové části však zatím není jasná. Zde jsme na základě našich sekvenčních dat navrhli dvě možné cesty biosyntézy fenylethanolu. Jedním z nich je uváděná dráha kyseliny kávové nebo kyseliny ferulové, také známá jako dráha kyseliny skořicové, která je podobná dráze páteře biosyntézy ligninu. Další je založena na metabolické dráze fenylalaninu (obr. 3), ve které bylo přeměny fenylalaninu na fenylethanol dosaženo známou „Enrlichovou cestou“, která byla poprvé nalezena v kvasinkách před sto lety a ověřena v květech petúnie, rajčat a růže. Čtyři enzymové geny kódující aspartát/tyrosinaminotransferázu, histidinfosfátaminotransferázu a primární aminooxidázu, které jsou zodpovědné za konverzi fenylalaninu na fenylethanol, byly detekovány exprimovány ve stonku C. deserticola. Produkt fenylethanolu může být dále oxidován monooxygenázou nebo methylován methyltransferázou na své deriváty (fenylethanolaglykon), které se účastní biosyntézy PhG. V souhrnu byly navrženy dvě předpokládané cesty biosyntézy fenyletanolového aglykonuC. deserticolaale stále potřebuje další studium.

Diskuse

V posledních letech se rostlinná genomika rychle rozvíjela s aplikací technologie sekvenování nové generace, zatímco jen málo výzkumů bylo zaměřeno na genomiku pouštních léčivých rostlin. Je naléhavě nutné provést genomický nebo transkriptomický výzkum, abychom porozuměli jeho přizpůsobení se suchu a slanému prostředí a biosyntéze hlavních bioaktivních složek. De novo objev transkriptomu pro některé lékařské rostliny,

jako Panax ginseng, Ginkgo biloba a Glycyrrhiza uralensis byly poprvé využity pomocí platformy Roche 454 pro její dlouhou délku čtení. Kvůli efektivní schopnosti sestavení s krátkými čteními, zejména výhodnými čteními na párovém konci, bylo sekvenování a sestavení transkriptomu na bázi Illumina také široce používáno pro modelové a nemodelové organismy. V této studii jsme vygenerovali asi 8G 101 bp čtení párového konce a vytvořili delší unigenové sekvence s průměrnou délkou 725 bp. Data transkriptomů specifických pro kmeny ve velkém měřítku by mohla poskytnout užitečná referenční data a mohla by být použita k těžbě sekundárního metabolismu bioaktivních složek C. deserticola. 81,62 % z celkového počtu nezpracovaných čtení prošlo před sestavením filtry přísné kvality (včetně oříznutí adaptéru a vyřazení nekvalitních čtení), což naznačuje vysokou kvalitu našich sekvenčních dat, a 82,08 % vysoce kvalitních čtení bylo užitečných pro sestavení. Další čtení, která se nepodařilo použít pro sestavení, mohou pocházet z chyb sekvenování, parametrů sestavení a spol. Tyto nepoužité vysoce kvalitní čtení zůstaly užitečné při zlepšování sestavy de novo v kombinaci s delšími čteními z jiné platformy (jako je Roche 454) v budoucnu.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Velké množství sestavených transkriptů (30 098) vykazovalo vysoké sekvenční podobnosti se známými geny ve veřejných databázích, což naznačuje, že naše data o párovém konci na bázi Illumina pokrývala podstatnou část transkriptů C. deserticola. Transkripty bez BLAST hitů mohou být způsobeny 3' nebo 5' netranslatovanými oblastmi, nekódující RNA nebo novými genovými sekvencemi C. deserticola. Exprimované transkripty byly anotovány do širokého rozsahu kategorií GO a KEGG drah (tabulky 3 a 4), ve kterých bylo mnoho transkriptů přiřazeno k sekundárním metabolickým drahám. Jak víme, fenylpropanoid může fungovat jako indukovatelná antimikrobiální sloučenina s velkým přínosem pro podzemní životní styl [1] a kromě své léčebné užitečnosti také působí jako signální molekula při interakcích rostlina-mikrobi [68, 69]. Terpenoid se používá k biosyntéze bioaktivních složek (jako je 6- deoxykatalpol) [70]. Zjistili jsme, že geny podílející se na dráze biosyntézy fenylpropanoidů a terpenoidů byly vysoce hojné v C. deserticola. Ještě důležitější je, že objev dobře zastoupených drah biosyntézy ligninu (obr. 3) ukázal na aktivní metabolický proces ligninu ve stonku C. deserticola. Všechny známé enzymové geny podílející se na biosyntéze ligninu (obr. 3) byly detekovány exprimovány a čtyři klíčové enzymy včetně PAL, CCR, HCT a F5H měly nižší míru exprese (FPKM 26,47, 3,89, 3,4 a 3,83). jiné enzymové geny (tabulka 6). Zda by změna exprese těchto tří genů mohla nebo nemohla ovlivnit produkci ligninu v C. deserticola, si zaslouží další studium. PAL je klíčovým enzymem v biosyntéze ligninu a účastní se také biosyntézy fenylpropanoidu, resveratrolu, flavonoidu a kumarinu [71–74]. Detekovali jsme čtyři odlišné geny PAL v genomu C. deserticola (obr. S2), který se shodoval s tím, že PAL byl kódován malou multigenovou rodinou [39, 43, 45–49] a dále jsme dokázali, že může hrát důležitou roli v metabolickém toku uhlíku. .

PhG je primární aktivní složkou C. deserticola. Pro kvalitu C. deserticola jsou důležité geny podílející se na biosyntéze fenylethanolu. Odvodili jsme dvě různé dráhy biosyntézy fenylethanolu a 17 enzymových genů zapojených do biosyntézy PhG v kmeni C. deserticola. Na základě strukturního vzorce meziproduktů a katalytických vlastností odpovídajících enzymů, ve kterých by kyselina kávová/ferulová byla nejprve oxidována na derivát fenylpyruvátu, byly také poprvé odvozeny možné procesy po kávové/ferulové kyselině (obr. 3); poté byla karboxylová skupina zbavena dekarboxylázami; nakonec byla aldehydová skupina přeměněna zpět na alkoholovou skupinu dehydrogenázou. Toto je první aplikace technologie sekvenování párového konce Illumina k prozkoumání celého transkriptomu C. deserticola a k sestavení čtení RNA-seq bez referenčního genomu. Tato studie poskytne užitečné zdroje a genové sekvence pro výzkum funkční genomiky a proteomiky na C. deserticola v budoucnu.

Závěry

V této studii jsme profilovali transkriptom kmene C. deserticola na základě vysoce výkonných sekvenačních dat, identifikovali geny zapojené do biosyntézních drah ligninu a také poprvé odvodili potenciální biosyntetickou dráhu PhGs, což jistě urychlí pochopení o nejednoznačných fyziologických procesech a velké léčivé hodnotě na molekulární úrovni. Doposud se jedná o první pokus de novo sestavit celý transkriptom kmene C. deserticola a detekovat cestu biosyntézy léčivých složek pomocí sekvenačních datových souborů na bázi Illumina. Naše studie může podpořit vývoj přírodních léčiv a výběr kultivarů s léčivými vlastnostmi.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%