Ochranný účinek echinakosidu na diabetickou nefropatii

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Ochranné účinky echinakosidu na renální funkce, renální tkáň a poranění mezangiálních buněk u potkanů ​​s diabetickou nefropatií

HE Qin, LIU Fan, WANG Hongli, LI Jianping, DUAN Jun

Abstraktní:

Cíl Prozkoumat ochranný účinekechinakosid(ECH) o renální dysfunkci, histopatologii a poškození mezangiálních buněk vdiabetiknefropatie(DN) krysy a jejich mechanismus. Metody Šedesát SD potkanů ​​bylo náhodně rozděleno do kontrolní skupiny, modelové skupiny, ECH (echinakosid) skupina (vysoké, střední a nízké dávky ECH (echinakosid), 100, 50, 20 mg.kg'.d') a losartan draselný (losartan draselný, 16 mg.kg'.d'), 10 potkanů ​​v každé skupině. Modelová skupina, ECH (echinakosid) a skupina s losartanem draselným byla krmena dietou s vysokým obsahem tuku a cukru a intraperitoneální injekcí streptozotocinu (40 mg·kg"), aby se vytvořily modely potkanů ​​DN. Po 2 týdnech léčby byla tělesná hmotnost, 24h příjem vody a objem moči potkanů. Obsah glykémie nalačno, sérového kreatininu, močovinového dusíku, mikroproteinu v moči, kyseliny hyaluronové (HA), inhibitoru tkáňové metaloproteinázy-1(TIMP-1) a lamininu (LN) bylo provedeno barvení HE a barvení TUNEL k pozorování patologických změn v ledvinové tkáni. RT-PCR byla provedena k detekci exprese B-buněčného lymfomu (Bcl-2), Bcl2-sdruženého Protein X (Bax), kaspázová-3 mRNA. Wester Blot byl proveden za účelem stanovení úrovní exprese vaskulární buněčné adhezní molekuly-1(VCAM-1), transformujícího růstového faktoru (TGF-), - Aktin hladkého svalstva (-SMA) Výsledky Ve srovnání s kontrolní skupinou byla tělesná hmotnost modelové skupiny významně snížena (P< 0.05),="" water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly="" increased=""><0.05). bax,="" caspase-3="" mrna,="" and="" expression="" of="" vcam-1,="" tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05),="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="">< 0.05).="" compared="" with="" the="" model="" group,="" bodyweight="" of="" rats="" was="" significantly="" increased="" in="" the="" medium-dose="" ech="">echinakosid) skupina, vysoká dávka ECH (echinakosid) skupina a skupina losartan draselný (P<0.05), water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly=""><0.05).bax,caspase-3 mrna,="" expression="" of="" vcam-1,tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05);="" and="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly=""><0.05).he and="" tunel="" staining="" showed="" that="" pathological="" changes="" in="" renal="" tissue="" were="" significantly="" decreased.="" conclusion="" medium="" and="" high="" doses="" of="" ech="">echinakosid) může chránit poškození ledvinové tkáně a zlepšit funkci ledvin u DN potkanů ​​inhibicí proteinové exprese TGF- a VCAM-1 a inhibicí renální intersticiální fibrózy a apoptózy ledvinových buněk.

klíčová slova:Cistanches herba;Echinakosid; diabetiknefropatie; renální intersticiální fibróza; apoptóza; krysy

cistanche echinacoside k léčbě diabetické nefropatie

Úvod

Diabetik nefropatie(Diabetická nefropatie, DN) je častádiabetikmikrovaskulární komplikace, která může způsobit nejen poškození ledvin, ale postihnout i další orgány. Klinickým patologickým rysem renální tubulointersticiální fibrózy je komplikovaná patogenezediabetiknefropatie. Předchozí studie [P2-5 se domnívají, že toto onemocnění je způsobeno hlavně hyperglykémií vdiabetikpacientů, což způsobuje renální hemodynamické změny a abnormální metabolismus. Klinickými projevy jsou především proteinurie a snížená rychlost glomerulární filtrace. V současnosti,diabetiknefropatiePacienti stále postrádají účinné klinické léčebné metody a nalezení nových účinných léků je klíčem k léčbědiabetiknefropatie.

echinakosid(ECH) je jedním z extraktů Cistanche Tubulosa. Má účinek na povzbuzení ledvin a posílení jangu." Moderní farmakologické studie ukázaly, že echinakosid má antioxidační, antiapoptotický, protizánětlivý a zlepšený průtok krve Mikrocirkulace a další farmakologické účinky mohou také regulovat metabolismus glukózy v těle a zlepšovat glukózu. V posledních letech studie ukázaly, že echinakosid může inhibovat signální dráhu transformačního růstového faktoru (Transforming growth factor, TGF- ) a inhibovatdiabetiknefropatie. Intersticiální fibróza ledvin potkana chrání tkáň ledvin potkana. V literatuře však existuje jen málo zpráv o léčbědiabetiknefropatiesechinakosida jeho specifický mechanismus ochranydiabetiknefropatieu potkanů ​​není jasné. Proto tato studie dále zkoumala účinekechinakosidna renální fibrózu a apoptózu renálních buněk vdiabetiknefropatiepotkanů ​​a jejich možného mechanismu má poskytnout teoretický základ pro klinickou aplikaciechinakosid.

Přínos cistanche: léčba onemocnění ledvin a zlepšení funkce ledvin

1 Materiál a metody

1.1 Zvířata:

60 potkanů ​​SD, samci, stupeň SPF, stáří 8 týdnů, tělesná hmotnost 240~280 g, poskytnuto společností Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd., licenční číslo zvířete: SCXK (Beijing) 2015-0001, kvalita zvířat je kvalifikovaný Certifikát číslo: 11400700106210, chován v laboratoři zvířecího centra nemocnice, udržuje pokojovou teplotu konstantní na 25 stupních, simuluje den a noc, mění světelné podmínky jednou za 12 hodin a zvířata mohou volně jíst a pít .

1.2 Léky a činidla:

Echinakosid, Čínský institut pro kontrolu potravin a léčiv, číslo šarže: 111670-201706; losartan draselný, Hangzhou Merck Pharmaceutical Co., Ltd., National Medicine Standard: H20030654; Streptozotocin, American Sigma Company, číslo šarže: 040103; Souprava pro detekci obsahu proteinů v moči, Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd., číslo šarže: 20170612; Detekční souprava TUNEL, Amicage Technology Co., Ltd., číslo šarže: 20180406; Souprava pro extrakci RNA, souprava pro reverzní transkripci, Shanghai Hengfei Bio-Technology Co., Ltd., číslo šarže: 20180705, 20180904; Detekční sady sérové ​​kyseliny hyaluronové (HA), tkáňového inhibitoru metaloproteinázy-1 (TIMP-1) a lamininu (laminin, LN), Shanghai Yuanmu Biotechnology Co., Ltd., čísla šarží jsou 20180612, 20180624, 20180706.

1.3 Zařízení

automatický biochemický analyzátor typu 7600, japonská společnost HITACHI; přenosný glukometr, Beijing Yicheng Bioelectronics Technology Co., Ltd.; Optický mikroskop B X60, japonská společnost OLYMPUS; SN-695B radioimunoanalýzový analyzátor, společnost Shanghai Rihuan Instrument Shenbei Co., Ltd.

1.4 Seskupování, replikace modelu a způsob administrace

Po jednom týdnu předběžného krmení bylo 60 potkanů ​​náhodně rozděleno do kontrolní skupiny, modelové skupiny,echinakosidskupiny s vysokou, střední a nízkou dávkou a skupina s losartanem draselným, s 10 krysami v každé skupině. Modelová skupina,echinakosidskupina a skupina s losartanem draselným byly léčeny dietou s vysokým obsahem tuku a cukru v kombinaci s nízkou dávkou streptozotocinu k indukcidiabetiknefropatieu krys. Než byl model replikován, krysy hladověly s vodou po dobu 12 hodin. Krysy v kontrolní skupině byly krmeny běžným krmivem a ostatní skupiny byly krmeny krmivem s vysokým obsahem tuku a cukru. Po 4 týdnech nepřetržitého krmení byla potkanům v kontrolní skupině podána jediná intraperitoneální injekce stejného objemu citrátového pufru a zbývajícím skupinám byla podána jediná intraperitoneální injekce streptozotocinu Bacteriocin (40 mg.kg') k replikaci model krysydiabetiknefropatie. 72 hodin poté, co byl potkanům injikován streptozotocin, byla hladina glukózy v krvi vyšší nebo rovna 16,7 mmol.L a rychlost vylučování bílkovin v moči 24 hodin po 3 týdnech byla vyšší než u kontrolní skupiny. Kvantitativní protein v moči za 24 hodin byl větší než 50 procent před replikací modelu, což ukazuje, že model byl úspěšně replikován. Čtyři týdny po injekci streptozotocinu byly skupiny s nízkou, střední a vysokou dávkouechinakosiddostali 20 mg.kg', 50 mg.kg' a 100 mg.kg'echinakosid(podle 5mL·kg u potkanů). kg“ se rozpustí v normálních fyziologických roztokech o teplotě 37 stupňů), potkanům ve skupině s losartanem draselným je intragastricky podáván losartan draselný 16 mg·kg“ a modelové skupině a kontrolní skupině jsou intragastricky podávány stejné objemy normálního fyziologického roztoku jednou denně Žaludeční sonda pokračovala po dobu 2 týdnů.

1.5 Odběr vzorků

Po posledním podání krysy hladověly bez jídla a vody. Zaznamenávalo se 24 hodin pitné vody krys a 24 hodin se sbírala moč. Druhý den časně ráno byly krysy zváženy. Po odběru moči intraperitoneální injekce 2% roztoku pentobarbitalu sodného 2 ml·kg~ pro anestezii, oddělení krve krysy z břišní aorty, centrifugace (3 500 r·min²', 15 min), odebrání séra a umístění do chladnička- Dočasně skladujte při 20 stupních; oddělte tkáň krysích ledvin a rozdělte na dvě části, jedna část se fixovala ve 4% paraformaldehydu, druhá část se připravila jako 10% homogenát a umístila se do chladničky -80 stupňů pro pozdější použití.

1.6 Stanovení metabolismu glukózy a lipidů u potkanů

Každé skupině krys bylo odebráno sérum, glykémie nalačno byla měřena glukometrem a hladiny triglyceridů, cholesterolu a lipoproteinů s nízkou hustotou byly detekovány automatickým biochemickým analyzátorem.

1.7 24 h bílkovina v moči, renální funkce a ukazatele související s renální fibrózou

Byla shromážděna 24-hodinová moč krys v každé skupině a 24-hodinový obsah mikroproteinů v moči byl stanoven radioimunoanalýzou. Operace byla provedena přesně v souladu s pokyny. Z každé skupiny potkanů ​​bylo odebráno sérum a pomocí automatického biochemického analyzátoru byly zjištěny hladiny krevního kreatininu a močovinového dusíku, které souvisejí s funkcí ledvin, hladina sérového TIMP-1 byla detekována pomocí ELISA, a hladiny HA a LN byly detekovány radioimunoanalýzou. Operace byla provedena přesně v souladu s pokyny.

1.8 HE barvení pro pozorování patologických změn ledvinové tkáně a TNUEL barvení pro pozorování apoptózy buněk ledvinové tkáně

Fixované ledvinové tkáně každé skupiny byly odebrány, rutinně uloženy do parafínu a nařezány. Jedna sekce je použita pro HE barvení k pozorování morfologických změn renálních tubulů, glomerulů a renálního intersticia pod světelným mikroskopem; druhá část slouží k barvení TUNEL, pracuje se podle návodu kitu a pozoruje se počet a pozitivita buněk ledvinové tkáně pod mikroskopem Počet buněk se vypočítá jako poměr počtu pozitivních buněk k počtu ledvinové tkáně buněk, což je rychlost apoptózy.

1.9 Metoda RT-PCR k detekci exprese genů souvisejících s apoptózou v renálních tkáních

Odeberte homogenát tkáně krysí ledviny, extrahujte celkovou RNA metodou Trizol, určete koncentraci ultrafialovým spektrofotometrem a syntetizujte cDNA pomocí soupravy pro reverzní transkripci.

1.10 Metoda Western Blot pro stanovení exprese proteinu VCAM-1 renální tkáně, TGF- a -SMA.

Vezměte asi 50 mg homogenátu tkáně krysí ledviny, rozpusťte jej buněčným lyzátem obsahujícím inhibitory proteázy a extrahujte celkový protein buněčným lyzátem za použití metody BCA pro kvantifikaci proteinu. Vzorek celkového proteinu extrahovaný 50 μmol·L" byl přenesen na nitrocelulózovou membránu elektroforézou na polyakrylamidovém gelu a utěsněn 5% odstředěným mlékem a byla přidána primární protilátka (1∶1000) a -aktinový protein. Protilátka (1: 300), inkubujte přes noc při 4 stupních.Nakonec přidejte sekundární protilátku a inkubujte 2 hodiny při 37 stupních, monitorováno elektrochemiluminiscencí.K analýze šedé hodnoty proteinových pásů použijte software pro analýzu obrazu Photoshop.

1.11 Metody statistického zpracování

K analýze získaných dat byl použit software SPSS 17.{1}} a naměřená data, která vyhovují normálnímu rozdělení, jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka ((x±s) a je použita jednofaktorová analýza rozptylu porovnejte rozdíly mezi skupinami.Párové srovnání mezi skupinami používá SNK- S q testem, P<0.05 indicates="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

2 Výsledky

2.1 Účinky echinakosidu na tělesnou hmotnost, pitnou vodu a výdej moči u potkanů ​​s diabetickou nefropatií jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1 Účinky ECH na tělesnou hmotnost, příjem vody a objem moči u DN potkanů（x ± s,n=10）

Ve srovnání s kontrolní skupinou byla tělesná hmotnost modelové skupiny potkanů ​​významně snížena a 24-hodinový výdej pitné vody a moči byl významně zvýšen. Rozdíl byl statisticky významný (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" doses="" of="">echinakosidTělesná hmotnost potkanů ​​ve skupině s losartanem draselným se významně zvýšila a 24-hodina pití a výdej moči se významně snížily a rozdíl byl statisticky významný (P<>

2.2 Účinky echinakosidu na metabolismus glukózy a lipidů u potkanů ​​s diabetickou nefropatií jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2 Účinky ECH na metabolismus glukózy a lipidů u DN potkanů

Poznámka:Ve srovnání s kontrolní skupinou, “P<0.05; compared="" with="" the="" model="" group,=""><>

Ve srovnání s kontrolní skupinou byla hladina glukózy v krvi nalačno u modelové skupiny potkanů ​​významně zvýšena a rozdíl byl statisticky významný (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" increased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05) ). Ve srovnání s modelovou skupinou byla hladina glukózy v krvi nalačno u potkanů ​​ve skupinách se střední a vysokou dávkouechinakosida skupina s losartanem draselným byla významně snížena a rozdíl byl statisticky významný (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" decreased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05).

2.3 Účinky echinakosidu na 24-hodinovou bílkovinu v moči a renální funkce potkanů ​​s diabetickou nefropatií jsou uvedeny v tabulce 3.

Ve srovnání s kontrolní skupinou byly hladiny mikroalbuminu v moči, močovinového dusíku a kreatininu u modelové skupiny významně zvýšeny a rozdíly byly statisticky významné (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" dose="">echinakosidskupiny Hladiny močového mikroalbuminu, močovinového dusíku a kreatininu u potkanů ​​ve skupině s losartanem draselným byly významně sníženy a rozdíly byly statisticky významné (P<>

Tabulka 3 Účinky echinakosidu na 24hodinovou bílkovinu v moči a funkci ledvin u potkanů ​​s diabetickou nefropatií (x±s, n=10)

2.4 Účinky echinakosidu na renální fibrózu u potkanů ​​s diabetickou nefropatií jsou uvedeny v tabulce 4.

Ve srovnání s kontrolní skupinou byly sérové ​​hladiny HA, TIMP-1 a LN v modelové skupině významně zvýšeny a rozdíly byly statisticky významné (P<0.05); the="" levels="" of="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" of="" rats="" in="" the="" sartan="" potassium="" group="" were="" significantly="" reduced,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant=""><>

Tabulka 4 Účinky ECH na renální fibrózu u DN potkanů

2.5 Barvení HE pro pozorování patologických změn ledvinové tkáně u potkanů ​​s diabetickou nefropatií (viz obrázek 1).

Barvení HE potkanů ​​v kontrolní skupině ukázalo, že struktura buněk ledvinové tkáně byla intaktní a nebyly pozorovány žádné zjevné patologické změny. HE barvení krys v modelové skupině a nízké dávceechinakosidskupina vykazovala: glomerulus zduřil a zvětšil se, renální tubulární epiteliální buňky otekly nebo odpadly, renální intersticium bylo doprovázeno zánětlivou buněčnou infiltrací a byla také patrná určitá mezangiální hyperplazie a intersticiální proliferace. Kvalitativní fibróza.Echinakosidskupiny se střední a vysokou dávkou a skupiny s losartanem draselným. Barvení ukázalo, že patologické změny ledvinové tkáně byly významně sníženy, doprovázené malým množstvím infiltrace zánětlivých buněk, a míra mesangiální hyperplazie a intersticiální fibrózy byla také nižší než u modelové skupiny.

Obrázek 1 Patologické změny renálních tkání potkanů ​​v každé skupině

2.6 Vliv echinakosidu na apoptózu ledvinové tkáně u potkanů ​​s diabetickou nefropatií je znázorněn na obrázku 2.

Barvení TUNEL ukázalo, že ve srovnání s kontrolní skupinou byla míra apoptózy u krys v modelové skupině významně zvýšena a rozdíl byl statisticky významný (P＜00,05); ve srovnání s modelovou skupinou střední a vysoké dávkyechinakosida Corsa Rychlost apoptózy u potkanů ​​ve skupině s draslíkem byla významně snížena a rozdíl byl statisticky významný (P<>

Obrázek 2 Apoptóza buněk renální tkáně u DN potkanů

2.7 Vliv echinakosidu na expresi genů souvisejících s apoptózou v renálních tkáních potkanů ​​s diabetickou nefropatií je uveden v tabulce 6.

Výsledky RT-PCR ukázaly, že ve srovnání s kontrolní skupinou byla exprese Bax a kaspázy-3 mRNA v modelové skupině významně up-regulována a exprese Bcl-2 mRNA byla významně downregulovaná a rozdíl byl statisticky významný (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group="" in="" comparison,="" the="" expression="" of="" bax="" and="" caspase-3="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="" in="" the="" middle="" and="" high-dose="">echinakosidskupiny a skupiny s losartanem draselným a exprese Bcl-2 mRNA byla významně upregulována a rozdíly byly statisticky významné (P<>

Tabulka 6 Účinky ECH na expresi genu souvisejícího s apoptózou v renální tkáni DN potkanů

2.8 Účinkyechinakosidna expresi VCAM-1, TGF- a -SMA proteinů vdiabetiknefropatiepotkani jsou znázorněni na obrázku 3 a tabulce 7. Ve srovnání s kontrolní skupinou byla exprese VCAM-1, TGF- a -SMA proteinu v modelové skupině významně up-regulována a rozdíl byl statisticky významný (P ＜0.05); Exprese VCAM-1, TGF- a -SMA proteinů u potkanů ​​ve skupině s dávkou a ve skupině s losartanem draselným byly významně sníženy a rozdíly byly statisticky významné (P<>

PRO ČÁST KLIKNĚTE ZDE Ⅱ