Kosmeceutický potenciál extraktů pocházejících ze zbytků rybářského průmyslu: Odpady ze sardinek a rámy z tresky, část 1

Abstraktní: Rybářský průmysl vytváří velké množství odpadu (20–75 procent (w/w) z celkové hmotnosti ulovených ryb). Získávání bioaktivních sloučenin ze zbytků a jejich začlenění do kosmetiky představuje slibnou příležitost na trhu a může přispět k udržitelnému zhodnocení odvětví. V této práci byly charakterizovány extrakty bohaté na proteiny získané vysokotlakými technologiemi (superkritický CO2 a podkritická voda) z odpadu sardinek (Sardina pilchardus) a tresek obecných (Gadus morhua) z hlediska jejich kosmeceutického potenciálu. Antioxidační, protizánětlivé a antibakteriální aktivity byly hodnoceny pomocí chemických (test ORAC), enzymatických (inhibice elastázy a tyrosinázy), antimikrobiální citlivosti (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus a Cutibacterium acnes) a buněčných (v keratinocytech-HaCaT) testů . Extrakty ze sardinek vykazovaly nejvyšší antibakteriální aktivitu a řez získaný za použití vyšších extrakčních teplot (250 ◦C) a bez kroku odtučnění vykazoval nejnižší hodnoty minimální inhibiční koncentrace (MIC) (1,17; 4,6; {{24} },59 mg/ml pro K. pneumoniae, S. aureus a C. acnes, v daném pořadí). Vzorky tresky extrahované při nižších teplotách (90 ◦C) byly nejúčinnějšími protizánětlivými činidly (koncentrace 0,75 mg/ml snížila hladiny IL-8 a IL{20}} o 58 procent a 47 procent v tomto pořadí vzhledem k pozitivní kontrole). Threonin, valin, leucin, arginin a obsah celkového proteinu v extraktech byly zvýrazněny, aby vysoce korelovaly s uváděnými biologickými aktivitami (R2 větší nebo rovno 0,7). Tyto výsledky podporují potenciální aplikaci extraktů z odpadů rybářského průmyslu v kosmetických produktech s bioaktivními aktivitami.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Cystanche fenylethanoidové glykosidy mají silnou schopnost vychytávání volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermií, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a má schopnost vychytávat reaktivní formy kyslíku a bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý opravný účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na doplněk Cistanche Tubulosa

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Klíčová slova: zhodnocování toků rybího odpadu; antioxidační aktivita; protizánětlivá aktivita; antimikrobiální aktivita; proti stárnutí; anti-hyperpigmentace; kosmeceutika

1. Úvod

S neustálým hledáním inovací, zejména pokud jde o aktivní složky, kosmetický průmysl roste a prokázal záměr nahradit složky odvozené z ropy směřující k přírodním sloučeninám [1]. Antioxidační vlastnosti přírodních aktivních složek mohou pomoci při prevenci několika kožních problémů způsobených oxidačním stresem a stárnutím [2,3]. Stárnutí kůže může být vyvoláno jak vnitřními (jako je zánět nebo zkrácení telomer), tak vnějšími (environmentálními) faktory [4]. Stárnutí kůže vede ke ztrátě zralého kolagenu a změnám v extracelulární matrici (ECM), což narušuje bariérovou funkci, což má za následek suchý vzhled a náchylnost k vnějším agresorům, což zvyšuje riziko kožních poruch [5]. Tento proces může být urychlen několika enzymy, jako jsou elastázy, matricové metaloproteinázy (MMP) a hyaluronidázy, které mohou vyvolat degradaci ECM [6], nebo dokonce akumulací cesivních reaktivních forem kyslíku (ROS), které mohou ohrozit normální funkci buněk. [7]. Faktory prostředí, jako je vystavení UV záření, vedou k tvorbě velkého množství ROS, které vyvolává stejné molekulární a buněčné reakce jako přirozené stárnutí, ale se zesílenými účinky. Důležité je, že ROS může zesilovat aktivitu enzymů souvisejících se stárnutím kůže nebo procesy pigmentace kůže [8,9], a tak přítomnost antioxidantů n hraje důležitou roli v kosmetické oblasti.

V roce 2018 byla světová spotřeba ryb odhadnuta FAO na 20,5 kg na pita [10], což vede k velkému množství vedlejších produktů, většinou kůže a kostí. Vzniklá rezidua odpovídají 20–75 procentům (w/w) celkové hmotnosti ulovených ryb, což může vést k problémům životního prostředí [11,12]. Tyto zbytky však stále obsahují značné množství lipidů, proteinů a minerálů a měly by být adekvátně zhodnoceny. V posledních letech extrakty z odpadu generovaného rybím průmyslem vykazovaly aktivní vlastnosti, jako jsou antihypertenzní, antioxidační, antimikrobiální, neuroprotektivní, antihyperglykemické, anti-aging a protizánětlivé [13–19]. Treska obecná (Gadus rhea) a sardinka (Sardina pilchardus) patří v Portugalsku k nejkonzumovanějším rybám a trakty odvozené z jejich reziduí prokázaly slibný nutraceutický potenciál, jako jsou antioxidační, antiproliferativní nebo protizánětlivé aktivity [11,20–22]. Vzhledem k tomu, že vykořisťování a zhodnocování odpadu z rybího průmyslu je stále v rané fázi, existuje spousta prostoru pro prozkoumání příležitostí pro průmysl, jak tento odpad přeměnit na vysoce hodnotné tržní bioprodukty, včetně kosmetických přísad.

V předchozí práci jsme zkoumali použití vysokotlakých technologií (superkritický CO2 a podkritická voda) k izolaci bioaktivních frakcí z odpadu sardinek a tresek se slibnými zdravotními přínosy [11,22]. U odpadů ze sardinek jsme prokázali, že aplikací prvního kroku s nadkritickým uhlíkem (ScCO2) (k odstranění lipidové frakce) následovaným extrakčním procesem se subkritickou vodou (SW) bylo možné získat proteinové hydrolyzáty s vysokým antioxidačním potenciálem a antiproliferativním účinkem v buňky kolorektálního karcinomu [22]. Subkritickou extrakci/hydrolýzu vodou jsme také aplikovali k získání extraktů obohacených proteiny, peptidy a aminokyselinami z tresek a ukázali jsme, že nižší teploty zpracování (90 ◦C) podporují extrakci sloučenin s protizánětlivým potenciálem v epiteliální buňce lidského střeva. model [11]. Většina proteinů přítomných v extraktech z tresek jsou kolagen a kolagenové fragmenty. Jiné sloučeniny zahrnují menší množství lipidů, popela a některých cukrů. Extrakty ze sardinek byly bohaté na peptidy a aminokyseliny, přítomny byly také lipidy, popel a cukry. Vzhledem k tomu, že proteiny a peptidy získané z ryb se mohou stát důležitým zdrojem pro kosmetický průmysl, cílem této studie je dále zhodnotit aktivní potenciál těchto extraktů pocházejících z odpadů a vedlejších produktů při zpracování ryb způsobených hodnocením jejich kosmeceutického potenciálu [23]. . Za tímto účelem byla použita řada chemických, enzymatických a buněčných testů, aby se prozkoumaly antioxidační, anti-ageing, anti-hyperpigmentační, protizánětlivé a antimikrobiální účinky extrahovaných vzorků. Byly také provedeny korelační studie k identifikaci hlavních bioaktivních složek s kosmeceutickým potenciálem.

2. Materiály a metody

2.1. Reagencie

3,4-dihydroxy-l-fenylalanin (L-DOPA), houbová tyrosináza, prasečí pankreatická elastáza (PPE) typ III, N-sukcinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (AAAPVN), Tris ({ {11}}amino- 2-hydroxymethyl-propan-1,3-diol), 2,20 -azobis (2-methylpropionamidin)dihydrochlorid (AAPH) a 20 ,70 -dichlorfluorescein diacetát (DCFH-DA) byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Bujón Mueller Hinton (CAMHB) upravený na vápník byl zakoupen od BD (Sparks, MD, USA). Brain-heart infusion (BHI) byla zakoupena od Avantor (Radnor, PA, USA). Sáčky AnaeroGen™ Compact byly zakoupeny od společnosti Oxoid (Hampshire, UK). PrestoBlue™, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), teplem inaktivované fetální bovinní sérum (FBS) a penicilin-streptomycin byly získány od Invitrogen (San Diego, CA, USA). Lidská imortalizovaná netumorogenní buněčná linie keratinocytů HaCaT byla získána od Cell Line Service (Eppelheim, Německo). Vývojové sady Human IL-8 a IL-6 Mini TMB ELISA byly získány od společnosti Peprotech (Londýn, Spojené království). Všechna ostatní činidla a rozpouštědla použitá v této studii byla analytické čistoty a byla zakoupena od dostupných dodavatelů.

2.2. Vzorky

Extrakty použité v této práci byly ty, které byly vyvinuty v našich předchozích studiích zaměřených na optimalizaci procesů [11,22]. Stručně, rámy tresky byly dodány společnostmi Pascoal a Filhos SA (Gafanha da Nazaré, Portugalsko) a sestávaly z rybí páteře a přilnuté svaloviny. Odpad ze sardinek, vyrobený z hlav, ostnů a vnitřností, dodal Conservas A Poveira SA (Póvoa de Varzim, Portugalsko). Přibližné složení použitých surovin bylo uvedeno v našich dřívějších pracích [11,22]. Protein (47 hmotn. procent) a popel (39 hmotn. procent) byly hlavními složkami tresek s malým množstvím lipidů a sacharidů (2 hmotn. procenta a 0,3 hmotn. procenta, v tomto pořadí). Bylo zjištěno, že kolagen je hlavním proteinem v tresčích rybách a v tomto případě představuje cca. 65 procent z celkového obsahu bílkovin v původním odpadu. Naproti tomu sardinka je mastná ryba, takže její odpad je mnohem bohatší na lipidy než rámy tresky obecné. Odpady sardinek vykazovaly obsah lipidů 26 % hmotn. a obsah bílkovin 52 % hmotn., zbytek tvořil popel (17 % hmotn.) a uhlohydráty (3 % hmotn.).

Extrakty z tresek (Cf1, Cf2, Cf3 a Cf4) a odpady ze sardinek (S1, S2 a S3) vybrané pro tuto práci byly získány vysokotlakou technologií v laboratorním přístroji, jak bylo popsáno dříve [11,22 ,24] za podmínek shrnutých v tabulce 1. Stručně řečeno, 60 g rozemletých tresek z tresky nebo odpadu ze sardinek (odtučněných nebo neodtučněných) bylo vloženo do vysokotlakého reaktoru, který byl vložen do pece. Vodní čerpadlo bylo zapnuto při požadovaném průtoku (cca 10 ml/min) a tlak byl nastaven na 100 bar. Jakmile tlak dosáhl této hodnoty, zapnula se elektrická trouba a experiment začal. Různé extrakty byly sbírány po dobu 30 minut při různých teplotách (90–250 ◦C). Extrakty S1 a S3 byly získány po odtučnění odpadu ze sardinek pomocí ScCO2 před extrakcí SW. Podkritické experimenty extrakce vody byly duplikovány. Pro každý extrahovaný vzorek bylo odebráno 25 ml v triplikátech, lyofilizováno a zváženo pro výpočet odpovídajícího výtěžku extrakce. Analytická data – obsah proteinu – jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (SD) z triplikátů. Informace týkající se charakterizace těchto extraktů z hlediska obsahu bílkovin, profilu aminokyselin, hlavních minerálních sloučenin nebo toxických a těžkých kovů jsou popsány v našich předchozích pracích [11,22].

Zásobní roztoky Cf1, Cf2, Cf3, Cf4 a S2 byly připraveny v Milli-Q H2O v koncentraci 100 mg/ml. Ostatní vzorky, konkrétně S1 a S3, byly rozpuštěny v DMSO (300 a 550 mg/ml, v daném pořadí) kvůli jejich nižší rozpustnosti ve vodě. Vzorky byly zmraženy a uchovávány při -20 ◦C až do dalšího použití. Pro buněčné testy byly vzorky předem sterilizovány teplem (121 ◦C, 15 min) v autoklávu (Tuttnauer 3870 el, Breda, Nizozemsko).

2.3. Test kyslíkové radikálové absorpční kapacity (ORAC).

Test ORAC byl proveden za účelem vyhodnocení antioxidační kapacity vzorků vůči peroxylovým radikálům (ROO• ), podle metody vyvinuté Huangem et al. [25], s některými úpravami, jak bylo uvedeno dříve [26]. Stručně, v černé 96-jamkové mikrodestičky bylo 150 ul disodného fluoresceinu (0,3 uM) přidáno do 25 ul ředění vzorků a inkubováno po dobu 10 minut při 37 °C. Poté byla reakce zahájena přidáním 25 ul 2,20 - Azobis (2-amidinopropan) dihydrochloridu (AAPH, 153 mM) a fluorescence (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 nm) byla měřena po dobu 40 minut při 37 °C ve fluorescenční čtečce mikrodestiček FLx800 (FL800 Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Standardní křivka byla připravena s použitím 5, 10, 20, 30 a 40 uM kyseliny (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-} karboxylové (Trolox )). Všechny roztoky byly připraveny ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS), 75 mM, pH 7,4. Výsledky jsou vyjádřeny jako mikromol Trolox ekvivalentní antioxidační kapacity na gram extraktu (µmol TEAC/g extraktu).

2.4. Enzymatické testy

2.4.1. Test inhibice elastázy

Tento test byl založen na práci Wittenauera et al. [27] s některými úpravami, jak bylo popsáno dříve [6]. Inhibiční aktivita elastázy se stanovuje spektrofotometrickou metodou za použití prasečí pankreatické elastázy (PPE) a N-sukcinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilidu (AAAPVN) jako enzymového substrátu, monitorováním uvolňování p-nitroanilinu při 41{ {19}} nm. PPE byl rozpuštěn v 100mM Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-propan-1,3-diol)-HCl pufru (pH=8.0) do koncentrace 1 mg/ml a skladovány při 20 ◦C v alikvotech. V den testu byl odebrán alikvot a zředěn v pufru na koncentraci 0,03 U/ml, 10 ul bylo naneseno do jamek mikrotitračních destiček spolu se 100 ul Tris-HCl pufru a 30 ul každého vzorku. Po 20 minutách předinkubace při 25 °C byla reakce zahájena přidáním 40 ul substrátu AAAPVN (0,55 mM). Absorbance byla měřena po dobu 20 minut po přidání AAAPVN na BioTek Instruments EPOCH 2 spektrofotometrické čtečce mikrodestiček. Výpočty byly provedeny tak, jak je popsáno v rovnici (1), kde A kontrola a vzorek představují absorbanci při 410 nm v nepřítomnosti nebo přítomnosti vzorku. Protože DMSO byl použit k rozpuštění vzorků SI a S3, bylo toto rozpouštědlo také testováno a použito jako kontrola pro tyto vzorky. Potenciál extraktů inhibovat elastázu byl hodnocen se zvyšujícími se koncentracemi, aby se určily vztahy závislé na dávce a stanovily se hodnoty polovičních maximálních inhibičních koncentrací (IC50), které ukazují kapacitu každého vzorku v inhibici enzymatické aktivity v rozsahu 50 procent.

Všechny výsledky jsou vyjádřeny jako střední hodnoty IC50 s dolní a horní hranicí 95procentního intervalu spolehlivosti, získané z alespoň tří nezávislých experimentů.

2.4.2. Test inhibice tyrosinázy

Tyrosinázový inhibiční potenciál extraktů byl hodnocen spektrofotometricky za použití houbové tyrosinázy a L-DOPA jako substrátu [28]. Tyrosináza přeměňuje L-DOPA na dopachinon, který bude postupně cyklizovat za vzniku dopachromu. Tvorba dopacromu může být pozorována měřením absorbance při 475 nm. Substrát byl přidán k enzymu v přítomnosti ředění vzorků na konečnou koncentraci 30 U/ml tyrosinázy a 2,5 mM L-DOPA. Protože DMSO byl použit k rozpuštění vzorků SI a S3, bylo toto rozpouštědlo také testováno a použito jako kontrola pro tyto vzorky. Po inkubaci při 37 °C po dobu 30 minut byla měřena absorbance při 475 nm na BioTek Instruments EPOCH 2 mikrotitračním spektrofotometru. Všechna činidla byla připravena v pufru fosforečnanu sodného (SPB; 0,1 M, pH 6,8), připraveném smísením dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného a monohydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného, ​​a výpočty byly provedeny tak, jak je popsáno v rovnici (1). Všechny výsledky jsou vyjádřeny jako střední hodnoty IC50 s dolní a horní hranicí 95procentního intervalu spolehlivosti, získané z alespoň tří nezávislých experimentů.

2.5. Testování antimikrobiální citlivosti

Cílové mikroorganismy vybrané pro testy antibakteriální aktivity byly gramnegativní bakterie Klebsiella pneumoniae CECT 8453 a grampozitivní bakterie Staphylococcus aureus ATCC 6538 a Cutibacterium acnes ATCC 6919T. Pro K. pneumoniae CECT 8453 a S. aureus ATCC 6538 byly testy provedeny podle mikrodiluční metody bujónu podle pokynů CLSI M07-A10, jak bylo dříve popsáno Rodriguesem et al. [29]. Stručně řečeno, zásobní roztoky extraktu byly distribuovány do mikrotitrační 96-titrační destičky s kulatým dnem a 2-násobně sériově zředěny v bujónu Mueller Hinton s upraveným vápníkem (CAMHB; BD, Sparks, MD, USA) za účelem získání koncentrační rozsah roztoků. Inokulum bylo připraveno s použitím růstové metody k dosažení homogenní suspenze ve fyziologickém roztoku. Upravené inokulum bylo dodatečně zředěno v CAMHB, aby bylo zaručeno, že po inokulaci každá jamka obsahuje přibližně 5 x 104 CFU. Destičky byly inkubovány za aerobních podmínek při 37 °C po dobu 16 až 20 hodin. U C. acnes byly testy provedeny tak, jak bylo popsáno dříve, s použitím bujónu mozk-srdce (BHI) (Avantor, Radnor, PA, USA) místo CAMHB a inkubací mikrotitračních destiček po dobu 70–74 hodin při 37 °C. C v anaerobních nádobách obsahujících systém generování atmosféry AnaeroGen™ Compact (Oxoid, Hampshire, UK).

Pro každý analyzovaný zásobní roztok pozitivní kontrola (CAMHB nebo BHI a zředěné inokulum), kontrola se střední sterilitou (neinokulovaná CAMHB nebo BHI) a kontrola sterility extraktu (neočkovaný 2-násobek zásobního roztoku extraktu v CAMHB nebo BHI) byly podle toho provedeny. Hodnoty minimální inhibiční koncentrace (MIC) byly nejnižší koncentrace vzorku, která po inkubaci viditelně inhibovala mikrobiální růst. V případě potřeby byly hodnoty MIC potvrzeny pomocí činidla pro životaschopnost buněk PrestoBlue™ (Invitrogen, San Diego, CA USA) podle pokynů výrobce. Další hodnota MIC, označená jako MIC*, byla také stanovena a definována jako nejnižší koncentrace vzorku, při které byl bakteriální růst vizuálně a rozdílně ovlivněn ve srovnání s pozitivní kontrolou. Hodnoty minimální baktericidní koncentrace (MBC) byly uváděny jako nejnižší koncentrace vzorku vedoucí k alespoň 99,9% snížení počtu životaschopných bakterií ve srovnání s počátečním inokulem a za stejnou dobu inkubace. Výsledky byly vyjádřeny jako medián hodnot získaných po třech biologických replikacích. Protože DMSO byl použit k rozpuštění vzorků SI a S3, bylo toto rozpouštědlo také testováno, aby se zajistilo, že konečná použitá koncentrace neinterferuje s cílovým mikroorganismem, tedy testem.

2.6. Cell-Based Assays

2.6.1. Buněčná kultura

Lidská keratinocytová buněčná linie HaCaT (CLS, Německo) byla kultivována ve standardním Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu (DMEM) doplněném 10 procenty (obj./obj.) fetálním bovinním sérem (FBS) a 1 procentem (obj./obj.) penicilin-streptomycinem. Buňky byly rutinně udržovány jako monovrstvy v 75 cm2 kultivačních lahvích a inkubovány při 37 °C s 5 procenty CO2 ve zvlhčené atmosféře.

2.6.2. Cytotoxicita in vitro

Testy cytotoxicity byly provedeny podle předchozích prací [6]. Stručně, HaCaT buňky byly nasazeny v hustotě 1,4 x 105 buněk/cm2 na 96jamkové destičky. Po 3 dnech byly buňky inkubovány s různými koncentracemi každého vzorku (Cf1; Cf2; Cf3; Cf4; S2—50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, {{30} }.78, 0.39; S1–3, 1.5, 0.75, 0.38, {{40}}.19, {{51 }}.09, 0.05, 0.02; S3–5,5, 2,75, 1,38, 0,69, 0,34, 0,17, 0,09, 0,04 mg/ml) zředěných v kultivačním médiu (DMEM médium obsahující 0,5 procenta FBS). Jamky obsahující buňky inkubované pouze s kultivačním médiem doplněným 0,5 procenta (obj./obj.) FBS byly použity jako kontrola. Kontroly rozpouštědla s 50 procenty vody nebo 1 procentem DMSO v kultivačním médiu byly také provedeny, aby se vyloučila toxicita rozpouštědla. Po 24 hodinách inkubace byla vyhodnocena životaschopnost buněk pomocí PrestoBlue® (5 procent v/v v kultivačním médiu) po dobu 2 hodin při 37 °C, 5 procent CO2, podle pokynů výrobce. Poté byla měřena fluorescence každé jamky (Ex./Em. 560 ± 20/590 ± 20 nm) ve fluorescenčním čtecím zařízení mikrodestiček FLx800 (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Životaschopnost buněk byla vyjádřena jako procento životaschopných buněk vzhledem ke kontrole. Tři nezávislé experimenty byly provedeny trojmo.

2.6.3. Buněčná antioxidační aktivita

Buněčná antioxidační aktivita byla hodnocena podle dříve popsaných metod [6,30] s určitými modifikacemi. Stručně, HaCaT buňky byly naočkovány v hustotě 1,4 × 105 buněk/cm2 na 96jamkové destičky a tvorba intracelulárního ROS byla monitorována pomocí 20,70 -dichlorfluorescein diacetátu ( DCFH-DA) jako fluorescenční sonda. 72 hodin po naočkování byly buňky promyty PBS a inkubovány s netoxickými koncentracemi vzorků (0,1875 mg/ml; 0,375 mg/ml; 0,75 mg/ml) plus 25 uM DCFH-DA v PBS po dobu 1 hodiny. Následně byly buňky znovu promyty PBS a inkubovány s induktorem stresu (600 uM AAPH v PBS) po dobu 1 hodiny. Poté byla měřena fluorescence ve fluorescenční čtečce mikrodestiček FL800 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 nm). Výsledky jsou vyjádřeny jako procento ROS vzhledem k neošetřené kontrole (buňky ošetřené DCFH-DA a AAPH). Tři nezávislé experimenty byly provedeny trojmo.

2.6.4. Hodnocení sekrece IL-6 a IL-8

Experimenty byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve [31], s několika modifikacemi. Stručně, HaCaT buňky byly nasazeny v hustotě 1 x 105 buněk/cm2 na 12jamkové destičky. Po 3 dnech byly buňky stimulovány 15 µg/ml lipopolysacharidů (LPS) z Escherichia coli a společně inkubovány se třemi různými koncentracemi každého extraktu ({{10}},1875 mg/ml; {{ 14}} 0,375 mg/ml; 0,75 mg/ml) zředěných v kultivačním médiu (DMEM médium obsahující 0,5 procenta FBS). Buňky inkubované pouze s LPS a buňky inkubované pouze s kultivačním médiem byly použity jako pozitivní a negativní kontroly, v daném pořadí. Po 24 hodinách byly supernatanty shromážděny, centrifugovány po dobu 10 minut při 2000 g a skladovány při -80 °C až do další analýzy. Hladiny IL-6 a IL{21}} byly hodnoceny pomocí enzymatického imunosorbentního testu (ELISA) za použití komerčně dostupných souprav (PeproTech; London, UK) podle pokynů výrobce, s absorbancí měřenou při 450 nm s korekcí vlnové délky nastavenou na 620 nm ve spektrofotometru pro mikrodestičky (EPOCH 2, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Výsledky jsou vyjádřeny jako IL-6 nebo IL-8 procento vzhledem k pozitivní kontrole (buňky stimulované LPS). Tři nezávislé experimenty byly provedeny trojmo.

2.7. Statistická analýza

Výsledky ORAC a testu založeného na buňkách jsou vyjádřeny jako střední hodnota ± SD, získaná z alespoň tří nezávislých experimentů. Pro enzymatické a cytotoxické testy byly hodnoty IC50 určeny z křivek dávka-odpověď prostřednictvím log10 grafů pomocí GraphPad Prism 8.4.3. software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Výsledky jsou uvedeny jako IC50 s 95procentním intervalem spolehlivosti. Statistická analýza výsledků byla provedena pomocí předchozího softwaru. Když byly ověřeny homogenní rozptyly a normální distribuce dat, byly výsledky analyzovány jednosměrnou analýzou rozptylu (ANOVA), následovanou Tukeyovým testem pro vícenásobné srovnání. V případě heterogenních rozptylů nebo pokud data nebyla normálně rozdělena, byl proveden vhodný nepárový Studentův t-test, aby se zjistilo, zda se průměry významně lišily. P-hodnota menší nebo rovna 0,05 byla přijata jako statisticky významná ve všech případech. Výsledky testování antimikrobiální citlivosti jsou vyjádřeny jako střední hodnota získaná z alespoň tří nezávislých experimentů.

3. Výsledky a diskuse

This study aims to investigate the cosmeceutical potential of protein-rich extracts that were produced by high-pressure technologies from fishery industry wastes, namely sardine wastes and codfish frames [11,22]. The selection of extracts was based on previous results regarding their characterization and process conditions. For codfish, all extracts were selected aiming at evaluating the impact of the extraction temperature on the recovery of compounds with promising bioactive effects on the skin. For sardine extracts, only three extracts derived from both defatted and non-defatted raw materials, processed at higher temperatures (190  and 250 ◦C) and with the highest extraction yield (>45,7 g/100 g). Výsledky týkající se celkového obsahu proteinu v každém extraktu jsou uvedeny v tabulce 1.

3.1. Antioxidační, anti-ageing a anti-hyperpigmentační aktivity

Potenciální kosmeceutický účinek extraktů byl zpočátku testován pomocí chemických a enzymatických testů, aby se vyhodnotily jejich antioxidační, anti-aging a anti-hyperpigmentační účinky. Pro antioxidační kapacitu byl vybrán test ORAC, protože měří schopnost vzorků vychytávat biologicky relevantní ROS, konkrétně peroxylové radikály, které jsou považovány za jeden z hlavních induktorů stárnutí kůže [2,32]. Účinek proti stárnutí byl také hodnocen prostřednictvím inhibice elastázy, protože se uvádí, že tento enzym je zodpovědný za degradaci elastinu a dalších proteinů ECM [6]. Pro anti-hyperpigmentační účinek byl použit tyrosinázový test k vyhodnocení schopnosti vzorků inhibovat produkci melaninu. Tabulka 2 shrnuje hodnoty ORAC a IC50 všech extraktů.

Naše výsledky ukazují, že extrakty ze sardinek a tresky vykazovaly antioxidační aktivitu a inhibiční účinky na aktivitu enzymů elastázy a tyrosinázy. Mezi vzorky sardinek vykazoval S1 nejvyšší hodnotu ORAC (1,94 ± 0,08 µmol TEAC/mg extraktu) následovaný S3 a S2. Tyto výsledky pocházejí z předchozího antioxidačního hodnocení pomocí alternativní metody (2,{8}}difenyl-1-pikrylhydrazyl-DPPH test), kde extrakt S1 vykazoval nejnižší hodnoty IC50 [22]. Vyšší schopnost vychytávání peroxylových radikálů vzorku S1 by mohla být odvozena z peptidů s různými aminokyselinovými sekvencemi přítomnými v extraktech, protože interakce mezi nimi mohou ovlivnit schopnost vychytávání radikálů [33]. Navíc sloučeniny generované Maillardovými nebo jinými termooxidačními reakcemi mohou ovlivnit antioxidační aktivitu vzorků [34]. Navzdory nejnižší hodnotě ORAC byly vzorky S2 a S3 ty s nejvyšší schopností inhibovat aktivity tyrosinázy a elastázy.

Mezi extrakty z tresky se ukázalo, že Cf4 má nejvyšší antioxidační a antihyperpigmentační aktivitu. SEC-GPC analýza extraktů ukázala, že při zvýšení extrakční teploty až na 250 ◦C byly získány peptidy s klesající molekulovou hmotností [11]. Kapacita inhibice elastázy tohoto vzorku je v rozmezí hodnot zjištěných pro jiné extrakty Cf, jmenovitě Cf1 a Cf3. Avšak pro testované koncentrace tyto dva extrakty nevykazovaly žádnou inhibiční aktivitu vůči tyrosináze.

V literatuře některé zprávy ukazují, že extrakty z mořských vedlejších produktů vykazují relevantní antioxidační aktivitu a inhibici tyrosinázy. Například extrakty získané alkalickou hydrolýzou z mořských vedlejších produktů (Scophthalmus maximus) prokázaly antioxidační aktivitu získanou různými chemickými testy: 1,1-difenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) schopnost pohlcovat radikály ( 36,12 procenta o kontrole), metoda ABTS (2,20 -azinobis-(3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonová kyselina) (12,81 µg BHT/ml) a krocinový bělicí test (8.{101} {28}}3 µg Trolox/ml) [35].V jiné studii se ukázalo, že enzymatická extrakce medúzy nasolené kamencem (Lobonema smithii) produkuje hydrolyzáty s vysokou antioxidační aktivitou (IC{{20}}). 9 mg/ml pro testy ABTS e DPPH) a inhibiční potenciál tyrosinázy, s hodnotami IC50 v rozmezí 14,1 až 24,5 mg/ml [36], které jsou ve stejném řádu jako hodnoty získané v této práci Kromě toho byly extrakty s podobnými antioxidačními hodnotami (hodnoty ORAC – 0.4 až 3,5 µmol TEAC/mg extraktu) získány z jiného typu zbytků potravinářského průmyslu, konkrétně z odpadních toků vinařství [6]. Tyto extrakty z vinařských zbytků však vykazovaly vyšší inhibiční kapacity na tyrosinázu (IC50 od 4,0 do 0,14 mg extraktu/ml) a elastázu (IC50 od 3,4 do 0,1 mg extraktu/ml) než ty získané v této práci, pravděpodobně kvůli přítomnosti fenolických sloučenin. které mají několik biologických aktivit. Je důležité zmínit, že v naší studii jsme použili houbovou tyrosinázu ke screeningu antihyperpigmentačního účinku extraktů, protože tento enzym byl široce používán ve vysoce výkonných testech [37]. Nicméně, protože existují určité kontroverze ohledně podobnosti a homologie tohoto enzymu se savčí/lidskou tyrosinázou [38–40], měly by být zváženy budoucí studie zahrnující savčí buněčné linie, aby se vyhodnotil potenciální antihyperpigmentační účinek extraktů sardinek a tresek.

Aby se zjistilo, které sloučeniny by mohly být zodpovědné za bioaktivní odezvu extraktů, byly provedeny korelační studie mezi údaji o biologické aktivitě a složením aminokyselin extraktů uvedeným dříve [11,22] (tabulka S1). Pro antioxidační aktivitu byly nejvyšší korelace (R2 větší nebo rovno 0.7) získány mezi hodnotou ORAC a celkovým threoninem, volným valinem a také volným a celkovým leucinem pro všechny extrakty. V případě vzorků sardinek byla také získána vysoká korelace (R2 větší nebo rovno 0,94) pro volný a celkový obsah tryptofanu. V souladu s tím bylo již dříve popsáno, že všechny tyto aminokyseliny mají antioxidační vlastnosti v několika modelových systémech [41–43]. Pro inhibiční aktivity elastázy a tyrosinázy byly nejvyšší korelační koeficienty (R2 větší nebo rovno 0.8) získány pro celkový obsah bílkovin a volný arginin, což naznačuje, že tyto sloučeniny by mohly mít důležitou roli v potenciálu anti-aging a anti-hyperpigmentační účinek extraktů z odpadních toků rybího průmyslu.

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】