Optimalizace a spánek zlepšující účinky extraktu z nápoje Congrong-Zaoren-Wumei u myší

2 Výsledky a analýza

2.1 Optimalizace procesu přípravy extraktu z nápoje Congrong–Zaoren–Wumei

 

Z obrázku 1, zavedená metoda HPLC dosáhla účinné separace mezi chromatografickými píky čtyř referenčních sloučenin - kyseliny citrónové, echinakosidu, verbascosidu a spinosinu - a sousedními píky. Retenční časy byly tR1=9.0 min, tR2=21.6 min, tR3=24.3 min, respektive tR4=25.9 min. Lineární regrese plochy píku versus koncentrace analytu poskytly lineární rozsahy 12,12–2016, 0,14–110, 0,18–112,50 a 2,44–18,30 µg·mL–1, s hodnotami R2 0,9998, 1, 1 a lineární excelentností 1. Za těchto podmínek byly limity detekce (LOD) pro kyselinu citrónovou, echinakosid, verbascosid a spinosin 3,636, 0,045144, 0,058 a 0,7564 µg·mL–1 a limity kvantifikace (LOQ) byly 12,12, 0,48, 0,18 µg·mL–1, resp. Testy přesnosti ukázaly RSD 0,10 %, 0,07 %, 0,06 % a 0,33 % pro čtyři analyty, což ukazuje na dobrou přesnost přístroje. Stabilita během 0–12 hodin byla dobrá, s RSD 0,78 %, 0,16 %, 0,20 % a 1,46 %. Testy opakovatelnosti prokázaly RSD 0,51 %, 0,42 %, 0,37 % a 0,38 % pro analyty, což prokázalo dobrou opakovatelnost. Testy zotavení hrotů ukázaly průměrné zotavení 97,42 %, 103,32 %, 98,90 % a 99,71 %, s RSD 0,70 %, 0,52 %, 1,05 % a 0,63 %. Proto je metoda HPLC zavedená pro současné stanovení těchto čtyř hlavních složek přesná a spolehlivá, vhodná pro následné testy optimalizace procesu.

 

 

 

 

Obr.1 HPLC chromatogramy reference a roztoků při vlnové délce 210 nm (A) a 330 nm (B a C) Obr.

 

V metodickém hodnocení surových polysacharidů byla LOD 0,098 µg·mL–1. Hodnoty OD slepého pokusu rozpouštědla a slepého pokusu při 485 nm nevykazovaly žádné zjevné změny, což ukazuje na dobrou specifitu. Lineární regrese OD versus koncentrace poskytla R2=0.9997, což ukazuje na vynikající linearitu. RSD pro šest po sobě jdoucích měření byla 0,47 %, což prokazuje dobrou přesnost. RSD pro obsah polysacharidů během 12 hodin byla 0,44 %, což ukazuje na dobrou stabilitu. RSD u šesti nezávisle připravených vzorků byla 2,51 %, což ukazuje na dobrou opakovatelnost. Metoda je tedy vhodná pro kvantifikaci surových polysacharidů během optimalizace procesu.

 

 

Výhody Cistanche Roucongrong v Ancient Book

Kliknutím zobrazíte další podrobnosti

Supporting Service Of Wecistanche-Pro více podrobností o spolupráci
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

2.1.2 Výsledky jednofaktorových šetření

Za použití zavedené metody HPLC v kombinaci s polysacharidovým testem a za použití obsahu kyseliny citrónové, echinakosidu, verbaskosidu, spinosinu a polysacharidů v extraktu jako hodnotících indexů byly provedeny jednofaktorové výzkumy extrakční teploty, poměru pevná látka-kapalina a doby extrakce pro podporu ortogonálního návrhu.

Při extrakčních teplotách 60, 80 a 100 stupňů se obsah kyseliny citrónové, echinakosidu, verbascosidu, spinosinu a surových polysacharidů v extraktech zvyšoval s teplotou.

Při poměrech pevná látka-kapalina 1:3, 1:5, 1:7, 1:10 a 1:12 (g·mL–1) se obsah kyseliny citrónové, spinosinu a surových polysacharidů zvyšoval s vyššími poměry; echinakosid a verbascosid dosáhly vrcholu při 1:10 (g·ml–1) a snížily se při 1:12 (g·mL–1). Celkový obsah všech složek markeru se však zvyšoval s poměrem pevná látka-kapalina.

V časech extrakce 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 a 3,0 h se obsahy jednotlivých analytů lišily, ale celkový obsah markerových složek se s časem zvyšoval.

Podrobné údaje jsou uvedeny v doplňkových materiálech. S ohledem na průmyslovou praktičnost (vyhýbání se příliš dlouhé extrakci) byly faktory a úrovně pro ortogonální design nastaveny jako v tabulce 2 a ortogonální schéma je uvedeno v tabulce 3.

Tabulka 2. Úrovně faktorů ortogonálního experimentálního designu pro extrakční metodu Congrong–Zaoren–Wumei Beverage

Faktory:

A: Teplota extrakce (stupně)

B: Poměr pevné látky a kapaliny (g ml–1)

C: Doba extrakce (h)

Úroveň	A: Teplota (stupně)	B: Poměr (g ml–1)	C: Čas (h)
1	60	1:7	1.0
2	80	1:10	1.5
3	100	1:12	2.0

2.1.3 Výsledky ortogonálního návrhu

Extrakce byla provedena pro ortogonální pole. Obsahy kyseliny citrónové, echinakosidu, verbascosidu, spinosinu a surových polysacharidů jsou uvedeny v tabulce 3. Na základě analýzy rozsahu (R) bylo pořadí vlivu faktoru na celkový obsah markerů A > B > C, tj. teplota extrakce > poměr pevná látka–kapalina > doba extrakce. Porovnáním hodnot k byla navržena optimální kombinace A3B3C3: teplota extrakce 100 stupňů, poměr pevná látka–kapalina 1:12 (g·mL–1) a doba extrakce 2 hodiny. ANOVA (tabulka 4) ukázala, že teplota extrakce měla významný vliv na celkový obsah markeru, zatímco vliv poměru pevná látka-kapalina a času nebyly významné.

Tabulka 3. Ortogonální experimentální design a naměřené obsahy složek nápoje Congrong–Zaoren–Wumei (mg g–1)

Faktory: A (teplota), B (poměr pevné látky a kapaliny), C (čas)

Zkušební č.	A	B	C	Celkový počet značek	Kyselina citronová	Spinosin	Echinakosid	Verbascoside	Surové polysacharidy
1	3	3	1	116.71	75.55	4.08	1.62	0.48	34.98
2	1	2	3	70.98	59.01	2.60	0.80	0.36	8.22
3	3	1	3	117.86	73.87	3.53	1.21	0.45	38.80
4	1	3	2	72.55	59.73	2.37	0.94	0.41	9.99
5	2	3	3	83.64	63.20	2.15	1.08	0.44	16.77
6	2	1	2	117.76	74.09	2.58	1.37	0.48	39.24
7	2	2	1	110.74	70.96	2.36	1.07	0.43	35.92
8	2	1	1	69.63	58.37	1.74	0.54	0.34	8.65
9	1	1	3	69.66	58.14	2.48	0.86	0.36	7.83

K statistiky (součet součtů na úroveň faktoru)

K1: A = 71.06, B = 85.72, C = 85.49

K2: A = 74.46, B = 86.29, C = 86.65

K3: A = 117.44, B = 90.97, C = 90.83

Rozsah R: A=46.38, B=5.25, C=4.19

2.1.4 Ověření a rozšíření

Validace procesu za optimálních podmínek poskytla průměrný celkový obsah markerových složek 119,74 mg·g–1 s RSD 0,57 %, což ukazuje na stabilitu a spolehlivost. Zkouška škálování za stejných podmínek poskytla průměrný celkový obsah markerů 120,89 mg·g–1 s RSD 0,95 %, což je v souladu s výsledky před škálováním, což dále potvrzuje robustnost. Vzorky ze tří škálovaných šarží byly použity pro následné studie související se spánkem; jejich průměrné obsahy byly: kyselina citronová 77,73 mg·g–1, echinakosid 2,69 mg·g–1, verbascosid 1,03 mg·g–1, spinosin 0,50 mg·g–1 a polysacharidy 38,93 mg·g–1.

Tabulka 4. Analýza rozptylu z ortogonálních experimentů

Faktor	Součet čtverců	df	Střední čtverec	F	P
Teplota extrakce	4010.50	2	2005.25	116.26	0.01
Poměr pevná látka-kapalina	49.79	2	24.90	1.44	0.41
Doba extrakce	47.37	2	23.68	1.37	0.42

Liu a kol. [16] optimalizovali vodnou extrakci fenylethanoidních glykosidů z Cistanche tubulosa a jako optimální označili poměr 1:15 (g·mL–1), 80 stupňů a 2 h; obsah fenylethanoidových glykosidů se snížil nad 90 stupňů. V této studii obsah echinakosidu a verbascosidu dosáhl vrcholu v poměru 1:10 (g·mL–1) a klesal v poměru 1:12 (g·mL–1), přesto se zvýšil s teplotami 60, 80 a 100 stupňů. Tento rozpor se může týkat použití Cistanche deserticola (pouštní Cistanche) v našem nápoji a matricových účinků koexistujících Suanzaoren a Wumei, které by mohly ovlivnit rozpouštění fenylethanoidových glykosidů.

Tabulka 5. Vliv extraktu Congrong–Zaoren–Wumei Beverage na přímý spánek u myší (n=12)

Skupina	Celkem zvířat	Spící zvířata	Frekvence spánku (%)
Prázdný	12	0	0
Estazolam	12	0	0
Nízkodávkový extrakt	12	0	0
Středně dávkovaný extrakt	12	0	0
Extrakt ve vysoké dávce	12	0	0

Stručně řečeno, pomocí HPLC a metody fenol–kyselina sírová jsme optimalizovali proces extrakce na základě obsahu kyseliny citrónové, echinakosidu, verbascosidu, spinosinu a polysacharidů. Jednofaktorové a ortogonální experimenty s následnou validací stanovily optimální podmínky: 100 stupňů, poměr pevná látka-kapalina 1:12 (g·mL–1) a doba extrakce 2 hodiny, což poskytuje referenci pro budoucí průmyslový rozvoj.

Industrialization context: WECISTANCHE (Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., established 2003) operates a vertically integrated cistanche supply chain with seed-breeding bases (~20,000 acres), cultivation bases (>85 000 akrů), skladovací kapacita čerstvého cistanche (~15 000 tun) a výrobní dílny s certifikací GMP (100 000 tříd čistých prostor) vybavené pokročilou ultrafiltrací a nanofiltrací pro čištění a koncentraci, plus mikrobiologická laboratoř třídy 10 000. Certifikace zahrnují China SC, HACCP a organické programy (např. NOP). Tato infrastruktura podporuje přímý překlad optimalizovaného protokolu vodné extrakce a standardizace markerů na velkovýrobu funkčních nápojů a extraktů v souladu s exportem.

Tabulka 6. Vliv extraktu na hypnotický účinek podprahového pentobarbitalu sodného u myší (x̄ ± s, n=12)

Skupina	Celkem zvířat	Spící zvířata	Frekvence spánku (%)
Prázdný	12	1	8.33
Estazolam	12	10	83.33**
Nízkodávkový extrakt	12	4	33.33
Středně dávkovaný extrakt	12	5	41.67
Extrakt ve vysoké dávce	12	6	50.00*

Poznámka: Ve srovnání s prázdnou skupinou, * P < 0,05; ** P < 0,001.

 

2.2 Účinky extraktu na chování myši a spánek

2.2.1 Přímý spánek

Jak je uvedeno v tabulce 5, po 30 dnech nepřetržitého podávání myši ve skupině s estazolamem a ve skupinách s nízkou/střední/vysokou dávkou extraktu nevykazovaly zjevný spánek během 20 minut po poslední dávce, bez významných rozdílů oproti slepé skupině. To ukazuje na žádný přímý účinek navozující spánek po 30 dnech podávání extraktu.

 

2.2.2 Účinky na chování

Test na otevřeném poli hodnotil sedativní účinky. Dopady na celkovou ušlou vzdálenost a vstupy do středu jsou znázorněny na obrázku 2. Ve srovnání s prázdnou skupinou zvýšil estazolam celkovou vzdálenost o 14,48 % a vstupy do středu o 31,07 % bez statistické významnosti. Nízkodávkovaný extrakt významně zvýšil celkovou vzdálenost o 25,10 % (P < 0,05) a nevýznamně zvýšil středové vstupy o 50,93 %. Střední dávka významně zvýšila celkovou vzdálenost a středové vstupy o 27,09 % a 72,33 % (P < 0,05). Vysoká dávka zvýšila celkovou vzdálenost a středové vstupy o 15,60 %, resp. 40,78 %, bez významnosti. Nízké/střední/vysoké dávky oproti estazolamu zvýšily celkovou vzdálenost 1,73krát, 1,87krát a 1,07krát a vstupy do centra 1,64krát, 2,33krát a 1,31krát, v tomto pořadí, žádné významné. Tyto výsledky naznačují, že extrakt po 30 dnech snížil chování podobné úzkosti v otevřeném poli, což naznačuje sedativní účinek.

2.2.3 Podprahový spánek vyvolaný pentobarbitalem sodným

Jak je uvedeno v tabulce 6, ve srovnání se slepou skupinou, estazolam a všechny tři dávky extraktu zvýšily rychlost spánku pod podprahovou dávkou pentobarbitalu sodného. Estazolam zvýšil počet spících zvířat 9krát oproti slepému pokusu (P < 0,001). Skupiny s nízkou, střední a vysokou dávkou extraktu zvýšily počet spící zvířata 3-, 4- a 5-násobně; pouze vysoká dávka dosáhla statistické významnosti (P ​​< 0,05). Ve srovnání s estazolamem žádná z dávek extraktu nevykazovala silnější účinek na navození spánku. Extrakt tedy může do určité míry zlepšit spánek navozený podprahovým pentobarbitalem sodným.

 

2.2.4 Pentobarbital sodný spánková latence

Ve srovnání se slepou skupinou estazolam a všechny tři dávky extraktu významně zkrátily pentobarbitalem indukovanou spánkovou latenci (P < 0,001). Estazolam snížil latenci o 58,44 % (P < 0,001). Skupiny s nízkou, střední a vysokou dávkou extraktu snížily latenci o 29,59 %, 31,42 % a 53,83 % (všechny P < 0,001). Mezi nízkými a středními dávkami nebyl žádný významný rozdíl; vysoká dávka významně zkrátila latenci ve srovnání s nízkými i středními dávkami o 34,43 % a 32,69 % (P < 0,01), s účinkem podobným estazolamu (tabulka 7). Všechny tři dávky proto výrazně zkrátily spánkovou latenci vyvolanou pentobarbitalem, přičemž vysoká dávka měla nejlepší výsledky.

Tradiční čínská medicína obsahuje různé bioaktivní složky působící na více cílů, což nabízí jedinečné výhody pro léčbu nespavosti [17]. S rostoucí pozorností věnovanou problémům spánku jsou léčivé TCM stále častěji zkoumány z hlediska modulace spánku [18]. Například kompozitní pevný nápoj obsahující hlavně Suanzaoren a Poria významně zkrátil spánkovou latenci vyvolanou pentobarbitalem a prodloužil dobu spánku u myší, potenciálně prostřednictvím změn v 5-HT, DA a GABA [19]. Zde extrakt významně zvýšil spánek pod prahem pentobarbitalu a zkrátil latenci spánku vyvolanou pentobarbitalem, podpořil nástup spánku a snížil latenci, aniž by vykázal přímý účinek navození spánku. Naměřené obsahy primární složky byly v sestupném pořadí: kyselina citronová (77,73 mg·g–1), polysacharidy (38,93 mg·g–1), echinakosid (2,69 mg·g–1), verbascosid (1,03 mg·g–1) a spinosin (0,50 mg·g–1). Bylo prokázáno, že spinosin zlepšuje spánek vyvolaný pentobarbitalem; může zvýšit non-REM spánek a změnit expresi c-Fos v regulačních oblastech mozku spánek-bdění [20], zmírnit nespavost vyvolanou PCPA, snížit spánkovou latenci a prodloužit spánek [21]. Verbascosid uvádí anxiolytické, hypnotické a svalově relaxační aktivity [22]. Naproti tomu hlavní složky – kyselina citronová, polysacharidy (od Cistanche, Suanzaoren a Wumei) a echinakosid – mají méně přímých zpráv o zlepšení spánku; nedávný výzkum polysacharidů TCM (např. polysacharidy Acanthopanax senticosus) však naznačuje potenciální výhody spánku prostřednictvím cest, jako je SIRT1/PGC-1 [23]. Role kyseliny citrónové, polysacharidů a echinakosidu v modulaci spánku proto vyžaduje další studium.

 

7. Účinek extraktu na spánkovou latenci indukovanou pentobarbitalem sodným u myší (x̄ ± s, n=12)

Skupina	Celkem zvířat	Latence spánku (min)
Prázdný	12	32.34 ± 4.27
Estazolam	12	13.44 ± 3.20**
Nízkodávkový extrakt	12	22.77 ± 5.81**#
Středně dávkovaný extrakt	12	22.18 ± 6.05**#
Extrakt ve vysoké dávce	12	14.93 ± 3.35**

Poznámky:

V porovnání s prázdnou skupinou: ** P < 0,0001.

Ve srovnání se skupinou s vysokými dávkami extraktu: # P < 0,01.

 

3 Závěr

Použitím léčivých jedlých TCM Cistanche deserticola, Ziziphi Spinosae Semen a Mume Fructus k formulaci nápoje Congrong–Zaoren–Wumei jsme optimalizovali proces přípravy jeho extraktu s použitím obsahu čtyř markerových složek (echinakosid, verbascosid, spinosin, kyselina citrónová) a polysacharidy jako hodnotící indicie. Optimální podmínky extrakce byly stanoveny jako 100 stupňů, poměr pevná látka-kapalina 1:12 (g·mL–1) a 2 h, což poskytuje teoretické vodítko pro průmyslovou výrobu. Další hodnocení ukázalo, že 30denní kontinuální podávání nemělo žádný přímý účinek na vyvolání spánku u myší, ale významně snížilo chování podobné úzkosti v testu na otevřeném poli (naznačující sedativní účinek), zlepšilo spánek pod podprahovou dávkou pentobarbitalu sodného a výrazně zkrátilo latenci spánku vyvolanou pentobarbitalem. Tato zjištění naznačují, že extrakt připravený optimalizovaným procesem vykazuje příznivé účinky na zlepšení spánku u myší a poskytuje vědecký základ pro vývoj produktových řad zlepšujících spánek na bázi Cistanche.

Application and manufacturing note: Given the optimized aqueous extraction and the need to standardize to marker profiles (citric acid, echinacoside, verbascoside, spinosin, plus polysaccharides), WECISTANCHE's integrated cistanche value chain and GMP infrastructure-100,000-class clean workshops certified for National Health Food GMP, advanced ultrafiltration/nanofiltration concentration systems, a 10,000-class microbiology lab, and certifications such as China SC, HACCP, and organic/NOP-allow reliable scale-up from lab to industrial batches. The company's large agricultural bases (seed-breeding ~20,000 acres; cultivation >85 000 akrů; skladování čerstvé cistanche ~ 15 000 tun) podporuje konzistenci surovin a mezinárodní standard QC, což usnadňuje komercializaci funkčních nápojů a zdravotních doplňků splňujících očekávání USA/EU.