Analýza složení a imunologická aktivita oligosacharidů izolovaných z Cistanche deserticola

Kontaktní osoba: emily.li@wecistanche.com

Abstraktní.Oligosacharid (CDOS) byl získán zCistanche deserticolaalkalickou (pH = 10) extrakcí, srážením ethanolu a frakcionací na dvě čištěné frakce (tj. CDOS-1 a CDOS-2) kolonovou filtrační chromatografií Sephadex G-100 a Sephadex G-25. Monosacharidové složení CDOS bylo testováno vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Bylo zjištěno, že CDOS-1 byl složen pouze ze sacharózy a CDOS-2 byl složen hlavně ze sacharózy, rhamnosy a mannitolu s molárním poměrem 1:0,73:3,61. Imunologické testy ukázaly, že CDOS představuje významný vliv na index sleziny u myší, zvyšuje aktivitu fagocytózy makrofágů a stimuluje proliferaci buněk produkujících protilátky. Doufáme, že CDOS bude vyvinut do funkčních potravin nebo léků.

Klíčová slova:Cistanchedeserticola, oligosacharid, purifikace, složení, imunologické aktivity.

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte zde pro více informací

1. Úvod

Cistanchedeserticola Y.C.Ma. (Čeleď Orobanchaceae) je krátká parazitická rostlina původem ze severozápadu Číny. Celá sušená rostlina (bez květů) je známá jako tonikum a nazývá se "Rou Congrong". V orientální medicíně je klasifikován jako sladký a slaný v chuti, teplý v přírodě a přivlastňující ledvinovým a tlustým střevním kanálům s funkcíOsvěžujícítenledvinaa doplnění esence, zvlhčování střeva a uvolnění střev [1]-[3]. Moderní farmakologická studie ukázala, že by mohla vyvolat syntézu DNA a zpomalit proces senility, zvýšit antioxidační [4] , předcházet a léčit kardiovaskulární onemocnění [3]. Kromě toho by mohl také způsobit analgetikum aanti-zánětlivýúčinky [5], zlepšují učení a paměť indukcí nervových růstových faktorů [6]. Některé studie ukázaly, že extrakty z C. deserticola mohou aktivovat fagocytární funkci intraabdominálního makrofágu u myší [7]-[9] avylepšittělo"sImunita[10]. Podle předchozích studií obsahuje tato rostlina více aktivních složek, mezi něž patří fenylethanoidní glykosidy, iridoidy, lignany, sacharidy, alkaloidy atd. [11] Jako C.deserticolafenylethanoidGlykosidya polysacharidy jsou uznávány jako hlavní aktivní složky, četné studie se zaměřily na jejich struktury a bioaktivity během posledních desetiletí [12]-[17]. Pokud jde o cenné oligosacharidy vC. deserticola, zprávy jsou poměrně omezené. Oligosacharidy, sacharidy s krátkým řetězcem obsahující homo- nebo hetero-cukry, jsou dobře známé pro své příznivé účinky na lidský život a byly rozsáhle využívány po dlouhou dobu [18]. Funkční oligosacharidy, které mají fyziologickou funkci, jako je nízká kariogenita a růstový faktor bifidobakterií [19], zlepšují zdraví lidí a zvířat. Byly použity jako potravinová složka. Nedávno byly hlášeny nové funkce oligosacharidů, které mají schopnost modulovat imunitní systém u lidí, zvířat a ryb [20]. V tomto článku uvádíme první část výsledků výzkumného programu, frakcionaci celkových oligosacharidů získaných z alkalického extraktu C. deserticola kombinací ultrafiltrace a gelové permeační chromatografie a jejich analýzu složení vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Kromě toho představujeme také imunologické aktivity oligosacharidů C. deserticola. Pokud je nám známo, existuje jen málo publikovaných zpráv o studiích imunostimulační aktivityC. deserticolaoligosacharidy.

2. Experimentální

2.1. Materiály

C. deserticola byla pěstována a sbírána z Alxa League (Vnitřní Mongolsko, Čína). Myši Kunming (GradeII, šest týdnů staré) byly zakoupeny od Farmakologického experimentálního centra Univerzity Vnitřního Mongolska. Sephadex G-100,Sephadex G-25, kyselina trifluoroctová (TFA), 1-fenyl-3-methyl-5-pyrazolon(PMP), D-glukóza, D-galaktóza, D-fruktóza, D-xylóza, D-manóza, kyselina D-galakturonová, kyselina D-glukuronová, sacharóza, rhamnosa, mannitol, fukóza, rhamnosa, byly zakoupeny od společnosti Sigma (St. Louis, MO, USA). Střední RPMI-1640 byl zakoupen od gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, USA). Všechny ostatní chemické látky byly analytické kvality.

2.2 Extrakce oligosacharidů

Sušená těla C. deserticola byla nakrájena na menší kousky a dále rozemleta na prášek mlýnem byla extrahována bezvodým ethanolem (3×5000 ml) při 70 ° po dobu 3 hodin pod atmosférickým tlakem. Byl opraven refluxní kondenzátor pro odstranění lipidů. Zbylý zbytek byl poté extrahován alkálií (pH = 10) při teplotě 60 °C po dobu 3x (pokaždé 2 hodiny). Po odstředění (2000 g po dobu 15 minut při 20 °C) se supernatant koncentroval na jednu desetinu objemu v rotační výparníku za sníženého tlaku při 50 °C a zfiltroval. Poté byl filtrát deproteinizován pomocí činidla Sevag [21] a odbarven aktivním uhlím.

2.3 Izolace a čištění oligosacharidů

Lyofilizované surové oligosacharidy byly rozpuštěny v destilované vodě, odstředěny a poté byl supernatant vyčištěn kolonou Sephadex G-100 (1×50 cm), vyváženou ultračistou vodou. Po naplnění vzorkem byla kolona eluována ultračistou vodou o průtoku 5 ml/min. Různé frakce byly shromážděny pomocí zkumavek. Celkový obsah sacharidů v každé zkumavce byl naměřen na 490 nm metodou fenolu-H2SO4 [22]. Vodou eluovaný roztok byl rozdělen na dvě frakce CDOS-1 a CDOs-2. Dvě frakce byly dále vyčištěny na koloně Sephadex G-25 (2,7×85 cm) pomocí ultračisté vody (při průtoku 1 ml/min). Po sběru vyčištěné frakce byla lyofilizována.

2.4 Analýza monosacharidového složení

Monosacharidové složení CDO bylo dosaženo analýzou HPLC. ZAJIŠTĚNÉ látky (2 mg) byly nejprve hydrolyzovány bezvodým methanolem obsahujícím 2 M HCl při 80 °C po dobu 16 hodin pod dusíkatou atmosférou a poté 2M TFA při 120 °C po dobu 1 h. Po odstranění TFA odpařením byly hydrolyzáty následně odvozeny pomocí PMP podle uvedené metody [23] a analyzovány pomocí HPLC. Separace HPLC byla provedena na systému HPLC EF-2002 (společnost KNAUER, Německo). Deriváty PMP byly chromatografovány pomocí objemu Sugar-PAK (6,5×300 mm, sklenice vodárenské společnosti, Amerika) a absorbance byla měřena při 245 nm. Vstřikovaný objem byl 20 μl a mobilní fáze složená z PBS (rozpouštědlo A) a acetonitril (rozpouštědlo B) byla použita pro izokratickou elukci v objemovém poměru 82 % (A) k 18 % (B). Celková doba chodu HPLC byla 40 minut a průtok byl 0,5 ml / min.

2.5 Imunobiologické činnosti

2.5.1 Fagocytární funkce monocytů-makrofágů

Šedesát myší Kunming (GradeII, šest týdnů starých) bylo zakoupeno z Farmakologického experimentálního centra Univerzity Vnitřního Mongolska a bylo aklimatizováno po dobu 1 týdne před použitím. Všechny myši byly náhodně rozděleny do čtyř skupin, které se skládaly ze skupiny pro kontrolu fyziologického roztoku, skupiny s vysokým dávkováním CDO, skupiny se středním dávkováním a skupiny s nízkým dávkováním CDO. Myším byl intraperitoneálně podán 0,5 ml roztoku oligosacharidů jednou denně po dobu 5 dnů. Skupina s vysokým, středním nebo nízkým dávkováním CDO obdržela 100, 50 nebo 25 mg / kg / BW CDO; a do kontrolní skupiny bylo injikováno 0,5 ml fyziologického roztoku. Sedmý den byl proveden experiment s odstraňováním uhlíkových částic, podle Hou [24], a byl měřen index sleziny a index brzlíku. Stručně řečeno, 0,05 ml/10 g/bw India inkoust byl injektován do každé myši přes vena caudalis, pak 20 μL krve bylo získáno z vena orbitalis posterior 3 a 7 minut po injekci. Vzorky krve byly umístěny do zkumavek s 2 ml 0,1% Na2CO3 a hodnoty OD byly měřeny při 600 nm. Index clearance (K), fagocytární index (α) a index imunitních orgánů byly vypočteny následovně (1), t2 a t1 znamená 7 minut a 3 minuty.

2.5.2 Buněčná proliferace produkující protilátky

Skupiny myší Kunming (pět na skupinu) byly imunizovány intraperitoneální injekcí 2 x 107 SRBC v 1,0 ml PBS přidané s 50 g testovaných materiálů (žádný v kontrolní skupině). O týden později byly splenocyty (106 buněk na 2 ml na jamku) z myší Kunming kultivovány s testovacími materiály nebo bez nich po dobu 72 hodin v 10% RPMI 1640 médiu pod 5% CO2 ve vzduchu, ve trojím vyhotovení pro každou kulturu. Byl stanoven počet PFC proti SRBC na 106 splenocytů [25], [26].

2.6. Statistická analýza

Údaje byly vyjádřeny jako střední hodnoty ±SD. Rozdíl mezi testovanými skupinami a kontrolou byl analyzován Studentovým t-testem. P< 0.05="" was="" considered="" to="" be="">

3. Výsledky a diskuse

3.1 Izolace a čištění oligosacharidů

CDO byly izolovány z alkalického extraktu sušených těl C. deserticola výtěžkem 3,07%. Dvě frakce CDOS-1 a CDOS-2 byly izolovány z elutované destilované vody kolonou Sephadex G-100 (obr. 1). Čištěné frakce CDOS-1 a CDOS-2 vykazovaly jediný pík na koloně Sephadex G-25, což naznačuje, že ve vzorku nebyly přítomny žádné jiné oligosacharidy. Výsledky monosacharidových kompozic ukázaly, že CDOS-1 byl složen pouze ze sacharózy (obr. 2) a CDOS-2 byl složen hlavně ze sacharózy, rhamnosy a mannitolu (obr. 3) s molárním poměrem 1:0,73:3,61.

3.2. Imunobiologické činnosti CDO

Mnoho důkazů in vivo a in vitro prokázalo, že přírodní oligosacharidy vykazovaly imunomodulační funkci tím, že stimulovaly jak buněčné, tak humorálníimunní odpovědi[27], [28]. V tomto článku 100 mg/kg/BW CDO zvýšilo index sleziny u myší, ale nebyly zjištěny žádné významné rozdíly v indexu brzlíku mezi exponovanými skupinami a kontrolními skupinami (tabulka 1). Makrofágy jsou důležitou složkou obrany hostitele proti virové infekci inhibicí intracelulární replikace virů a zabíjením buněk infikovaných virem [29]. Při aktivaci se z makrofágů uvolňují různé meziprodukty kyslíku nebo dusíku a cytokiny a podílejí se na různých důležitých biologických funkcích, jako jsou protizánětlivé a protinádorové aktivity [30]-[32]. Proto je fagocytární aktivita makrofágů důležitým ukazatelem imunitních funkcí organismu. V této studii střední a vysoké dávky CDO zvýšily aktivitu fagocytózy makrofágů (tabulka 1). Buněčná proliferace produkující protilátky vyvolaná CDO byla studována zkoumáním zvýšení hemolytické PFC ve slezině myší Kunming, které byly imunizovány SRBC plus zkušebním vzorkem. Výsledky ukázaly, že střední a vysoké dávky CDO významně zvyšují proliferaci buněk produkujících protilátky (tabulka 2). Vysoké dávky CDO způsobily vysoce významné zvýšení počtu PFC (P<>

Odkazy

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Rozpoznávání smíšeného biologického signálu na základě vlnkové analýzy. In: Y. Jiang, et al (eds). Proc. britsko-čínského sportovního inženýrského workshopu. Liverpool: Světová akademická unie. 2007, s. 1-8.

[2] J. Ouyang, X.D. Wang, B. Zhao a kol. Účinky prvků vzácných zemin na růst buněk Cistanche deserticola a produkci fenylethanoidních glykosidů. J B io-technol, 2003, 102 (2) : 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian a kol. Nový přírodní produkt z Cistanche deserticola Y.C.MA. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Antioxidační působení glykosidů Cistanche v tkáni myší. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin L.W, Hsieh M.T, Tsai F.H, Wang W.H, Wu C.R.Anti nociceptivní a protizánětlivá aktivita způsobená Cistanche deserticola u hlodavců. J Ethnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.

[6] Choi, J.G; Měsíc, M; Jeong, H.U; Kim, M.C; Kim, S.Y; Oh, MS Cistanches Herba zlepšuje učení a paměť tím, že indukuje nervový růstový faktor. Behaviorální výzkum mozku. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Srovnání mezi Cistanche deserticola Y. C. Ma a C, tubulosa (Shenk) Wight na některých farmakologických účincích. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu X.F, Zeng G.Z, et al . Studie zvýšení sexuální potence C. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng G.Z, He W, Wu G.L, et al. Srovnání mezi Cistanche deserticola Y. C. Ma a C.tubulosa hmotnost na některé farmakologické účinky. J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng Q.L, Zheng Y.F, Lu Z.L. Imunomodulační účinky polysacharidu Cistanche deserticola Y. C. Ma. J Zhejiang Univ, Med Sci. 2002, 31(4): 284- 287.

[11] Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Pokroky ve výzkumu chemických složek a léčivé činnosti Cistanche. Čínské zdroje divokých rostlin, 2010, 29(1):7-11.

[12] Du N.S, Wang H, Yi YH. Izolace a identifikace fenylethanoidních glykosidů z Cistanche deserticola. Nat Prod R & D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu N.S, Liu J.L. Stanovení fenylethanoidních glykosidů v Cistanche deserticola makroretikulární pryskyřičnou spektrofotometrií. Nat Prod R & D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong Q.B, Tezuka Y, Kaneko T a kol. Inhibice oxidu dusnatého fenylethanoidy v aktivovaných makrofágech.

European Journal of Pharmacology, 2000, 400: 137- 144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan a kol. Strukturní analýza ve vodě rozpustného polysacharidu SPA izolovaného ze stonku Cistanche Deserticola Ma. Chemical Journal of Chinese Universities, 2005, 26(3):461-463.

[16] Wang Siang-jen. Studie imunitní farmakologie a absorpčního charakteru polysacharidů Cistanche deserticola. 2011, č. S1, Medicína a zdravotní vědy, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Hepatoprotektivní aktivita fenylethanoidů z Cistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.

[18] Handbook of Amylases and Related Enzyms (ed. by The Amylase Research Society of Japan), Pergamon Press (1988).

[19] Araya, S. (ed.) Proceedings of the 5th Conference on Dental Caries and Coupling Sugar (v japonštině), National Institute of Health, Tokyo (1980)

[20] Kodo Otaka. Funkční oligosacharid a jeho nový aspekt jako imunitní modulace. J. Biol. Macromol. 2006, 6(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polysacharidy z horkovodních extraktů z pražených fazolí Coffea arabica: Izolace a charakterizace. Karbohydr. Polym.1999, 40:71–81.

[22] Dubois M, Gilles K.A, Hamilton J.K, Rebers PA, Smith F. Kolorimetrická metoda pro stanovení cukrů a příbuzných látek. Anal. Chem. 1956, 28:350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Analýza monosacharidových složek v polysacharidech Angelica pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Anální Sci. 2005, 21:1177–1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan a kol. Extrakce a purifikace lektinu z červených ledvinových fazolí a předběžné studie imunitních funkcí lektinu a čtyř čínských bylinných polysacharidů. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2010:1-9.

[25] Cunningham, A. J. a A. Szenberg. Další zlepšení techniky plaku pro detekci jednotlivých buněk tvořících protilátky. Imunologie.1968, 14:599-600.

[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura a kol. Immunobiological Activities of a Porin Fraction Isolated from Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. Infekce a imunita. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang M.Q, Guilbert L.J, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu S.R, Pang P, Shan J.J. Imunomodulační aktivita CVT-E002: patentovaný extrakt ze severoamerického ženšenu (Panax quinque folium). J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard C.S, Kiyohara H, Reynolds J.C, Thomas-Oates J.E, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen B.S. Struktury a vztahy mezi strukturou a aktivitou tří mitogenních a komplementově fixujících pektických arabinogalaktanů z malijských protiuhlíren Cochlospermum tinctorium A. Rich a Vernonia kotschyana Sch Bip. ex Walp. Biomakromolekuly. 2006, 7:71–79.

[29] E.-M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim a J.-K. Hwang, Imunomodulační aktivita Arabinogalaktanu a Fukoidanu in vitro. Journal of Medicinal Food. 2005, 8(4):446–453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian, et al. Hodnocení a porovnání imunoregulační aktivity čtyř hydrorozpustných frakcí Angelica Sinensis in vitro na peritoneálních makrofágech u myší ICR. Mezinárodní imunofarmakologie. 2010, 10:422–430.

[31] Y. S. Lee, O. K. Han, C. W. Park a kol. Prozánětlivá genová exprese cytokinů a regulace oxidu dusnatého vodného extrahovaného Astragali radix v buňkách makrofágů RAW 264.7. Journal of Ethnopharmacology. 2005, 100(3): 289–294.

[32] K. Y. Lee a Y. J. Jeon. Polysacharid izolovaný z Poria cocos sclerotium indukuje aktivaci NF-κB/ Rel a expresi iNOS v myších makrofágech. Mezinárodní imunofarmakologie. 2003, 3(10-11):1353–1362.