Klonování, funkční identifikace a analýza exprese chalkonsyntázy z Cistanche Tubulosa

Abstrakt: Cíl Studovat funkci chalkonsyntázy z Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) a vzor exprese genu CtCHS v bílých, červených a fialových květech.

Metody Gen CtCHS byl klonován pomocí RT-PCR a byla provedena bioinformatická analýza. Plazmid pET-28a-CtCHS byl přenesen do Escherichia coli, aby se indukovala proteinová exprese pomocí IPTG. Rekombinantní protein CtCHS byl inkubován se substráty p-kumaroyl CoA a malonyl CoA a produkty byly detekovány pomocí HPLC a MS. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS byl přenesen do protoplastu Arabidopsis thaliana za účelem pozorování subcelulární lokalizace proteinu CtCHS. Vzorec exprese CtCHSgene v květechC. tubulosase třemi barvami byla detekována pomocí qRT-PCR.

Výsledky Byl klonován gen CtCHS. Délka otevřeného čtecího rámce (ORF) byla 1173 bp, kódující 390 aminokyselin, a molekulová hmotnost proteinu byla 42 8000. CtCHS obsahoval katalytické zbytky Cys164, His303, Asn336, které byly konzervovány v chalkonsyntáze. CtCHSprotein byl exprimován v E. coli a purifikován za získání rekombinantního proteinu. Protein CtCHS by mohl katalyzovat p-kumaroyl CoA a malonyl CoA za vzniku naringeninového chalkonu. Protein CtCHS byl lokalizován hlavně v cytoplazmě. Gen CtCHS se hojně exprimoval ve fialových a červených květech a relativní úrovně exprese byly 8,44krát a 3,21krát vyšší než u w hiteflowers, v daném pořadí.

Závěr Gen CtCHS byl klonován z květuC. tubulosaa protein byl exprimován. Protein CtCHS má funkci chalkonsyntázy a exprese genu CtCHS je vyšší v tmavších květech, což naznačuje, že gen CtCHS může regulovat barvu květů C. tubulosa, což pokládá základ pro další výzkumregulační mechanismus barvy květu C. tubulosa.

klíčová slova:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; chalkonsyntáza; analýza aktivity enzymů; subcelulární lokalizace; expresivní analýza

KLIKNĚTE ZDE A ZÍSKEJTE PŘÍRODNÍ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 30 % ECHINAKOSIDU A 12 % AKTEOSIDU

Supporting Service Of Wecistanche-Největší vývozce cistanche v Číně:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Nakupujte pro další specifikace Podrobnosti:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Biosyntetickýcesta flavonoidůzačíná fenylpropanoidovou cestou.fenylalaninse nejprve přemění na kyselinu skořicovou podpůsobení fenylalanin amonialyázy(PAL) a kyselina skořicová je 4-hydroxylována kyselinou skořicovou. Enzym (kyselina skořicová-4-hydroxyláza, C4H) a 4-ligáza kumarátkoenzymu A (4-ligáza kumarátkoenzym A, 4CL) katalyzují reakci za vzniku 4-kumaroyl-CoA [11 ]. Jedna molekula 4-kumaroyl-CoA a tři molekuly malonyl-CoA jsou katalyzovány chalkonsyntázou (CHS) za vzniku naringenin chalkonu, který má flavonoidní sloučeniny Základní kostra chalkonizomerázy, flavanon{12}}hydroxylázy, dihydroflavonol 4-reduktáza atd. vytváří různé flavonoidy, jako jsou isoflavony, flavonoly, antokyany atd. [12]. CHS jako klíčový enzym v biosyntetické dráze flavonoidů reguluje obsah flavonoidů v rostlinách a hraje také důležitou roli při regulaci barvy květů rostlin [13]. Například posttranskripční umlčení genu Gentiana scabra Bunge CHS může inhibovat biosyntézu antokyanů a způsobit specifické zbělení korunních laloků [14]. Umlčení genu CHS Actinidia erianthaBenth. CHS snižuje obsah anthokyanů v okvětních lístcích a činí okvětní lístky červené. Okvětní lístky jsou světlejší[15]. Proto byl v této studii gen CtCHS klonován z květů Cistanche tubulosa a byla na něm provedena bioinformatická analýza, prokaryotická exprese a purifikace, analýza aktivity enzymů, analýza subcelulární lokalizace a analýza exprese ve třech barvách květů za účelem prozkoumání funkce CtCHS protein a expresní vzor genu CtCHS byly použity k předběžnému prozkoumání vztahu mezi CtCHS a barvou květu Cistanche tubulosa, což položilo základ pro studium regulačního mechanismuBarva květu Cistanche tubulosa.

1 Materiály a nástroje

1.1 Materiály

Květy Cistanche tubulosa byly shromážděny z okresu Yutian, prefektura Hotan, Xinjiang v květnu 2018. Při vzorkování byl dodržován náhodný princip a byly vybrány květiny Cistanche tubulosa s dobrým fyziologickým stavem a konzistentní výškou rostlin. Tři kmeny Cistanche tubulosa se třemi barvami květů bílou, červenou a fialovou byly odebrány a identifikovány jako Cistanche tubulosa (Schenk) Wight profesorem Tu Pengfei z Pekingské univerzity Pharmacy. Byly rychle zmraženy v kapalném dusíku a poté převezeny do Pekingu ve skladu suchého ledu. Chemicky kompetentní buňky E. coli DH5 byly zakoupeny od Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd. a chemicky kompetentní buňky E. coli BL21 (DE3) byly zakoupeny od společnosti Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor byl zakoupen od Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA byl zakoupen od Sigma Company, 4-kumaroyl-CoA, naringenin -chalcon byly zakoupeny od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. a naringenin byl zakoupen od Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Nástroje

spektrofotometr Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, USA); gradientový PCR přístroj (Eppendorf Company, Německo); CFX 96 fluorescenční kvantitativní PCR přístroj, UVP gel imager, přístroj pro gelovou elektroforézu, přístroj pro proteinovou elektroforézu (BioRad Company, USA) ;EnSpire

čtečka mikrodestiček (PerkinElmer Company, USA); inkubátor s konstantní teplotou (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D velkokapacitní plnoteplotní oscilátor (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Oscilátor konstantní teploty vodní lázně (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); ultračistý pracovní stůl AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); vysokotlaký parní sterilizátor (TOMY Company, Japonsko); přístroj na čistou vodu Milli Q (Millipore, Spojené státy americké); LC-20Vysoce účinný kapalinový fázový chromatograf (Shimadzu Company, Japonsko); hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, USA); Laserový konfokální mikroskop FV1200 (Olympus Company, Japonsko).

2 Experimentální metody

2.1 Extrakce RNA a syntéza cDNA.

Květy Cistanche tubulosa byly rozemlety v kapalném dusíku a poté podrobeny testu extrakce RNA.

Celková RNA byla extrahována pomocí soupravy (Norgen, Cat 17200), koncentrace a kvalita RNA byly detekovány pomocí NanoDrop 2000C a vzorky RNA s poměrem A260/A280 mezi 1,8 a 2,1 byly vybrány pro reverzní transkripci k syntéze cDNA. Reverzní transkriptáza M-MLV (Promega, M170B) byla použita k reverzní transkripci kvalifikované celkové RNA do cDNA. Experimentální operace byly provedeny podle návodu.

2.2 Klonování genu CtCHS

Na základě dat o transkriptomu květu Cistanche tubulosa naší výzkumné skupiny [16] byl vytříděn CtCHS s kompletním otevřeným čtecím rámcem a k návrhu specifických primerů na základě genové sekvence byl použit software SnapGene (Tabulka 1). PCR amplifikace byla provedena za použití cDNA květu Cistanche tubulosa jako templátu. Amplifikační systém byl 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, upstream a downstream primery (10 μmol/L), každý 2 μL, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL, ddH2O 17 μl. Reakční podmínky byly: předdenaturace při 95 stupních po dobu 3 minut; 25 cyklů denaturace při 95 stupních po dobu 15 s, žíhání při 55 stupních po dobu 15 s a extenze při 72 stupních po dobu 1 minuty; prodloužení reakce při 72 stupních po dobu 5 minut. Produkt PCR byl detekován elektroforézou na 1% agarózovém gelu a pro získání gelu byla použita souprava pro purifikaci DNA (Novizan, Cat DC301-01) a poté byla získaná DNA purifikována soupravou pro rychlé klonování (Novizan, Cat C601-01). Fragment DNA byl ligován s vektorem pCE2TA/Blunt-Zero, transformován do kompetentních buněk Escherichia coli DH5 a po kultivaci přes noc při 37 stupních byly vybrány jednotlivé klonové kmeny a odeslány společnosti k sekvenování.

Tabulka 1 Sekvence primerů

2.3 Bioinformatická analýza

Použijte online software ProtParam k analýze fyzikálních a chemických vlastností proteinů; použijte online nástroj Prot Scale k analýze hydrofilnosti/hydrofobicity proteinů; použít online nástroj SOPMA k predikci sekundární struktury proteinu; používat online analytický software SWISS-MODEL k predikci terciární struktury proteinu; použijte online software TMHMM Předpovězte transmembránovou strukturu proteinu; použít software DNAMAN k porovnání homologie CtCHS s aminokyselinovými sekvencemi CHS jiných druhů; pomocí softwaru MEGA-X zkonstruujte fylogenetický strom pomocí soused-joiningu (NJ) a Poissonovy korekce. Evoluční vzdálenost se vypočítá pomocí metody Bootstrap a počet opakování Bootstrapu je 1000krát.

2.4 Prokaryotická exprese a purifikace CtCHS

Navrhněte primery s restrikčními místy BamHⅠ a XhoⅠ na základě CtCHS sekvence a PCR amplifikujte odpovídající cílové fragmenty. Vektor pET{0}}a a cílový fragment byly štěpeny pomocí endonukleáz BamHI a Klonovaný kmen je sekvenován a plazmid je extrahován po správném sekvenování. Plazmid pET-28a-CtCHS ověřený sekvenováním byl přenesen do kompetentních buněk Escherichia coli BL21 (DE3). Viz metoda Ding Ning et al. [17] isopropylem

-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) byl použit k indukci exprese proteinu při nízké teplotě a byl purifikován pomocí Ni2+ afinitní chromatografické kolony (Cytiva, kat. 17531901). Protein byl zakoncentrován centrifugací v ultrafiltrační zkumavce (Millipore, 30 000) a odsolen. Uchovávejte ve 20 mmol/l pufru KPB (pH 8,0, obsahující 1 mmol/LEDTA) a uchovávejte v chladničce při teplotě -80 stupňů pro dlouhodobé skladování.

2.5 Analýza aktivity enzymu CtCHS

CtCHS enzymatický reakční systém: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS rekombinantní protein 20 μl, v Po reakci ve vodní lázni při 37 stupních po dobu 12 hodin byla směs třikrát extrahována 800 μl ethylacetátu, vysušena proudem dusíku a poté rozpuštěna ve 100 μl methanolu. K detekci produktu použijte vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii. Podmínky jsou kolona Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), teplota kolony 30 stupňů, objem vzorku 10 μl a voda (A) a acetonitril (B) jako průtok. Fáze, eluční gradient: 0~10

min, 30 % B; 10-20 min, 30%-60% B; 20-25 min, 60%-70% B; 25-30 min, 70%-80% B; 30-35 min, 80%-100% B; 35-40 min, 100 % B; 40-46 min, 100 %-30 % B. Objemový průtok je 1 ml/min a detekce je při vlnové délce 290 nm.

Pro další detekci byl použit UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Podmínky kapalné fáze byly kolona Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), teplota kolony 40 stupně, naringenin- kontroly chalconu a naringeninu. Plnicí objem produktu je 4 μl a plnící objem produktu enzymové reakce je 7 μl. Jako mobilní fáze se používá voda (A)-acetonitril (B). Eluční gradient je: 0 až 5 min, 30 % B; 5 až 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60 %-100 % B; 20-25 min, 100 % B; 25-31 min, 100 %-30 % B. Objemový průtok je 0,3 ml/min. Podmínky hmotnostní spektrometrie jsou elektrosprejový iontový zdroj, dusík jako nosný plyn, tlak plynového pláště 3,5 MPa, tlak pomocného plynu 1,0 MPa, tlak rozprašování 3500 V, teplota kapiláry 350 stupňů, teplota pomocného ohřevu plynu 200 stupňů, pozitivní a negativní iontové režimy, skenování rozsah iontů m/z je 100-1500, plné rozlišení MS je 35 000, rozlišení dd-MS2 je 17 500, (N)

CE/krokované nce nastaveno na 35, 60.

2.3 Bioinformatická analýza

Použijte online software ProtParam k analýze fyzikálních a chemických vlastností proteinů; použijte online nástroj Prot Scale k analýze hydrofilnosti/hydrofobicity proteinů; použít online nástroj SOPMA k predikci sekundární struktury proteinu; používat online analytický software SWISS-MODEL k predikci terciární struktury proteinu; použijte online software TMHMM Předpovězte transmembránovou strukturu proteinu; použít software DNAMAN k porovnání homologie CtCHS s aminokyselinovými sekvencemi CHS jiných druhů; pomocí softwaru MEGA-X zkonstruujte fylogenetický strom pomocí soused-joiningu (NJ) a Poissonovy korekce. Evoluční vzdálenost se vypočítá pomocí metody Bootstrap a počet opakování Bootstrapu je 1000krát.

2.4 Prokaryotická exprese a purifikace CtCHS

Navrhněte primery s restrikčními místy BamHⅠ a XhoⅠ na základě CtCHS sekvence a PCR amplifikujte odpovídající cílové fragmenty. Vektor pET{0}}a a cílový fragment byly štěpeny pomocí endonukleáz BamHI a Klonovaný kmen je sekvenován a plazmid je extrahován po správném sekvenování. Plazmid pET-28a-CtCHS ověřený sekvenováním byl přenesen do kompetentních buněk Escherichia coli BL21 (DE3). Viz metoda Ding Ning et al. [17] isopropylem

-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) byl použit k indukci exprese proteinu při nízké teplotě a byl purifikován pomocí Ni2+ afinitní chromatografické kolony (Cytiva, kat. 17531901). Protein byl zakoncentrován centrifugací v ultrafiltrační zkumavce (Millipore, 30 000) a odsolen. Uchovávejte ve 20 mmol/l pufru KPB (pH 8,0, obsahující 1 mmol/LEDTA) a uchovávejte v chladničce při teplotě -80 stupňů pro dlouhodobé skladování.

2.5 Analýza aktivity enzymu CtCHS

CtCHS enzymatický reakční systém: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS rekombinantní protein 20 μl, v Po reakci ve vodní lázni při 37 stupních po dobu 12 hodin byla směs třikrát extrahována 800 μl ethylacetátu, vysušena proudem dusíku a poté rozpuštěna ve 100 μl methanolu. K detekci produktu použijte vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii. Podmínky jsou kolona Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), teplota kolony 30 stupňů, objem vzorku 10 μl a voda (A) a acetonitril (B) jako průtok. Fáze, eluční gradient: 0~10

min, 30 % B; 10-20 min, 30%-60% B; 20-25 min, 60%-70% B; 25-30 min, 70%-80% B; 30-35 min, 80%-100% B; 35-40 min, 100 % B; 40-46 min, 100 %-30 % B. Objemový průtok je 1 ml/min a detekce je při vlnové délce 290 nm.

Pro další detekci byl použit UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Podmínky kapalné fáze byly kolona Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), teplota kolony 40 stupně, naringenin- kontroly chalconu a naringeninu. Plnicí objem produktu je 4 μl a plnící objem produktu enzymové reakce je 7 μl. Jako mobilní fáze se používá voda (A)-acetonitril (B). Eluční gradient je: 0 až 5 min, 30 % B; 5 až 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60 %-100 % B; 20-25 min, 100 % B; 25-31 min, 100 %-30 % B. Objemový průtok je 0,3 ml/min. Podmínky hmotnostní spektrometrie jsou elektrosprejový iontový zdroj, dusík jako nosný plyn, tlak plynového pláště 3,5 MPa, tlak pomocného plynu 1,0 MPa, tlak rozprašování 3500 V, teplota kapiláry 350 stupňů, teplota pomocného ohřevu plynu 200 stupňů, pozitivní a negativní iontové režimy, skenování rozsah iontů m/z je 100-1500, plné rozlišení MS je 35 000, rozlišení dd-MS2 je 17 500, (N)

CE/krokované nce nastaveno na 35, 60.

2.6 Subcelulární lokalizace proteinu CtCHS

Na základě sekvence CtCHS a principu bezproblémového klonování byly navrženy primery s místy štěpení enzymu KpnⅠ a BamHⅠ a odpovídající cílové fragmenty byly amplifikovány pomocí PCR. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP byl štěpen restrikčními endonukleázami Kpn Ⅰ a BamH Ⅰ a cílový fragment a vektor byly spojeny pomocí bezproblémové klonovací soupravy (Novizan, Cat C115-01) a poté přeneseny do E. coli DH5 kompetentních buněk. , vyberte jednotlivé klonové kmeny pro sekvenování a extrahujte plazmidy ze správných kmenů. Plazmidy pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS a pCAMBIA 1300-35S-GFP byly transformovány do protoplastů Arabidopsis thaliana pomocí PEG4000 a kultivovány při slabém osvětlení po dobu 8 až 10 hodin. Subcelulární lokalizace proteinu CtCHS byla pozorována pod laserovým konfokálním mikroskopem.

2.7 Analýza vzoru exprese CtCHS

Fluorescenční kvantitativní primery v reálném čase byly navrženy pomocí DNAMAN na základě sekvence CtCHS, s F-boxem jako vnitřním referenčním genem. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce 1. Relativní exprese CtCHS v květech Cistanche tubulosa různých barev byla detekována fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase. Použijte TransStart Green qPCR SuperMix (plná zlatá, AQ101-02) pro měření fluorescenční metodou SYBRGreen. Reakční systém: 2× TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, upstream a downstream primery (10 μmol/L) 0,2 μl každý, cDNA templát 0,5 μL, bylo použito 4,1 μl vody bez nukleotidázy pro reakci za použití dvoukrokové metody. Reakční postup byl založen na metodě Dong Xianjuan et al. [18]. Každý vzorek obsahoval 3 biologické replikáty a experiment se opakoval třikrát. Experimentální data byla analyzována pomocí Excelu, relativní exprese CtCHS byla vypočtena pomocí 2−ΔACt metody a GraphPadPrism 8 byl použit k provedení analýzy významnosti a vykreslení histogramů.