Klonování, funkční identifikace a analýza exprese chalkonsyntázy z Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 Výsledky a analýza

3.1 Klonování genu CtCHS

Čtyři sekvence označené jako "chalkonsyntáza" byly vytříděny pomocí transkriptomových dat květů Cistanches tubulosa. Prostřednictvím srovnání NCBI Blast bylo zjištěno, že pouze jedna sekvence měla plnou délku genu CHS a měla FPKM větší než 10. Na základě této sekvence byly navrženy specifické primery a fragment o velikosti přibližně 1200 bp byl získán amplifikací PCR za použití cDNA květu Cistanches tubulosa jako templát (obrázek 1). Produkt PCR byl získán z gelu a připojen k vektoru pCE2TA/Blunt-Zero. Výsledky sekvenování byly v souladu s analýzou transkriptomu. Gen byl pojmenován CtCHS. Délka sekvence je 1173 bp a kóduje 390 aminokyselin.

Supporting Service Of Wecistanche-Největší vývozce cistanche v Číně:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Nakupujte pro další specifikace Podrobnosti:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

3.2 Bioinformatická analýza CtCHS

3.2.1 Fyzikální a chemické vlastnosti CtCHS a analýza transmembránové domény

K analýze fyzikálních a chemických vlastností proteinu kódovaného genem CtCHS byl použit online software ProtParam. CtCHS kóduje 390 aminokyselin, molekulový vzorec je C1908H3041N511O562S22, relativní molekulová hmotnost je 42 836,54, teoretický izoelektrický bod je 5,85 a je nestabilní. Koeficient II je 43,24, což je nestabilní protein, a celková průměrná hydrofilita (GRAVY) je -0,052, což je hydrofilní protein. Online nástroj Prot Scale byl dále použit k analýze hydrofilnosti/hydrofobicity proteinu. Výsledky analýzy ukázaly, že maximální hodnota hydrofilnosti/hydrofobicity proteinu CtCHS byla 2,422 (342) a minimální hodnota byla -2,489 (119). Aminokyselinový peptidový řetězec kódovaný genem CtCHS má více hydrofilních aminokyselinových zbytků než hydrofobních aminokyselinových zbytků, jedná se tedy o hydrofilní protein. K predikci transmembránové struktury proteinu byl použit online software TMHMM. Protein CtCHS nemá žádnou transmembránovou doménu.

Obr. 1 PCR amplifikace genu CtCHS

3.2.2 Predikce sekundární struktury a terciární struktury proteinu CtCHS

K predikci sekundární struktury proteinu byl použit online nástroj SOPMA. Výsledky jsou znázorněny na obrázku 2-A. 44,87 % -helixů, 31,03 % náhodných spirál, 15,64 % prodloužených řetězců a 8,46 % -listů tvoří sekundární strukturu proteinu CtCHS. struktura úrovní. K predikci terciární struktury proteinu byl použit online analytický software SWISS-MODEL a krystalová struktura rýžového CHS1 byla použita jako templát k predikci trojrozměrné struktury proteinu CtCHS. Výsledky jsou znázorněny na obrázku 2-B. Konzistence mezi Cistanche tubulosa CtCHS a rýží CHS1 je 83,55 %.

3.2.3 Porovnání sekvencí a analýza a aplikace fylogenetického stromu

Software DNAMAN provádí srovnání homologie mezi CtCHS a aminokyselinovými sekvencemi CHS jiných druhů. Výsledky jsou znázorněny na obrázku 3-C. Aminokyselinová sekvence CtCHS je konzistentní s Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) a Antirrhinum majus L. (P06515.1), Mazus pumilus (NL Burman)Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1) a Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Aminokyselinové sekvence CHS jsou velmi podobné, přičemž podobnost je 90,93 %, 90,68 %, 90,18 %, 89,42 %, 89,42 % a 81,61 %.

PŘÍRODNÍ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 30 % ECHINAKOSIDU A 12 % AKTEOSIDU

Kromě toho, vícenásobné zarovnání sekvencí také ukázalo, že CtCHS má konzervované katalytické zbytky Cys164, His303 a Asn336. Aby bylo možné dále porozumět evoluční pozici Cistanche tubulosa CtCHS v rostlinné rodině CHS, byl použit software MEGA-X ke konstrukci fylogenetického stromu mezi proteiny CtCHS a CHS jiných rostlin. Výsledky jsou znázorněny na obrázku 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS úzce souvisí.

3.3 Prokaryotická exprese a purifikace CtCHS

Plazmid pET{0}}a-CtCHS byl transformován do expresního kmene E. coli BL21 (DE3) a exprese proteinu byla indukována pomocí IPTG při nízké teplotě. Protein byl purifikován pomocí nikl-iontové afinitní chromatografické kolony a purifikovaný protein byl detekován pomocí 10% SDSPAGE. Výsledky jsou ukázány na obrázku 3. Proužek proteinu CtCHS se objevil blízko 40,000, což je v souladu s relativní molekulovou hmotností proteinu CtCHS 42 800.

3.4 Analýza aktivity enzymu CtCHS

Pro identifikaci funkce CtCHS byl purifikovaný protein CtCHS inkubován s malonyl-CoA, 4-kumaroyl-CoA a produkty byly detekovány pomocí HPLC a MS. Za přirozených podmínek je naringenin-chalkon v roztoku nestabilní a snadno se cyklizuje na naringenin. Proto byly jako standardní kontroly vybrány naringenin-chalkon a naringenin.

Výsledky testu HPLC jsou uvedeny na obrázku 4-A a B. Retenční čas produktu enzymové reakce je podobný jako u standardu naringeninu. Oba mají maximální absorpci při 289 nm v UV absorpčním spektru, což se liší od retenčního času naringeninu-chalkonu. Časová a UV absorpční spektra byla různá, ale jako negativní kontrola produkt po inkubaci vysokoteplotně inaktivovaného proteinu CtCHS se substrátem neobsahoval naringenin, chalkon a naringenin. Další detekce pomocí hmotnostní spektrometrie, hmotnostní spektrum první úrovně (obrázek 4-C, D) ukázalo, že produkt enzymové reakce má [MH]-pík m/z271.060 97, zatímco naringenin má [MH] ]-vrchol m/z 271.{13}}.

Při srovnání spekter MS2 (obrázek 5-E, F) mají produkt enzymatické reakce CtCHS a naringenin charakteristické fragmentové píky při m/z 107, 151 a 177, což je v souladu se zprávou z literatury [19], což ukazuje, že CtCHS má chalkonový komplex. Enzymatická aktivita, může katalyzovat reakci malonyl-CoA a 4-kumaroyl-CoA na naringenin-chalkon.

3.5 Analýza subcelulární lokalizace

Aby bylo možné studovat roli proteinu CtCHS v buňkách, byl zkonstruován plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS a transformován do protoplastů Arabidopsis thaliana za účelem pozorování jeho subcelulární lokalizace. Výsledky jsou znázorněny na obrázku 5. Jako kontrola byl protein pCAMBIA1300-35S-GFP distribuován v jádře a cytoplazmě, zatímco fúzní protein pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS byl distribuován hlavně v cytoplazmě, což ukazuje, že protein CtCHS může fungovat v cytoplazmě rostlinných buněk. Funkce.

3.6 Analýza vzoru exprese CtCHS

qRT-PCR byla použita k detekci relativní exprese CtCHS v květech Cistanche deserticola se třemi barvami: bílou, fialovou a červenou. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 6. Exprese CtCHS ve fialových a červených květech byla významně vyšší než v bílých květech. Množství. Ve srovnání s bílými květy je úroveň exprese CtCHS u fialových květů 8,44krát vyšší a úroveň exprese CtCHS u červených květů je 3,21krát vyšší. Tyto výsledky ukazují, že změny v hladinách exprese CtCHS mohou souviset s rozdílem v barvě květů Cistanche deserticola. Čím vyšší je úroveň výrazu, tím tmavší je barva květu. , čím nižší je úroveň výrazu, tím světlejší je barva květu.

****P＜0.000 1Obr. 6 Relativní úroveň exprese CtCHS v květech s různými barvami

4. Diskuze

CHS je aklíčový enzym v biosyntetické dráze flavonoidůa souvisí s the regulace barvy květův mnoha rostlinách. Například barva květuDianthus chinensisL.[20] a Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] jsou všichni postiženi CHS. řízení.Cistanches tubulosamá hlavně tři barvy květů: bílou, červenou a fialovou, ale mechanismus regulace barvy květů nebyl dosud popsán. V této studii byl gen CtCHS klonován pomocí RT-PCR prostřednictvímanalýza transkriptomových dat květin Cistanches tubulosa, a jeho

Bioinformatická analýzabyla provedena a výsledky ukázaly, že CtCHS má vysokou podobnost a blízký genetický vztah s aminokyselinovou sekvencí ElCHS Physalis nigra (AHJ80976.1). CHS je polyketidsyntáza typu III (PKSIII) a studie zjistily, že CHS má konzervovanou Cys-His-Asn katalytickou triádu [23]. V této studii analýza zarovnání aminokyselinové sekvence ukázala, že CtCHS má konzervované katalytické zbytky Cys164, His303 a Asn336, což ukazuje, že CtCHS může mít typickou funkci chalkonsyntázy.

schopný. Analýza aktivity enzymu byla provedena pomocí prokaryotické exprese proteinu CtCHS v Escherichia coli a detekována pomocí HPLC a MS. Bylo zjištěno, že protein CtCHS může katalyzovat 4-kumaroyl-CoA a malonyl-CoA za vzniku naringeninu-chalkonu.

CHS se podílí na syntéze flavonoidů v mnoha rostlinách, ale její subcelulární umístění je u různých druhů odlišné. Například Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. EaCHS[26] jsou všechny umístěny v cytoplazmě, zatímco Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], lilek Solanum melongena L. SmCHS [28] se nachází v cytoplazmě a jádře a u hroznů Vitis vinifera L. VvCHS se nachází v cytoplazmě, jádře a buněčné stěně [29]. V této studii byl k transformaci protoplastů Arabidopsis thaliana použit plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS a bylo pozorováno, že protein CtCHS byl lokalizován hlavně v cytoplazmě a může katalyzovat produkci naringeninu-chalkonu v cytoplazmě podporují akumulaci flavonoidů.

Fenylpropanoidní dráha se větví z 4-kumaroyl-CoA do dráhy syntézy flavonoidů a dráhy biosyntézy lignanu. CHS katalyzuje 4-kumaroyl-CoA a malonyl-CoA za vzniku naringeninu a chalkonu za účelem iniciace flavonoidů. Biosyntetická dráha sloučenin podobných sloučenin je prvním klíčovým enzymem v této dráze [30]. Proto je vysoce exprimovaný CHS prospěšný pro rostliny, aby akumulovaly vyšší hladiny flavonoidů a produkovaly tmavší květy. Například hladina exprese CHS u fialově kvetoucích odrůd Hosta plantaginea (Lam.) Aschers je vyšší než u bílokvětých odrůd. Hosta HpCHS se transformuje na tabák, aby se získal Ve srovnání s tabákem divokého typu mají rostliny s nadměrnou expresí tmavší okvětní lístky a vyšší celkový obsah anthokyanů [31].

V této studii souvisí úroveň exprese genu CtCHS s barvou květů Cistanches tubulosa. Vyznačuje se tmavšími fialovými květy a červenými květy a nízkým počtem světle zbarvených bílých květů. Rozdíl v expresi CtCHS může být způsoben rozdílem v květech Cistanches tubulosa. Jeden z důvodů, proč mít různé obleky a barvy. Stručně řečeno, tato studie klonovala gen CtCHS z květin Cistanche deserticola a provedla na něm bioinformatickou analýzu. Rekombinantní protein CtCHS byl získán exogenní expresí v Escherichia coli. Analýza aktivity enzymu prokázala, že protein CtCHS může katalyzovat 4-kumaroylkoenzym. A a malonyl-koenzym A generují naringenin-chalkon. Bylo zjištěno, že gen CtCHS je vysoce exprimován ve fialových a červených květech a málo v bílých květech. Tyto výsledky naznačují, že gen CtCHS může regulovat produkci různých barev květů u Cistanche deserticola, což je přínosné pro další výzkum regulačního mechanismu barvy květů Cistanche tubulosa a poskytuje odkaz pro následný výzkum úlohy CtCHS v regulaci barva květu v Cistanche deserticola.