Esenciální oleje obsahující citral jako potenciální inhibitory tyrosinázy: Přístup k frakcionaci s biologickým průvodcem

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstraktní:

Nadměrná produkce melaninu způsobuje vážné dermatologické stavy i drobné estetické problémy (např. pihy a solární lentigo). Snížení hladiny tyrosinázy je široce rozšířeným přístupem k léčbě těchto poruch a rostlinné extrakty se často ukázaly jako cenné zdrojetyrosinázainhibitory. Citral (směs nerálu a geranialu) je důležitá vonná složka, která prokázala antityrosinázový potenciál. Je vysoce koncentrovaný v esenciálních olejích (EO) Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. a Verbenaofficinalis L. Avšak pouze L. cubeba EO byl zkoumán pro použít jako potenciální bělící prostředek na kůži. Tato práce hodnotí in vitrotyrosinázainhibiční aktivita těchto EO a studie s použitím frakcionace orientované na biotest, zda jejich odlišné chemické složení ovlivňuje celkové inhibiční aktivity EO prostřednictvím možných synergických, aditivních a/nebo kompetitivních interakcí mezi složkami EO. Inhibiční aktivita EO C. schoenanthus a EO M. officinalis, se zanedbatelným množstvím (plus)-citronellalu, byla v souladu s jejich obsahem citralu. Na druhé straně L. cubeba a V. officinalis EO inhibovalytyrosinázav podstatně větší míře, protože obsahovaly -myrcen, což přispělo k celkovým aktivitám EO. Podobná pozorování byla provedena pro M. officinalis EO, který má vysoký obsah (plus)-citronellalu, který zvyšuje citralovou aktivitu.

klíčová slova:tyrosinázainhibice; éterické oleje; citral

cistanche má bělící funkci

Úvod

tyrosinázaje klíčovým enzymem při biosyntéze melaninových pigmentů u několika bakterií, hub, rostlin, zvířat a lidí. U lidí tyrosináza katalyzuje kroky omezující rychlost v biosyntetické dráze melaninu. Tato biosyntéza je charakterizována několika enzymatickými a chemickými reakcemi, které vedou k tvorbě melaninu z aminokyseliny L-tyrosinu, přičemž tyrosináza katalyzuje jeho hydroxylaci na o-dopachinon prostřednictvím mykofenolátových a difenolových aktivit. Přestože se na melanogenezi podílejí i další enzymy, pouze reakce katalyzované tyrosinázou nemohou spontánně proběhnout, zatímco zbývající kroky mohou probíhat bez enzymové aktivity při fyziologickém pH [1]. Z tohoto důvodu je downregulace tyrosinázy velmi rozšířeným přístupem ke snížení nadměrného množství melaninu. produkce a použití inhibitorů tyrosinázy jako bělících činidel prokázalo významný klinický a kosmetický význam [2].

Na trhu EU jetyrosinázainhibitory, které se používají jako činidla pro bělení kůže, lze seskupit do dvou hlavních kategorií: ty, které jsou zakázány podle nařízení EU o kosmetice 1223/2009 (tj. hydrochinon a mono benzylether hydrochinon) kvůli svým závažným vedlejším účinkům, ale stále se používají k léčbě hyperpigmentace podle lékařského předpisu. dohled; a inhibitory tyrosinázy, které jsou povoleny pro použití v kosmetických produktech (tj. arbutin, aloesin, kyselina kojová) [2,3]. Tato druhá skupina se však stále vyznačuje potenciálně významnými vedlejšími účinky; klinické studie kyseliny kojové skutečně poukázaly na případy erytému, pocitů štípání a kontaktního ekzému po aplikaci. Podobně Evropský vědecký výbor pro bezpečnost spotřebitelů vyjádřil obavy ohledně používání arbutiny jako kosmetické přísady [2] kvůli potenciální hydrolýze jeho glykosidické vazby, která uvolňuje hydrochinon. Existuje tedy potřeba nových templátů molekul a/nebo směsí bioaktivních sloučenin pro léčbu hyperpigmentace.

Rostliny jsou cenným zdrojem látek pro bělení kůže a tři z pěti nejpoužívanějších látek, jak lékařských, tak kosmetických, jsou specializované metabolity rostlin (tj. hydrochinon, -arbutin, aloesin). K dnešnímu dni byly fenolické sloučeniny v zásadě zkoumány jako potenciálnítyrosinázainhibitory, mezi něž patří flavonoidy (např. kvercetin [4]), stilbeny (např. resveratrol [1]), fenylpropanoidy (např. cinnamaldehyd [5] a eugenol [6]) a fenolové kyseliny (např. kyselina anisová a kyselina benzoová [7]). Zájem o forterpenoidy byl podstatně nižší a byly relativně málo zkoumány jako antityrosinázová činidla.

Citral patří mezi omezený počet terpenoidních derivátů s antityrosinázovými vlastnostmi, které byly studovány. Je to směs dvou izomerů, cis- a trans-3,7-dimethyl-2,6-oktadienalu (tj. neralu a geranialu), u kterých bylo prokázáno, že blokují enzymatická aktivita houby in vitrotyrosináza[8]. Kromě toho, že citral je důležitý jako vonná složka v nápojích, potravinách a kosmetice, vykazuje slibné biologické aktivity in vitro včetně protiplísňových, antibakteriálních, antioxidačních a protizánětlivých účinků [9–11]. zdůraznili, že citral má potenciální terapeutický význam jako uvolňovač hladkého svalstva a lokální anestetikum, protože podporuje relaxaci hladkého svalstva průdušnice, dělohy a aorty a na zvířecích modelech inhibuje dráždivost nervů [12–15].

Citral se získává z esenciálních olejů (EO) několika botanických druhů, včetně Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. a Verbena officinalis L. To nejlepší z autorů. Znalosti, pouze L. cubeba EO byla zkoumána pro svétyrosinázainhibiční aktivita [16]. Tato studie si proto klade za cíl vyhodnotit inhibiční aktivity EOs C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis a V. officinalis pomocí kolorimetrického testu in vitro, aby bylo možné posoudit, zda různá chemická složení ovlivňují celkové inhibiční aktivity EO prostřednictvím jakéhokoli možné synergické, aditivní a/nebo konkurenční interakce mezi jejich složkami. Tato studie využívá frakcionační přístup řízený biotestem ke komplexnímu vyhodnocení složek EOs a jejich enantiomerů, pokud jsou chirální, které přispívají k inhibiční aktivitě EO proti houbovému zdroji tyrosinázy, což je dobrý modelový systém pro předběžný screeningtyrosinázainhibitory [17].

2. Výsledky a diskuse

2.1. Chemické složení a obsah citralu zkoumaného esenciálního oleje

V našem pokusu komplexně charakterizovat všechny potenciální složky EO, které přispívají k uvažované biologické aktivitě, byly zkoumané EO analyzovány pomocí GC, s detekcí FID i MS. Byly stanoveny normalizované relativní procentuální abundance (vypočítané z absolutních ploch normalizovaných na vnitřní standard C13 pomocí faktorů odezvy [18,19]) všech detekovaných sloučenin a použity k porovnání složení EO. Obrázek 1 uvádí profil GC-MS zkoumaných EO analyzovaných konvenční kolonou. Tabulka 1 uvádí pro každý zkoumaný EO sloučeniny, které vykazovaly normalizované procentuální zastoupení nad 0,1, zatímco kompletní chemické složení EO jsou uvedeny v doplňkových materiálech (tabulky S1–S5).

Všechny zkoumané EO jsou bohaté na neral (cis{{0}},7-dimethyl-2,6-oktadienal) a geranial (trans-3,{ {5}}dimethyl-2,6-oktadienal), což jsou nejrozšířenější sloučeniny. Poměr Theneral/geranial byl u všech zkoumaných EO velmi podobný a odpovídal 0,74 ± 0,05. EO C. schoenanthus a L. cubeba vykazují nejvyšší nerální a geraniální obsah, který tvoří v průměru 60 procent jejich celkového složení EO, což je 1,{14}}krát více než u V. officinalis EO a v. tři M. officinalis EO (tj. vzorek 1, 2 a 3). Další okysličené sloučeniny, které jsou společné všem EO, jsou 6-methyl-5-hepten-1-one, linalool a citronellal. Posledně jmenovaný je významně hojnější v M. officinalis EO 1 než v ostatních zkoumaných EO, včetně M. officinalis EO2 a 3.

Množství uhlovodíkové frakce se významně liší v různých EOs.M. officinalis EO 1 obsahuje pouze trans- -karyofylen a -humulen jako seskviterpenové uhlovodíky, které tvoří 2,7 procenta, respektive 0,13 procenta celkového EO. C. schoenanthus EO představuje o něco bohatší uhlovodíkovou frakci než M. officinalis EO 1 (tj. 7.0 procent), obsahující oba monoterpeny (tj. kamfen, cis{{1{{20). }}}}ocimen, limonen, -pinen,trans- -ocimen, -thujene) a seskviterpeny (tj. množství. V L. cubeba a V. officinalis EO tvoří uhlovodíková frakce 20 procenta celkového EO a limonen je nejhojnější sloučeninou (tj. 15,0 a 10,9 procenta), následuje -pinen, pinen , sabinen, trans- -karyofylen, -myrcen, kamfen a -kopaen. Konečně M. officinalis EO 2 a 3 se vyznačují nejvyšším obsahem uhlovodíkové frakce (38,8 procent a 31,8 procent z celkového EO). V obou vzorcích obsahuje uhlovodíková frakce hlavně seskviterpeny, konkrétně trans- -karyofylen (27,8 procenta, respektive 20,0 procenta) a -humulen (3,0 procenta a 2,6 procenta) a redukovanou monoterpenovou frakci, která je charakteristická hlavně limonenem ( 4,2 procenta a 3,2 procenta).

Byly zkoumány tři vzorky L. cubeba, V. officinalis a C. schoenanthus Eos vyrobené v různých letech a také tři vzorky M. officinalis EO od různých výrobců. GC-MS analýzy C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis a V. officinalis neodhalily významné kvalitativní a kvantitativní rozdíly v chemickém složení tří vzorků různých roků výroby. To lze přičíst optimálním skladovacím podmínkám, tj. v nádobě z jantarového skla při 4 ◦C ve tmě se zanedbatelným prostorem nad hlavou. Na druhou stranu analýzy GC-MS ukázaly významné rozdíly v množství citronellalu a trans{4 }}karyofylen ve třech zkoumaných EO M. officinalis. Citronella činila 19,6 procenta, 0,26 procenta a 0,31 procenta u M. officinalis EO 1, 2 a 3, v tomto pořadí. Naopak, jak již bylo popsáno dříve, trans- -karyofylen je podstatně hojnější v M. officinalis EO 2 a 3 než v M. officinalis EO 1. Tyto výsledky jsou v souladu se zjištěními publikovanými Seidler-Lozykawskou et al., kteří zdůraznili významné rozdíly v abundanci citralu, citronellalu a trans- -karyofylenu v EO získaných z 22 vybraných genotypů M. officinalis pocházejících z evropských botanických zahrad [20].

Skutečná kvantifikace byla provedena externí kalibrací standardu, aby se přesně vyhodnotila hojnost potenciálních bioaktivních specializovaných sloučenin (tj. neral, geranial, limonen, -myrcen a citronellal. Tabulky 2 a 3 uvádějí diagnostické ionty (m/z) používané pro SIM- MS kvantifikace zkoumaných markerových sloučenin spolu s kalibračním rozsahem, rovnicí kalibrační křivky, korelačními hodnotami a regresní standardní chybou každého analytu a výsledky kvantifikace, v daném pořadí.

2.2. In vitro inhibiční aktivita zkoumaných esenciálních olejů proti houbové tyrosináze

Jak již bylo popsáno dříve, EO C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba a V. officinalis představují vysoké hladiny citralu, který je charakterizován nekompetitivní inhibiční aktivitou proti houbovému zdroji tyrosinázy [8,16,21]. . Tato studie byla zaměřena na zkoumání the in vitrotyrosinázainhibiční aktivity těchto EO, aby se prozkoumalo, zda lze jejich inhibiční aktivitu připsat pouze jejich obsahu citralu, nebo zda existují jiné bioaktivní sloučeniny, které ovlivňují inhibiční účinky EO.

Houbatyrosinázabyl zde přijat pro svou vysokou homologii s humantyrosinázou, relativně nízkou cenu a snadnou dostupnost, což z něj činí dobrý modelový systém pro předběžný screening inhibitorů tyrosinázy [17]. Přesnost in vitrotyrosinázainhibiční test byl hodnocen z hlediska opakovatelnosti (provedením testu enzymatické inhibice pětkrát ve stejný den) a střední přesnosti (opakováním testu enzymatické inhibice pětkrát každé čtyři týdny po dobu šesti měsíců). Tabulka 4 uvádí variační koeficient (CV) pro inhibiční testy provedené s kyselinou kojovou, která byla použita jako pozitivní kontrola, a s L. cubeba EO. Výsledky byly uspokojivé, protože CV nikdy nepřesáhlo 7 procent pro opakovatelnost a 10 procent pro střední přesnost. Tabulka 4 uvádí variační koeficient pro inhibiční testy provedené s kyselinou kojovou, použitou jako pozitivní kontrola, a s L. cubeba EO. Podobné hodnoty přesnosti byly získány pro všechny testované EO.

Křivka citral koncentrace-odezva byla studována vynesením pozorované inhibiční aktivity jako funkce jeho koncentrace v reakční směsi. Všechny EO byly testovány při koncentraci 166,7 µg/ml, což poskytlo, bez ohledu na EO, výslednou koncentraci citralu v rozsahu linearity křivky koncentrace-odezva (y=0,3956x plus 1,8094,R{{7} },9951, regresní chyba: 2,08448, rozsah linearity: 6,7–166,7 µg/mL) a nezpůsobil problémy s rozpustností v reakční směsi.

Krabicový graf uvedený na obrázku 2 představuje procentotyrosinázainhibice pro každý EO. U EO L. cubeba, V. officinalis a C. schoenanthus odpovídají výsledky uvedené na obrázku 2 inhibiční aktivitě EOs na tyrosinázu hub 2020, protože analýza rozptylu neodhalila žádné statisticky významné rozdíly mezi EO různých roky výroby (p > 0,05). Pokud jde o EO L. cubeba a C. schoenanthus, tyto výsledky jsou v dobré shodě s výsledky získanými z kvantitativních analýz GCMS, které odhalily téměř identické množství citralu v EO různých roků výroby. Šarže 2020 V. officinalis EO obsahuje mírně vyšší množství citralu než šarže 2019 a 2018. Podle křivky koncentrace citralu-odezva však přebytek citralu v šarži 2020 nestačí ke stanovení statisticky významného vyššího procenta enzymatické inhibice s ohledem na náhodné chyba spojená s měřením. Další podrobnosti viz obrázek S1 v doplňkovém materiálu. Na druhé straně analýza rozptylu (ANOVA) následovaná Tukey-Kramer post-hoctestem odhalila, že tři testované EO M. officinalis, poskytované různými výrobci, inhibovaly houbytyrosinázav různém rozsahu, který bude dále popsán v následujících odstavcích. Největší inhibiční aktivity byly pozorovány u EOs L.cubeba, M. officinalis 1 a V. officinalis, které inhibovaly 59 ± 6 procent, 55 ± 7 procent a 52 ± 6 procenttyrosinázapři testování v koncentraci 166,7 ug/ml. Statisticky významné (p < 0,05)="" nižší="" aktivity="" byly="" pozorovány="" u="" eos="" c.="" schoenanthus="" a="" m.="" officinalis="" 2="" a="" 3,="" jejichž="" enzymová="" inhibiční="" aktivita="" byla="" 42="" ±="" 5="" procent,="" 40="" ±="" 5="" procent="" a="" 38="" ±="" 6="" procenta,="" resp.="" tabulka="" 5="" uvádí="" koncentraci="" inhibitoru,="" která="" snížila="" aktivitu="" enzymu="" za="" daných="" experimentálních="" podmínek="" na="" polovinu="" (ic50)="" pro="" každý="" zkoumaný="" inhibitor="" (tj.="" eo,="" jednotlivé="" sloučeniny="" a="" kyselinu="" kojovou).="" všechny="" eo="" účinně="" inhibovaly="" houbovou="" tyrosinázu="" a="" vykazovaly="" inhibiční="" aktivitu,="" která="" byla="" v="" průměru="" 100-krát="" nižší="" než="" aktivita="" kojicacidu,="" která="" byla="" použita="" jako="" pozitivní="">

2.3. Identifikace dalších bioaktivních složek, kromě citralu, frakcionací řízenou biotestem Histogram uvedený na obrázku 3 porovnává procento experimentálně naměřených enzymatických inhibicí s hodnotami, které by se očekávaly, kdyby byly nerální a geraniální (považované za součet, tj. citral) pouze aktivní látky ve zkoumaných EO. Tyto hodnoty byly měřeny interpolací z křivky koncentrace citralu-odezva. Jak lze poznamenat, C. schoenanthus, M. officinalis 2 a M. officinalis 3 vykazovaly inhibiční aktivity, které byly v souladu s jejich obsahem citralu, zatímco EO L. cubeba, M. officinalis 1 a V. officinalis inhibovaly houby tyrosinázy ve větším rozsahu, než se očekávalo. K identifikaci dalších sloučenin, které přispívají k citralové aktivitě, byl přijat bio-řízený přístup. Okysličené a uhlovodíkové frakce EO L. cubeba, M. officinalis 1 a V. officinalis byly izolovány flash chromatografií a individuálně testovány na jejich houbu.tyrosinázainhibiční aktivity. Fytohemické frakce byly testovány na inhibiční aktivitu houbové tyrosinázy. Frakce fytohemických frakcí byly testovány ve stejné koncentraci jako jejich výsledná koncentrace při testování 166,7 µg/ml příslušného EO (viz část Materiály a metody v části 3.2). Tabulka 6 uvádí koncentraci nerálu, geranialu, citronellalu, limonenu, a -myrcen v okysličených a uhlovodíkových frakcích frakcionovaných EO.

Pokud jde o EO L. cubeba a V. officinalis, jak okysličené, tak uhlovodíkové frakce inhibovaly tyrosinázu hub, i když v různé míře. Aktivity okysličených frakcí (53 ± 3 procenta a 44 ± 5, v tomto pořadí) tvoří většinu EOsanti-tyrosinázapotenciál a byly v souladu s příslušným obsahem citralu, což naznačuje, že sloučeniny, které přispívají k aktivitě citralu, patří k uhlovodíkovým frakcím. Uhlovodíkové frakce EO L. cubeba a V. officinalis mají dosti podobné chemické složení. limonen (68,4 a 5{7}},3 procenta), trans- -karyofylen (12{26}} a 7,8 procenta), -pinen (1,7 a 7,5 procenta), -pinen (2,5 a 12,9 procenta, v uvedeném pořadí), sabinen (2,7 a 3,8 procenta) a -myrcen (2,0 a 2,4 procenta, v tomto pořadí) jsou nejhojnějšími sloučeninami v obou frakcích a jsou přítomny ve velmi podobných množstvích, s výjimkou -pinen a -pinen, které převládají v uhlovodíkové frakci EO V. officinalis.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 procent v obou EO), limonen (97 a 94 procent v L. cubeba a V. officinalis EO, v tomto pořadí) a sabinen (87 procent v obou EO), zatímco u -pinenu ((-)- byly pozorovány různé enantiomerní přebytky. enantiomer: 38 procent u L. cubebaEO a 73 procent u V. officinalis EO) a -pinen ((-)-enantiomer: 67 procent u L. cubeba EO a 88 procent u V. officinalis EO). V obou EO tvoří (-)-limonen více než 50 procent celé frakce. Ačkoli předchozí studie uváděly inhibiční aktivitu proti tyrosináze hub kvůli jejímu vysokému výskytu [22,23], (-)-limonen zde nevykazoval inhibiční aktivitu na tyrosinázu. Podobné výsledky byly získány pro (plus)-limonen, racemickou směs a sloučeniny (-)-trans- -karyofylen, (±)- -pinen a (±)- -pinen . Sabinene nebyl testován, protože již bylo prokázáno, že má zanedbatelné množství hubtyrosinázainhibiční účinky [8]. V souladu s předchozími zjištěními [8] myrcen snižoval aktivitu tyrosinázy hub. Při testování při koncentraci pozorované v 166,7 ug/ml EOs L. cubeba a V. officinalis, aktivita myrcenu překlenula mezeru mezi očekávanými inhibičními účinky EO, pokud byl citral jedinou aktivní sloučeninou a experimentálními výsledky. Na rozdíl od pozorování Matsuury et al. [8], -myrcen se ukázal být účinnějším inhibitorem houbové tyrosinázy než citral, protože jeho IC50 bylo téměř desetkrát nižší (13,3 µg/ml vs. 121,8 µg/ml). Tento rozdíl lze přičíst různým použitým substrátům; Matsuura a kol. zkoumali pouze aktivitu houbové tyrosinázy difenolázy, protože jako substrát použili L-DOPA, zatímco v této studii byl použit L-tyrosin. Současná zjištění naznačují, že -myrcen může být účinnější při inhibici aktivity monofenolázy tyrosinázy hub než difenoláza.

M. officinalis EO 1 vykazuje malou uhlovodíkovou frakci, která představuje méně než 3 procenta z celkového počtu, a nemá žádnou inhibiční aktivitu vůči tyrosináze. Okysličená frakce M. officinalisEO 1 však inhibovala houbovou tyrosinázu ve větší míře, než by se dalo očekávat z jejího obsahu citralu (obrázek 3). Tato frakce obsahuje kromě nerálu a geranialu významná množství citronellalu a chirální analýza odhalila vysokou enantiomerní čistotu citronellalu ve prospěch (plus) enantiomeru (98,3 procent). Když byl testován nezávisle, v koncentraci 166,7 µg/ml, (plus)-citronellal inhiboval houbovou tyrosinázu v zanedbatelné míře, ačkoli jeho aktivita byla významně zvýšena při testování v kombinaci s citralem. Tyto výsledky mohou vysvětlit rozdíly pozorované v procentech hubtyrosinázainhibice u různých EO M. officinalis. M. officinalis EO 2 a 3 mají velmi nízký obsah citronelalu, což může být důvodem, proč jsou jejich inhibiční aktivity výrazně nižší než u M. officinalis EO 1.

3. Materiály a metody

3.1. Reagencie

Dimethylsulfoxid (DMSO), houbová tyrosináza z Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-tyrosin, kyselina kojová, citral, citronellal, -myrcen, (plus)-limonen, (-)-limonen,(±)-limonen, ( ±)- a pinen byly zakoupeny od Merck Life Science Srl (Milán, Itálie). Litsea cubeba, Verbena officinalis a Cymbopogon schoenanthus EO dodala Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Itálie). U každé byly testovány tři šarže různých let (tj. 2020, 2019, 2018). Byly zkoumány tři vzorky EO Melissa officinalis; jeden poskytla Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), jeden ErboristeriaMagentina Srl, zatímco poslední byl zakoupen v místním obchodě a byl od SpecchiasolS.rl (Busolengo, Itálie). V textu autoři označují různé EO Melissaofficinalis jako M. officinalis EO 1, 2 a 3, v tomto pořadí. Poskytnuté EO byly získány podle postupů popsaných v Evropském lékopisu [24]. Melissa officinalis a Verbena officinalis EO byly vyrobeny hydrodestilací z listů a rostlinných vzdušných částí, v tomto pořadí; podobně, Litsea cubeba a Cymbopogon schoenanthus EOs byly získány parní destilací čerstvého ovoce a čerstvých nadzemních částí. Každý EO byl individuálně analyzován pomocí GC-MS, jakmile byl zakoupen/poskytnut odpovídajícím výrobcem, každý rok skladování a těsně před studií jeho inhibiční aktivity houbové tyrosinázy.

3.2. In vitro test inhibice tyrosinázy

Thetyrosinázainhibiční aktivity EO a izolovaných sloučenin byly zkoumány in vitro pomocí kolorimetrického enzymového testu založeného na čtení optimalizovaného Zenghem et al. [25], s drobnými úpravami. Tyrosinázové inhibiční aktivity EO, stejně jako jejich příslušné uhlovodíkové a okysličené frakce a čisté sloučeniny byly zkoumány in vitro pomocí kolorimetrického enzymového testu založeného na čtení, který optimalizoval Zengh et al. [25], s mírnými úpravami: test byl proveden při pokojové teplotě atyrosinázainhibice byla měřena s ohledem na kontrolu a absorbanci vzorku po 6 minutách inkubace, spíše než po 20 minutách, aby probíhala pod lineární částí enzymatické reakce, což poskytuje přesnější výsledky inhibice [26,27]. Pro tuto studii byla vybrána houbová tyrosináza z Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach. Jako substrát byl použit L-tyrosin, což znamená, že celková inhibiční aktivita tyrosinázy byla zkoumána bez rozlišení mezi aktivitou tyrosinázy monofenolázy a difenolázy. Fotometrická měření při 475 nm byla prováděna na Thermo specttronic Genesys6 a jako inhibitor pozitivní kontroly byla použita kyselina kojová. Roztoky zkoumaných potenciálních inhibitorů (EO, izolované frakce EO, jednotlivé sloučeniny EO a kyselina kojová) byly připraveny v DMSO. Tabulka 7 uvádí testované koncentrace pro každý zkoumaný potenciální inhibitor. Houbatyrosinázaroztok 200 U/ml (27,9 µg/ml) byl připraven v pufru fosforečnanu sodného (pH 6,8) a alikvoty po 9 ml byly skladovány při -18 ◦C a rozmrazeny těsně před experimenty. Roztok tyrosinu 0,1 mg/ml byl připraven v pufru fosforečnanu sodného (pH 6,8) a denně obnovován. Složky reakční směsi byly umístěny do lahvičky v následujícím pořadí: 1 ml roztoku houbové tyrosinázy 200 U/ml; 1 ml tlumivého roztoku fosforečnanu sodného; 10 ul roztoku EO/jediná sloučenina/kyselina kojová; a nakonec 1 ml roztoku tyrosinu 0,1 mg/ml. Konečné procento DMSO v reakční směsi bylo 0,3 procenta. Test byl proveden v utěsněné 4ml lahvičce, aby se zabránilo ztrátě jakýchkoli složek EO do okolního prostředí a aby se minimalizovalo jejich uvolňování do prostoru nad reakční směsí. Reakční směs byla inkubována v termostatické vodní lázni při 25 °C po dobu 6 minut. Následně byla registrována absorbance při 475 nm, protože tato vlnová délka umožňuje identifikaci dopachromu. Absorbance odpovídající 100 procentům tyrosinázové aktivity byla měřena nahrazením roztoku EO/jednotlivá sloučenina/kyselina kojová 10 ul čistého DMSO. Prázdné roztoky byly připraveny následovně: 2 ml pufrovacího roztoku fosforečnanu sodného, ​​10 ul EO/jednotlivá sloučenina roztok kyseliny kojové/DMSO a 1 ml tyrosinového roztoku 0,1 mg/ml. Procento inhibice tyrosinázy bylo měřeno podle rovnice níže: procento inhibice=∆A (kontrola) − ∆A (vzorek) / ∆A (kontrola) × 100, ∆A (kontrola) nebo (vzorek) {{ 33}} A475 (kontrola) nebo (vzorek) − A475 (kontrola slepá) nebo (vzorek slepá).

3.3. Flash sloupcová chromatografie

Frakcionace EO byla provedena na systému flash kolonové chromatografie PuriFlash450 společnosti Sepachrom (Rho, Milán, Itálie), vybaveném jak UV, tak ELSD detektory. Množství frakcionovaného EO: 900,0 mg. Stacionární fáze: sférické částice silikagelu, 50 um, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) byly od Sepachromu; mobilní fáze: petrolether (A) a ethylacetát (B); průtok 25 ml/min. Lineární gradientová eluce byla přijata od 100 procent A do 80 procent A a 20 procent B během 20 minut.

3.4. Podmínky analýzy

Roztoky EOs a jejich příslušných frakcí byly připraveny v cyklohexanátu o koncentraci 50 mg/ml a analyzovány pomocí GC-MS. Citral, citronellal, -myrcen a limonen byly kvantifikovány v každém EO a odpovídajících izolovaných frakcích pomocí externí standardní kalibrační metody. Vhodné kalibrační hladiny byly připraveny v cyklohexanu a analyzovány pomocí GC-MS. Tridekan (C13) 1.0 mg/ml byl použit jako vnitřní standard k normalizaci signálů analytu. Tabulka 2 shrnuje uvažovaný koncentrační rozsah pro každou kvantifikovanou sloučeninu.

Analýzy GC-MS byly provedeny pomocí víceúčelového vzorkovače Gerstel MPS-2 (Mülheim an der Ruhr, Německo) nainstalovaného na Agilent 6890 N GC připojeném k 5975 MSD a vybavenému ChemStation verze E. 02.0Systém zpracování dat 2.1431 (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, USA). Podmínky GC: teplota vstřikovače: 250 ◦C; režim vstřikování: dělený; poměr: 1/20; nosný plyn: helium; konstantní průtok: 1 ml/min; kolony: Mega5 (95 procent polydimethylsiloxan, 5 procent fenyl) df 0,25 um, dc 0,25 mm, délka 25 m, od MEGA (Legnano, Itálie). Teplotní program: 50 ◦C//3 ◦C/min//180 ◦C//10 ◦C/min//250 ◦C (5 min). Podmínky MSD: MS provozovaný v režimu EI (70 eV); rozsah skenování: 35 až 350 amu; doba prodlevy 40 ms; teplota iontového zdroje: 230 ◦C; kvadrupólová teplota: 150 ◦C; teplota přenosové linky: 280 ◦C. EO markery byly identifikovány porovnáním obou jejich lineárních retenčních indexů (ITs), vypočtených oproti směsi uhlovodíků C9-}C25, a jejich hmotnostních spekter buď s těmi autentickými vzorky, nebo z komerčně dostupných knihoven hmotnostního spektra (Adams, 2007). EO chirální analýzy byly provedeny za použití stejných podmínek analýzy na 2,3-di-O-methyl-6-ot-butyldimethylsilyl- -CD (2,3DM6TBDMS-CD) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, délka 25 m od MEGA. Teplotní programy: 40 ◦C(1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

GC-FID analýzy byly provedeny na stejném přístroji. Podmínky GC: teplota vstřikovače: 250 ◦C; režim vstřikování: dělený; poměr: 1/20; nosný plyn: vodík; průtok: 1 ml/min. Teplotní programy: 40 ◦C (1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

4. závěr

Účelem tohoto výzkumu bylo (1) prozkoumat komplexně houbu in vitrotyrosinázainhibiční aktivity Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis a Verbena officinalis EO a (2) určit, zda je jejich biologická aktivita připisována pouze jejich obsahu citralu, nebo zda existují další bioaktivní monoterpeny, které přispívají ke zkoumané biologické aktivitě pomocí bioassay-guided frakcionační přístup. Tato studie zjistila, že v EOs L. cubeba a V. officinalis přispívá -myrcen k inhibičním aktivitám EOs navzdory jeho malému množství a bylo prokázáno, že má větší inhibiční sílu na citral. Druhým hlavním zjištěním bylo, že (plus)-citronellal posílil citralovou houbutyrosinázainhibiční síla, potenciálně viasynergická interakce, protože sama o sobě nevykazovala žádnou aktivitu. Posledně uvedené zjištění vysvětlilo, proč u EO M. officinalis, které nesou zanedbatelná množství (plus)-citronellalu, byly inhibiční aktivity v souladu s jejich obsahem citralu, zatímco opak byl pravdou pro EO M. officinalis s relativně vysokým zastoupením (plus)-citronellalu. i když jsou stále zapotřebí další studie, aby bylo možné přesně definovat typ interakcí, které se vyskytují mezi -myrcenem a citralem a mezi citronellalem a citralem, a posoudit inhibiční aktivity těchto EO a jednotlivých sloučenin na člověka.tyrosinázaVýsledky této studie mohou pomoci racionálně navrhnout směsi EO nebo obohacené EO, které zlepšují jejich biologickou účinnost a zvyšují jejich potenciál jako adjuvans při léčbě hyperpigmentace.

Reference

1. Pillaiyar, T.; Maničkam, M.; Namasivayam, V. Činidla pro bělení kůže: perspektiva inhibitorů tyrosinázy z lékařské chemie.J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2017, 32, 403–425. [CrossRef]

2. Desmedt, B.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogers, V.; Grosber, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. Přehled činidel pro bělení pokožky s náhledem na nelegální kosmetický trh v Evropě. J. Eur. Akad. Dermatol. Venereol. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]

3. Desmedt, B.; Van Hoeck, E.; Rogers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO; De Paepe, K.; Deconinck, E. Charakterizace podezřelé nelegální kosmetiky na bělení kůže. J. Pharm. Biomed. Anální. 2014, 90, 85–91. [CrossRef] [PubMed]

4. Kubo, I.; Ikuyo, KH Flavonoly z květu šafránu: Inhibiční aktivita a mechanismus inhibice tyrosinázy. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4121–4125. [CrossRef]

5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; Shih, Y.; Chou, S.-TT Chemické složení a inhibiční aktivita tyrosinázy esenciálního oleje Cinnamomum cassia. Bot. Stud. 2013, 54, 2–8. [CrossRef]

6. Garcia-Molina, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; Garcia-Molina, F.; García-Ruiz, PA; Garcia-Canovas, F. Působení tyrosinázových onortho-substituovaných fenolů: Možný vliv na hnědnutí a melanogenezi. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 6447–6453. [CrossRef]

7. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Inhibitory tyrosinázy z kmínu. J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 5338-5341. [CrossRef]

8. Matsuura, R.; Ukeda, H.; Sawamura, M. Tyrosinázová inhibiční aktivita citrusových silic. J. Agric. Food Chem. 2006,54, 2309–2313. [CrossRef]

9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. In vitro bioaktivity esenciálních olejů používaných pro kontrolu akné. Int. J. Aromather. 2006, 16, 43–49. [CrossRef]

10. Bouzenna, H.; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Elfeki, A.; Talarmin, H. Biologické vlastnosti citralu a jeho potenciální ochranné účinky proti cytotoxicitě způsobené aspirinem v buňkách IEC-6. Biomed. Pharmacother. 2017, 87, 653–660. [CrossRef]

11. Lee, HJ; Jeong, HS; Kim, DJ; No, YH; Yuk, DY; Hong, JT Inhibiční účinek citralu na produkci NO potlačením exprese iNOS a aktivace NF-KB v buňkách RAW264.7. Oblouk. Pharm. Res. 2008, 31, 342–349. [CrossRef]

12. Carvalho, PMM; Macêdo, CAF; Ribeiro, TF; Silva, AA; Da Silva, RER; de Morais, LP; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Barbosa, R. Účinek esenciálního oleje Lippia alba (Mill.) NE Hnědý esenciální olej a jeho hlavní složky, citral a limonen, na tracheální hladký sval krys. Biotechnol. rep. 2018, 17, 31–34. [CrossRef] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L.; Silva, AdA; da Silva, RER; Costa, RHSd; Monteiro, Á.B.; Barbosa, CRdS; Amorim, TdS; deMenezes, IRA; Kerntopf, MR; Barbosa, R. Tokolytická aktivita esenciálního oleje Lippia alba a jeho hlavních složek, citralu a limonenu, na izolované děloze krys. Chem. Biol. Komunikujte. 2019, 297, 155–159. [CrossRef]

14. Da Silva, RER; de Morais, LP; Silva, AA; Bastos, CMS; Pereira-Gonçalves, Á.; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. Vasorelaxační účinek esenciálního oleje Lippia alba a jeho hlavní složky, citralu, na kontraktilitu izolované aorty potkana. Biomed. Pharmacother. 2018, 108, 792–798. [CrossRef] [PubMed]

15. Sousa, DG; Sousa, SDG; Silva, RER; Silva-Alves, KS; Ferreira-da-Silva, FW; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. Esenciální olej z Lippia alba a jeho hlavní složka citral blokují excitabilitu sedacích nervů potkana. Braz. J. Med. Biol. Res. 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]

16. Huang, X.-W.; Feng, Y.-C.; Huang, Y.; Li, H.-L. Potenciální kosmetická aplikace esenciálního oleje extrahovaného z plodů Litsea cubeba z Číny. J. Essent. Oil Res. 2013, 25, 112–119. [CrossRef]

17. Zolghadri, S.; Bahrami, A.; Hassan Khan, MT; Munoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Canovas, F.; Saboury, AA Komplexní přehled o inhibitorech tyrosinázy. J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2019, 34, 279–309. [CrossRef]

18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Matteodo, M.; Sgorbini, B.; Mondello, L.; Zellner, Bd; Costa, R.; Rubiolo, P. Kvantitativní analýza esenciálních olejů: Komplexní úkol. Příchuť Fragr. J. 2008, 23, 382–391. [CrossRef]

19. Rubiolo, P.; Sgorbini, B.; Liberto, E.; Cordero, C.; Bicchi, C. Esenciální oleje a těkavé látky: Příprava a analýza vzorků. A review.Flavour Fragr. J. 2010, 25, 282–290. [CrossRef]

20. Seidler-Łozykowska, K.; Bocianowski, J.; Król, D. Hodnocení variability morfologických a chemických znaků vybraných genotypů meduňky lékařské (Melissa officinalis L.). Ind. Crops Prod. 2013, 49, 515–520. [CrossRef]

21. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Tyrosinázová inhibiční aktivita aromatických sloučenin olivového oleje. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4574–4578.[CrossRef] [PubMed]

22. Fiocco, D.; Arciuli, M.; Arena, MP; Benvenuti, S.; Gallone, A. Chemické složení a antimelanogenní potenciál různých esenciálních olejů. Příchuť Fragr. J. 2016, 31, 255–261. [CrossRef]

23. Hu, JJ; Li, X.; Liu, XH; Zhang, WP Inhibiční účinek citronového esenciálního oleje na aktivitu houbové tyrosinázy in vitro. Mod. FoodSci. Technol. 2015, 31, 97–105. [CrossRef]

24. Rada Evropy. European Pharmacopoeia, 10. vydání; Rada Evropy: Štrasburk, Francie, 2020; ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Zheng, ZP; Tan, HY; Chen, J.; Wang, M. Charakterizace inhibitorů tyrosinázy ve větvičkách Cudrania tricuspidata a studium vztahu mezi strukturou a aktivitou. Fitoterapie 2013, 84, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

26. Williams, KP; Scott, JE návrh enzymového testu pro vysoce výkonný screening. Ve vysoce výkonném screeningu. Metody v molekulární biologii (metody a protokoly); Janzen, WP, Paul, B., Eds.; Humana Press: Clifton, NJ, USA, 2009; Svazek 565, s. 107–126.

27. Brooks, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD; Montrose, C.; Sittampalam, S.; Smith, MC; Weidner, JR Základy enzymatických testů pro HTS. In Assay Guidance Manual; Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., Eds.; Eli Lilly & Company a NationalCenter for Advancing Translational Sciences: Bethesda, MD, USA, 2004