Cistanosid A zprostředkovává cestu P38/MAPK k inhibici aktivity osteoklastů

Abstraktní

POZADÍ:Cistanosid Amáprotizánětlivé účinky, antioxidace,snížení poškození ledvin a anti-osteoporóza, ale jeho vliv nadiferenciace osteoklastůFunkce a základní molekulární mechanismy zůstávají nejasné. CÍL: Prozkoumat účinekCistanosid Anaosteoklastůdiferenciace akostní resorpceindukovaný receptorovým aktivátorem ligandu jaderného faktoru kappa-B (RANKL) in vitro a jeho mechanismus.

METODY: Makrofágy kostní dřeně byly získány z femuru a holenní kosti 4-6-týdenních myší C57BL/6. Cytotoxický účinek Cistanosidu A (5, 10, 20, 40, 80 a 160 μmol/l) na životaschopnost makrofágů kostní dřeně byl zkoumán pomocí testovací soupravy pro počítání buněk{10}}. Bylo provedeno barvení kyselou fosfatázou rezistentní na tartrát, aby se pozoroval účinek různých koncentracíCistanosid Ana diferenciaci osteoblastů a byla stanovena jeho účinná intervenční koncentrace. Byla zde pozitivní kontrolní skupina, skupiny s nízkou, střední a vysokou dávkou Cistanosidu A (40, 80 a 160 μmol/l). Po připojení buněk bylo přidáno 50 ng/ml RANKL pro indukci diferenciace osteoblastů a odpovídající dávka cistanosidu A byla přidána do skupin s nízkou, střední a vysokou dávkou cistanosidu A, v daném pořadí. Za účelem zjištěníúčinky Cistanosidu Anatvorba osteoklastů. Barvení řezů kostní abraze toluidinovou modří bylo použito k pozorování účinků Cistanosidu A na funkci kostní resorpce osteoklastů. Exprese upstream a downstream proteinů dráhy JNK/MAPK byla detekována Western blotem. Exprese genů souvisejících s diferenciací osteoklastů a funkcí kostní resorpce, jako je tartrát-rezistentní kyselá fosfatáza, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk a c-Fos, byla detekována pomocí RTqPCR. VÝSLEDKY A ZÁVĚRY: Barvení kyselou fosfatázou rezistentní na tartrát, barvení F-aktinovým prstencem a test resorpční jamky ukázaly, že Cistanosid A významněinhibovaly RANKL-indukovanou diferenciaci osteoklastůakostní resorpcezpůsobem závislým na dávce ve srovnání s pozitivní kontrolní skupinou. Výsledky RT-qPCR ukázaly, že ve srovnání s pozitivní kontrolní skupinou mohly skupiny s vysokou i nízkou dávkou Cistanosidu A významně snížit expresi mRNA kyselé fosfatázy rezistentní na tartrát, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk a c-Fos v závislosti na dávce. Výsledky testu western blot ukázaly, že skupina s vysokou dávkou Cistanosidu A významně inhibovala expresi proteinu p-JNK v 10, 20, 30 a 60 minutách zásahu; ve srovnání s pozitivní kontrolní skupinou Cistanosid A významně inhiboval expresi proteinů Nfatcl a c-Fos v závislosti na dávce. Závěrem lze říci, že Cistanosid A by mohl inhibovat tvorbu a kostní resorpci osteoklastů snížením hladiny proteinu p-JNK, inhibicí aktivace dráhy MAPK a exprese klíčových genů v osteoklastech.

klíčová slova: Cistanosid A; osteoklastů; MAPK; JNK; RANKL; HODNOST;osteoporóza; fenylethanoidové glykosidy

CISTANCHE PRACOVAT A ZABRAŇOVAT AKTIVITY OSTEOCLASTŮ

0 Úvod Úvod

Epidemiologické studie prokázaly, že s růstem a stárnutím celosvětové populace se bude výskyt osteolytických onemocnění, jako je osteoporóza a osteoartróza, dále zvyšovat [1]. Současné výzkumy ukazují, že v patogenezi osteolytických onemocnění povede nerovnováha kostní resorpce a kostní rekonstrukce způsobená nadměrnou aktivací funkce osteoklastů k výraznému snížení objemu kosti, kostní denzity a kostní mikrostruktury. Škodlivé poškození, vede ke zvýšené lámavosti kostí a zvýšenému riziku zlomenin [2-3]. Proto jsou osteoklasty hlavním buněčným cílem pro identifikaci a vývoj účinných látek pro léčbu osteoporózy. V současnosti běžně používané léky, které inhibují osteoklasty, jako je denosumab (protilátka proti RANKL), bisfosfonáty atd., však mají nežádoucí účinky, jako je nefrotoxicita, osteonekróza, riziko rakoviny endometria a osteonekróza čelisti [4-5]. Proto má velký klinický význam nalézt nová léčiva, která mohou inhibovat aktivitu osteoklastů.

Funkce diferenciace a kostní resorpce osteoklastů je regulována především dvěma signálními molekulami, faktorem stimulujícím kolonie makrofágů a receptorovým aktivátorem ligandu nukleárního faktoru κB (RANKL) [6]. Receptor faktoru 1 stimulující kolonie (c-fms) na membráně prekurzorových buněk osteoklastů se váže na faktor stimulující kolonie makrofágů a podporuje expresi aktivátoru receptoru jaderného faktoru kappa B (RANK). Vazba RANKL a RANK na buněčný povrch aktivuje transkripční faktory, jako je jaderný faktor κB, JNK, p38 a JNK, který následně aktivuje transkripční faktor c-Fos, jaderný faktor aktivovaných T buněk c1 (Nfatc1) atd. nucleus, aktivující destrukci kostních prekurzorových buněk tvoří mnohojaderné buňky a nakonec se diferencují na osteoklasty [7-9].

Cistanche deserticolaje jedním z nejčastěji používaných čínských léčivých materiálů v klinické praxi. Je to usušená dužnatá nať se šupinatými listy Cistanche deserticola nebo Cistanche tuberosum rostliny Orobanchiaceae [10]. Tradiční medicína věří, že Cistanche deserticola je teplé povahy, sladké a slané chuti a vrací se do meridiánů ledvin a tlustého střeva. Má účinky vyživování jangu ledvin, doplnění esence a krve, zvlhčení střev a projímadlo a používá se k léčbě impotence, neplodnosti, svalů a kostí způsobené nedostatkem jangu ledvin a esence a nedostatkem krve. Nemoci, jako je slabost, jsou v souladu s metodami tonizující léčby jater a ledvin používanými v tradiční medicíně k léčbě osteolytických onemocnění. Farmakologické studie prokázaly, že hlavní účinnou látkou Cistanche deserticola jsou fenylethanoidové glykosidy, které mají dobrou bezpečnost a rozsáhlé léčebné funkce [11]. Cistanosid A (Molekulární vzorec: C36H48O20) je přírodní fenylethanolová glykosidová sloučenina izolovaná a čištěná z tradiční čínské medicíny Cistanche deserticola. Má protizánětlivé, antioxidační a protinádorové účinky [12-14]. Studie ukázaly, že Cistanche deserticola A může snížit hladiny c-Fos v primárních buňkách myší s akutním poškozením jater vyvolaným etanolem [15]. Jiné studie ukázaly, že Cistanche A může zlepšit strukturální parametry trabekulární kosti u ovariektomizovaných osteoporotických myší prostřednictvím dráhy faktoru 6 spojeného s RANKL/TNF receptorem (TRAF6) [16]. Chybí však další výzkum účinku cistanchesidu A na diferenciaci osteoklastů a potenciální molekulární mechanismy. Tato studie si klade za cíl prozkoumat účinek cistanchesidu A na diferenciaci osteoklastů a funkci kostní resorpce in vitro a potenciální molekulární mechanismy s cílem nalézt nová potenciální léčiva pro inhibici osteoklastické diferenciace.

1 Materiály a metody Materiály a metody

1.1 Design

Pro in vitro buněčné experimenty byly provedeny t-test a jednocestná ANOVA.

1.2 Čas a místo

Dokončeno od prosince 2022 do prosince 2023 v laboratoři na opravu poranění kostí a měkkých tkání druhé nemocnice lékařské univerzity Shanxi.

1.3 Materiály

1.3.1 Pokusná zvířata

SPF 4-týdenní myši C57BL/6, samci nebo samice, byly zakoupeny od Experimental Animal Center of Shanxi Medical University, výrobní licenční číslo: SCXK (Jin) 2019-0004. Experimentální myši byly drženy ve standardním prostředí: pokojová teplota 26 stupňů, vlhkost asi 55 %, vystavení světlu po dobu 12 hodin denně, volný pohyb a nezávislé jídlo. Experimentální protokol byl schválen Experimentálním výborem pro dobré životní podmínky zvířat a etickou komisí druhé nemocnice Shanxi Medical University (č. schválení: DW2023031).

1.3.2 Činidla a léky

Cistanchesid A (čistota 98 ​​%, CAS 93236-42-1) byl zakoupen od Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; fetální bovinní sérum a kultivační médium MEM s vysokým obsahem glukózy byly zakoupeny od HyClone Company ze Spojených států; štěpící roztok trypsin-EDTA 0,25 %, roztok pro lýzu červených krvinek, 1×PBS, směs penicilin-streptomycin (×100), barvicí roztok toluidinové modři (1/100, borátová metoda), faloidin značený rhodaminem prsten

Peptid (kat. č. CA1610) a barvivo DAPI (připravené k použití) byly zakoupeny od společnosti Beijing Solebao Technology Co., Ltd. Beijing Ze Xiyuan Biotechnology Co., Ltd.; Sada CCK-8 byla zakoupena od společnosti MCE Company ze Spojených států, souprava pro barvení kyselé fosfatázy rezistentní na tartarte (TRAP) byla zakoupena od společnosti Sigma-Aldrich Company ze Spojených států, RNAiso Plus, reverzní transkripční činidla typu Premix, TB Green® Rychlý mix qPCR,

Prime Script TM RT Master Mix a Trizol byly zakoupeny od společnosti Takara Company ve Spojených státech; Transmembránový protein specifický pro dendritické buňky (DC-STAMP), TRAP, CTSK, c-Fos, NFATc-1 specifické PCR primery byly zakoupeny od Sangon Bioengineering (Shanghai) Co., Ltd.; -aktinová protilátka, c-Fos protilátka, Nfatcl protilátka, JNK protilátka a p-JNK protilátka, m-IgG Fc BP-HRP byly zakoupeny od Santa Cruz, USA.

Biotechnologická korporace.

1.4.6 Experiment kostní resorpce k testování kostní resorpční kapacity osteoklastů

Makrofágy kostní dřeně byly naočkovány do 96-jamkové destičky se sterilizovanými plátky hovězí kosti předem umístěnými v hustotě 7 x 103/jamku. Do každé jamky bylo přidáno 100 ul kultivačního média a rozděleno do pozitivní kontrolní skupiny a Cistanche A s nízkou dávkou. skupina (40 μmol/l) a skupina s vysokou dávkou cistanchesidu A (160 μmol/l), každá skupina byla vybavena 5 vícenásobnými otvory, z nichž 3 vícenásobné otvory byly umístěny plátky hovězí kosti a další 2 vícenásobné otvory byly použity pozorovat expresi makrofágů kostní dřeně. Tvorba adheziv a osteoklastů. Poté, co buňky přilnuly, pozitivní kontrolní skupina a cysty

Ke všem skupinám byl přidán RANKL v 50 ng/ml, aby se indukovala diferenciace osteoklastů. Skupinám s nízkou a vysokou dávkou cistanchesidu A bylo přidáno 40 μmol/l nebo 160 μmol/l cistanchesidu A pro intervenci a médium bylo měněno každých 48 hodin. Po kultivaci po dobu 14 dnů vyjměte plátky hovězí kosti, promyjte kostní plátky dvakrát PBS, přidejte 70% isopropylalkohol a vysoce výkonné ultrazvukové čištění po dobu 15 minut, aby se smyly zbývající buňky, přidejte toluidinovou modř (1 %, rozpuštěná ve vodě) roztoku barviva a barvit při pokojové teplotě po dobu 2 sekund. Po 1 minutě opláchněte kostní fragmenty dvakrát destilovanou vodou, abyste odstranili zbytkové barvivo. Obarvené kostní řezy byly pozorovány a fotografovány pomocí stereomikroskopu a pomocí softwaru Image J byla spočítána plocha mezer kostní resorpce.

1.4.7 RT-PCR

K detekci funkce intracelulární kostní resorpce a exprese genů souvisejících s osteoklasty byly makrofágy kostní dřeně vysety do 6-jamkové destičky v množství 1,5×105/jamku a do každé jamky bylo přidáno 100 μl kultivačního média a rozdělena na pozitivní kontrolní skupinu, skupinu s nízkou dávkou Cistanche A (40 μmol/L) a skupinu s vysokou dávkou Cistanchesidu A (160 μmol/L). Jak pozitivní kontrolní skupině, tak skupině Cistancheside A byly přidány 50 ng/ml RANKL induktoru.

K indukci diferenciace osteoklastů bylo přidáno 40 μmol/l nebo 160 μmol/l cistanchesidu A ke skupině s nízkou a vysokou dávkou cistanchesidu A pro intervenci. Médium bylo měněno každých 48 hodin. Pozorování bylo prováděno pod inverzním mikroskopem tři nebo čtyři dny po indukci. Pod mikroskopem bylo pozorováno, že makrofágy kostní dřeně právě srostly. Přidejte TRIzol k lýze buněk, přidejte chloroform, umístěte na led na 10 minut a aspirujte směs

V 1,5 ml EP zkumavkách přidejte 200 μl chloroformu do každé zkumavky, třepejte 15 s, poté nechte 15 minut stát na ledu, centrifugujte při 4 stupních, 12 000 r/min po dobu 10 minut, odeberte supernatant, přidejte stejné množství isopropylalkoholu a umístěte na led. Nechte stát 10 minut, odstraňte supernatant, odstřeďte při 4 stupních při 120,000 ot./min, promyjte 75% roztokem ethanolu s objemovou frakcí sterilní vody bez enzymů a vysušte na vzduchu, abyste získali celková RNA. Pomocí sady pro reverzní transkripci Prime ScriptTMRT Master mix nakonfigurujte 20 μl systém pro reverzní transkripci za účelem syntézy cDNA. Poté nakonfigurujte pracovní systém PCR podle pokynů k soupravě a proveďte detekci ve fluorescenčním kvantitativním PCR přístroji. Podmínky PCR reakce byly: předdenaturace při 95 stupních po dobu 5 minut; denaturace při 95 stupních po dobu 10 s, žíhání a extenze při 60 stupních po 30 s, celkem 40 cyklů. Sekvence primeru je uvedena v tabulce 1.

Po přidání jednoduchého média -MEN a hladovění po dobu 3 hodin byla také přidána skupina cistanchesidu A s 160 μmol/l cistanchesidu A pro intervenci. Po ukončení hladovění bylo každé skupině přidáno 100 ng/ml RANKL pro stimulaci. Stimulační časy byly 0, 10, 20, 30 a 60 min. Po skončení doby stimulace bylo kultivační médium odstraněno a třikrát promyto předem vychlazeným 1 x PBS. Extrahované proteiny byly použity k detekci exprese p-JNK, JNK a -aktinových proteinů.

Po dokončení extrakce proteinu použijte gelovou elektroforézu k oddělení proteinu a jeho přenesení na PVDF membránu. Přidejte 5% bovinní sérový albumin (BSA) pro blokování při 4 stupních po dobu 1 hodiny. Odstraňte blokovací roztok, promyjte membránu 3krát pufrem TBST a přidejte primární protilátku. (protilátka Nfatc1 1: 1000, protilátka c-Fos 1: 1000, protilátka p-JNK 1: 1000, protilátka JNK 1: 1000, protilátka -aktin 1: 1000), inkubujte při 4 stupních po dobu 14-16 h, promyjte membránu 3krát TBST pufrem, přidejte sekundární protilátku (m-IgG Fc BP-HRP, poměr ředění 1:5000), inkubujte při pokojové teplotě po dobu 2 hodin, po promytí přidejte fluorescenční roztok a vyvíjejte pod gelovým zobrazovacím systémem. Laboratoř Software analyzuje šedou hodnotu získaných pásů a používá -aktin jako vnitřní referenci pro výpočet relativní exprese cílového proteinu.

1.5 Hlavní ukazatele pozorování

① Výsledky diferenciace osteoklastů indukované RANKL po intervenci Cistanchesidem A; ② Tvorba aktinových prstenců na povrchu osteoklastů a změny ve funkci kostní resorpce osteoklastů po intervenci Cistanchesidem A; ③ Klíč k osteoklastům po intervenci cistanchesidem A Genová exprese; ④ Exprese downstream proteinů dráhy JNK/mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) a proteinu p-JNK po intervenci Cistanchesidem A.

1.6 Statistická analýza

Pro statistickou analýzu a kreslení byl použit software GraphPad Prism 9. Všechna data byla vyjádřena jako x-±s. Pro srovnání mezi skupinami byly vybrány t test a jednocestná analýza rozptylu. P < 0.05 bylo definováno jako významný rozdíl. Statistické metody tohoto článku byly vyvinuty statistickým oddělením Shanxi Medical University.

Domácí recenze.