Extrakt cistanche deserticola zvyšuje tvorbu kostí v osteoblastech - Část I

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te-Mao Li^aet a

Abstraktní
Cíle Zkoumali jsme účinekCistanchedeserticolaMiliampér. (CD) dnekostformacekultivovanými osteoblasty. Metody Mineralizovaný test tvorby uzlů byl použit ke zkoumání in vitro účinků CD(Cistanchedeserticola)nakostformace. Alkalická fosfatáza (ALP), kostní morfogenetické proteiny (BMP)-2 a exprese mRNA osteopontinu (OPN) byly analyzovány kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase. Mechanismus účinku CD(Cistanchedeserticola)extrakt byl zkoumán pomocí Western blotting. In-vivo anti osteoporotický účinek CD(Cistanchedeserticola)extrakt byl hodnocen u ovariektomizovaných myší.
Klíčová zjištění

CÉDÉČKO(Cistanchedeserticola)extrakt neměl žádný vliv na proliferaci, migraci nebo hojení ran kultivovaných osteoblastů, ale zvýšil ALP, BMP-2 a OPN mRNA a mineralizaci kostí. Mitogenem aktivovaná proteinkináza (MAPK) nebo inhibitory jaderného faktoru (NF)-kB redukované CD(Cistanchedeserticola)extrakt indukovanýtvorba kostía výraz ALP, BMP-2 a OPN. Nicméně, CD(Cistanchedeserticola)extrakt neovlivnil osteoklastogenezi. Kromě toho, CD(Cistanchedeserticola)extrakt zabránil úbytku kostní hmoty vyvolané ovariektomií in vivo.
Závěry

CÉDÉČKO(Cistanchedeserticola)může být romántvorba kostíčinidlo pro léčbu osteoporózy.

Klíčová slovatvorba kostí;Cistanchedeserticola; Čínská bylina; osteoblasty

Cistanche deserticolaje dobré protvorba kostí

Úvod

Kost je složitá tkáň složená z několika typů buněk, které procházejí nepřetržitým procesem obnovy a opravy nazývaným "remodelace kostí". Dva hlavní typy buněk zodpovědné za remodelaci kostí jsou osteoklasty, které resorbují kost, a osteoblasty, které tvoří novou kost. Remodelace kostí je regulována několika systémovými hormony (např. parathormon, 1, 25-dihydroxy vitamin D3, pohlavní hormony a kalcitonin) a lokálními faktory (např. oxidem dusnatým, prostaglandiny, růstovými faktory a cytokiny). [1] Osteoporóza má za následek, když resorpce a tvorba kosti jsou nekoordinované a nadměrné rozpady kostí převyšují stavbu kostí. [2] Současná léčba osteoporózy zahrnuje bisfosfonáty, kalcitonin a estrogen, což jsou inhibitory kostní resorpce, které udržují kostní hmotu inhibicí aktivity osteoklastů. [3] Účinek těchto léků na zvýšení nebo obnovu kostní hmoty je však relativně malý, rozhodně ne více než 2% ročně. [3] Proto je zapotřebí prostředků na stavbu kostí, jako je teriparatid, které stimulují novékostformacea opravit změnu trabekulární mikroarchitektury, která je charakteristická pro zavedenou osteoporózu. [4,5] Protože novýkostformaceje primárně funkcí osteoblastu, látky, které působí buď zvýšením proliferace buněk osteoblastické linie nebo indukcí diferenciace osteoblastů, mohou zvýšit tvorbu kostí. [5,6]
Ačkoli mechanismy osteoporózy zůstávají nejasné, pravděpodobně souvisejí se sníženou dostupností nebo účinky kostních růstových faktorů, jako jsou kostní morfogenetické proteiny (BMP). [7] BMP, které strukturálně souvisejí s transformující se nadčeledí b, byly původně identifikovány svou schopností indukovat ektopickékost formaceu hlodavců. [8] BMP hrají důležitou úlohu vkostformacea diferenciace kostních buněk stimulací aktivity alkalické fosfatázy (ALP), jakož i syntézy proteoglykanu, kolagenu a osteopontinu (OPN). [9] Nedávná studie zjistila souvislost mezi osteoporózou a specifickými polymorfismy v genech BMP-2, ALP a OPN, což naznačuje, že jsou spojeny s rozvojem osteoporózy. [10]

CistanchedeserticolaMiliampér. (Orobanchaceae; zkráceně CD)(Cistanchedeserticola)je nativní bylina v Číně a je široce používána v tradiční medicíně jako terapeutické činidlo díky svým sedativním, analgetickým a imunostimulačním vlastnostem. [11] Moderní farmakologické studie ukázaly, že CD(Cistanchedeserticola)extrakty mohou stimulovat imunitu,[12] vychytávat volné radikály[13] a zvyšovat aktivitu superoxiddismutázy. [14] Protizánětlivé a antioxidační látky mají potenciál léčit osteoporózu zvýšenímkost formacea/nebo potlačení kostní resorpce. [15,16] Účinek CD však(Cistanchedeserticola)na funkci kostních buněk dosud nebyla stanovena. Zde uvádíme, že CD(Cistanchedeserticola)extrakt neovlivnil proliferaci, migraci nebo hojení ran aktivity kultivovaných osteoblastů, ale zvýšil expresi ALP, BMP-2 a OPN a mineralizaci kostí. Kromě toho ukazujeme, že mitogenem aktivovaná proteinkináza (MAPK) a signální dráhy jaderného faktoru (NF)-kB se mohou podílet na CD-zprostředkovaném zvýšení genové exprese a mineralizaci kostí. Naproti tomu CD(Cistanchedeserticola)extrakt nepotlačoval osteoklastalogenezi in vitro. Zejména léčba myší s CD(Cistanchedeserticola)extrakt zabránil úbytku kostní hmoty vyvolané ovariektomií in vivo. Naše data proto naznačují, že CD(Cistanchedeserticola)lze použít ke stimulacikostformacepro léčbu osteoporózy.

Cistanche deserticolaposílit imunitu

Materiály a metody

Cistanche deserticola extrakt a materiály

CÉDÉČKO(Cistanchedeserticola)extrakt byl zakoupen od společnosti Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Tchaj-wan). Extrakce a izolace CD(Cistanchedeserticola)byly sledovány tak, jak bylo popsáno výše (na základě spektrálních údajů identifikovali chemické složení včetně beta-sitosterolu, daukosterolu, kyseliny jantarové, triakontanolu, akteosidu, betainu a polysacharidu). [17] Králičí polyklonální protilátky specifické pro p-extracelulární signálem regulované kinázy (ERK), ERK, p-p38, p38, p-c-Jun N-terminální kinázy (JNK), JNK, p-p65 a p65 byly zakoupeny od santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, USA). Souprava ELISA osteokalcinu byla zakoupena od společnosti Biosource Technology (Nivelles, Belgie). C-terminální telopeptidy kolagenové soupravy ELISA typu I byly získány z Cross Laps (Herlev, Dánsko). Dominantně negativní mutant p38 poskytl Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA). Dominantně negativní mutant JNK poskytl Dr. M. Karin (University of California, San Diego, USA). Dominantně-negativní mutant ERK2 poskytl Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Všechna ostatní činidla byla získána od společnosti Sigma-Aldrich (St Louis, USA).

Buněčná kultura

Myší osteoblastová buněčná linie MC3T3-E1 byla zakoupena od American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Buňky byly kultivovány v 95% vzduchu, 5% CO2 s a-MEM, který byl doplněn 20 mm HEPES a 10% tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem, 2 mm glutaminem, penicilinem (100 U / ml) a streptomycinem (100 mg / ml).

Měření tvorby mineralizovaných uzlů

Tvorba mineralizovaných uzlů byla hodnocena tak, jak je popsáno. [18] Stručně řečeno, osteoblasty byly kultivovány v médiu obsahujícím vitamín C (50 mg/ml) a b-glycerofosfát (10 mm) po dobu dvou týdnů a médium bylo měněno každé tři dny. Po inkubaci s CD(Cistanchedeserticola)po dobu 12 dnů byly buňky dvakrát promyty 20 mm fyziologickým roztokem s pufrem Tris obsahujícím 0,15 m NaCl (pH 7,4), fixovány v ledově studeném 75% (V/V) ethanolu po dobu 30 minut a sušeny na vzduchu. Depozice vápníku byla stanovena pomocí alizarinového červeného S barvení. Stručně řečeno, ethanolem fixované buňky a matrice byly obarveny po dobu 1 hodiny 40 mm alizarinovou červeni-S (pH 4,2) a rozsáhle opláchnuty vodou. Vázaná skvrna byla eluována 10% (m/V) cetylpyridiniumchloridem a alizarinovou červenou S ve vzorcích byla kvantifikována měřením absorbance při 550 nm a porovnána se standardní křivkou. Jeden mol alizarinu red-S selektivně váže přibližně dva moly vápníku.

Cistanche deserticolaje dobré protvorba kostí

Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase

Celková RNA byla extrahována z osteoblastů pomocí soupravy TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Tchaj-wan). Reverzní transkripce byla provedena s použitím celkové RNA 2 mg a oligo(dT) primeru. [19,20] Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qPCR) byla provedena pomocí jednokrokového PCR Master Mixu TaqMan® (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Celková cDNA byla přidána (100 ng na 25 ml reakce) se sekvenčními specifickými primery a Taqmanovými® sondami. Všechny cílové genové primery a sondy byly zakoupeny komerčně, včetně b-aktinu jako vnitřní kontroly (Applied Biosystems). Testy qPCR byly provedeny ve trojím vyhotovení na sekvenčním detekčním systému StepOnePlus (Applied Biosystems). Cyklické podmínky byly 10minutová aktivace polymerázy při 95 °C následovaná 40 cykly o teplotě 95 °C po dobu 15 s a 60 °C po dobu 60 °C. Prahová hodnota byla stanovena nad nešablonovým kontrolním pozadím a v lineární fázi amplifikace cílového genu pro výpočet čísla cyklu, při kterém byl transkript detekován (označovaný CT).

Analýza western blot

Buněčné lyzáty byly připraveny tak, jak bylo popsáno výše. [21,22] Proteiny byly rozpuštěny pomocí SDS-PAGE a přeneseny do membrán Immobilon polyvinyldifluoridu (Millipore, Billerica, USA). Skvrny byly blokovány 4% bovinním sérovým albuminem po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a poté zkoumány králičími antihumánními protilátkami proti p-65 nebo p-p65 (1: 1000) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Po třech promytích byly skvrny inkubovány peroxidázou konjugovanou sekundární protilátkou proti králíkům (1: 1000) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Skvrny byly vizualizovány vylepšenou chemiluminiscencí pomocí X-OMAT LS filmu (Eastman Kodak, Rochester, USA).

Osteoporóza vyvolaná ovariektomií

Pro tuto studii byly použity samice myší ICR, čtyři týdny staré, 22 ~ 28 g. Myši byly bilaterálně ovariektomizovány v anestezii trichloracetaldehydu (100 mg/kg) a kontrolní myši byly pro srovnání operovány falešně (Sham). Minerální hustota kostí a obsah kostních minerálů byly měřeny po perorálním podání různých koncentrací CD(Cistanchedeserticola)extrahovat každé dva dny po dobu čtyř týdnů. Celková tělesná minerální hustota v kostech a obsah kostních minerálů byly stanoveny rentgenovým absorptiometrem s dvojí energií (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) pomocí režimu pro malé subjekty, jak bylo popsáno výše. [18,23] Všechny protokoly byly v souladu s institucionálními pokyny a byly schváleny Výborem pro péči o zvířata Čínské lékařské univerzity.

Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru Prism 4.01. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Uvedené hodnoty jsou průměrné SEM. Statistická analýza mezi dvěma vzorky byla provedena pomocí studentova t-testu. Statistická srovnání více než dvou skupin byla provedena pomocí jednosměrné analýzy rozptylu s Bonferroniho posthokovým testem. Ve všech případech P< 0.05="" was="" considered="">

Cistanche deserticolaje dobré protvorba kostí

Výsledky

Cistanche deserticolaextrakt zvyšuje mineralizaci kostí osteoblasty Přidání CD(Cistanchedeserticola)extrakt po dobu 24 nebo 48 hodin neovlivnil proliferaci myších osteoblastových buněk MC3T3-E1 v MTT testu (údaje nejsou uvedeny). Vzhledem k tomu, že diferenciace osteoblastů je složitý proces zahrnující proliferaci a migraci buněk, testovali jsme také migrační schopnost buněk MC3T3-E1 po léčbě CD(Cistanchedeserticola)extrahovat. Pomocí testů Transwell a hojení ran jsme zjistili, že CD(Cistanchedeserticola)extrakt neovlivnil migraci osteoblastů (údaje nejsou uvedeny). Tvorba mineralizovaných uzlů je jedním z markerů zrání osteoblastů. Barvení alizarinovou červenou S ukázalo, že mineralizované uzliny vznikly při kultivaci osteoblastů po dobu dvou týdnů v médiu obsahujícím vitamín C (50 μg/ml) a β-glycerofosfát (10 mm), což je způsob závislý na koncentraci přidáním CD(Cistanchedeserticola)(Obrázek 1a). Proto CD(Cistanchedeserticola)extrakt indukoval tvorbu kostních uzlů kultivovanými osteoblasty, ale ne jejich proliferaci nebo migraci. Zkoumali jsme také roli CD(Cistanchedeserticola)extrakt v RANKL-indukované osteoklastogeneze, ale nebyl zjištěn žádný účinek (údaje nejsou uvedeny).

Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje alkalickou fosfatázu, kostní morfogenetický protein-2 a expresi osteopontinu v kultivovaných osteoblastech

Diferencované osteoblasty vykazují zvýšenou aktivitu ALP, která koreluje s vysokými hladinami exprese enzymů. [18] Zjistili jsme, že léčba CD(Cistanchedeserticola)extrakt po dobu 72 hodin významně zvýšil aktivitu osteoblastu ALP (obrázek 1b). Vzhledem ke klíčové roli BMP-2, ALP a OPN v diferenciaci osteoblastů jsme testovali, zda CD(Cistanchedeserticola)extrakt působí na diferenciaci osteoblastů regulací exprese BMP-2, ALP a OPN. Léčba buněk CD(Cistanchedeserticola)extrakty zvýšily expresi mRNA ALP, BMP-2 a OPN způsobem závislým na koncentraci (obrázek 1c), což dokazuje, že CD(Cistanchedeserticola)extrakt indukoval diferenciaci osteoblastů upregulací exprese ALP, BMP-2 a OPN.

Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje tvorbu kostních uzlů prostřednictvím mitogenem aktivované proteinkinázové dráhy

Bylo hlášeno, že MAPK hraje důležitou roli vkostformace[24,25] takže jsme dále zkoumali, zda je tato signální dráha zapojena do CD(Cistanchedeserticola)extraktem indukovaná kostní mineralizace. Předléčba buněk inhibitorem ERK U0126, inhibitorem p38 SB203580 nebo inhibitorem JNK SP600125 redukovaným CD(Cistanchedeserticola)mineralizace kostí se zvýšeným extraktem (obrázky 2a, 3a a 4a). Kromě toho inhibitory také blokovaly CD(Cistanchedeserticola)exprese ALP, BMP-2 a OPN vyvolaná extraktem (obrázky 2b–4c). Transfekce buněk s ERK2, p38 nebo JNK mutantním redukovaným CD(Cistanchedeserticola)zvýšení exprese mRNA ALP, BMP-2 a OPN (obrázky 2c, 3c a 4c). Dále jsme přímo zkoumali aktivaci ERK, p38 a JNK po CD(Cistanchedeserticola)extrakční ošetření. Inkubace buněk s CD(Cistanchedeserticola)extrakt indukovaný ERK, p38 a JNK fosforylace (obrázky 2d, 3d a 4d). Proto ERK, p38 a JNK zprostředkovávají zvýšenékostformaceindukováno CD(Cistanchedeserticola)léčba osteoblastů.

Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje tvorbu kostních uzlů cestou jaderného faktoru-kB

Jak již bylo zmíněno, aktivace NF-kB je nezbytná prokostformace. [26,27] Dále jsme ošetřili osteoblasty inhibitory NF-kB pyrrolidin dithiokarbamátem (PDTC) a N-tosyl-L-fenylalanin chlormethylketonem (TPCK), které byly zakoupeny od společnosti Calbiochem (Darmstadt, Německo), abychom zjistili, zda se aktivace NF-kB podílí na CD(Cistanchedeserticola)extraktem indukovaná kostní mineralizace. Obrázek 5a ukazuje, že předúprava osteoblastů PDTC nebo TPCK inhibovala CD(Cistanchedeserticola)tvorba kostních uzlů vyvolaná extraktem a také snížení exprese ALP, BMP-2 a OPN (obrázek 5b a 5c). Fosforylace podjednotky NF-kB p65 je indikátorem aktivace NF-kB; [28] V souladu s tím jsme zjistili, že CD(Cistanchedeserticola)extrakt zvýšil fosforylaci p65 v osteoblastech (obrázek 5d). Tyto výsledky ukázaly, že aktivace NF-kB je důležitá pro expresi ALP, BMP-2 a OPN indukovanou EXTRAKTEM CD a tvorbu kostních uzlů.

Obrázek 4 Zapojení c-Jun N-terminálních kináz (JNK) doCistanchedeserticola(CD) extraktem indukovaná kostní mineralizace v osteoblastech. a) Buňky byly pokoveny ve 24jamkových destičkách a kultivovány v médiu obsahujícím vitamín C (50 mg/ml) a b-glycerofosfát (10 mM) po dobu dvou týdnů. Buňky byly současně léčeny CD(Cistanchedeserticola)extrakt (26 mg/ml) plus SP600125 (3 mM). Mineralizovaná tvorba uzlů byla hodnocena alizarinovým červeným S barvením (n = 5). b, c) Buňky byly předléčeny SP600125 po dobu 30 minut nebo transfekovány mutací JNK nebo 24 hodin, po níž následovala stimulace extraktem CD a aktivita alkalické fosfatázy (ALP) a exprese mRNA ALP, kostní morfogenetického proteinu (BMP)-2 a osteopontinu (OPN) byla měřena soupravou ALP a kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase. (d) Buňky byly ošetřeny CD extraktem v indikovaných časových intervalech a exprese p-JNK byla zkoumána westernovým blottingem. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)skupina ošetřená extraktem.

Inhibice úbytku kostní hmoty extraktem Cistanche deserticola u ovariektomizovaných myší

Zkoumání účinku disku CD(Cistanchedeserticola)osteoporóza byla vyvolána u samic myší ovariektomií. Jak se očekávalo, ovariektomizované myši vykazovaly sníženou celkovou hustotu minerálů v těle a obsah minerálů v kostech (obrázek 6a a 6b). Léčba CD(Cistanchedeserticola)extrakt po dobu čtyř týdnů inhiboval ztrátu kostní minerální hustoty a obsahu kostních minerálů způsobem závislým na dávce (obrázek 6a a 6b). Koncentrace ALP v krvi mohou odrážet osteoblastickou aktivitu. [29] Jak je znázorněno na obrázku 6c, CD(Cistanchedeserticola)inhiboval pokles sérové alp aktivity vyvolaný ovariektomií. Kromě toho, CD(Cistanchedeserticola)extrakt také zvýšil hladinu osteokalcinu, markerukostformacea snížila hladinu C-terminálních telopeptidů kolagenu typu I, markeru kostní resorpce (obrázek 6d a 6e). Tato zjištění tak podporují účinnost a účinnost CD(Cistanchedeserticola)extrakt v prevenci úbytku kostní hmoty in vivo.

Obrázek 6 Inhibice ovariektomie vyvolaná snížením kostní minerální hustoty a obsahu kostních minerálů oCistanchedeserticola(CD) extrakt. Samice myší ICR podstoupily falešnou operaci nebo byly ovariektomizovány. Ovariektomizované myši byly léčeny indikovanými koncentracemi CD(Cistanchedeserticola)extrakt orálním krmením. Celková minerální hustota kostí v těle (a), obsah minerálů v kostech (b), aktivita alkalické fosfatázy v séru (ALP), sérový osteokalcin (d) a sérové C-terminální telopeptidy kolagenu typu I (e) byly stanoveny čtyři týdny po operaci. Údaje jsou prezentovány jako střední SE, n=8–10 myší/skupina. *P< 0.05,="" compared="" with="" sham;="" #p="">< 0.05,="" compared="" with="" ovariectomized="">

DISKUSE

Klikněte zde pro informace o části II (Diskuse a závěr) tohoto článku.

Od: 'Cistanchedeserticolaextrakt se zvyšujekostformacev osteoblastech"Te-Mao Li^aa další

---© 2012 Autoři. JPP © 2012 Královská farmaceutická společnost 2012Časopis farmacie a farmakologie,64, s. 897–907