Fenylethanoidové glykosidy Cistanche Tubulosa indukují apoptózu v buňkách Eca-109 cestou mitochondrie-dependentní dráhy
Mar 06, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
CHANGSHUANG FU, JINYU LI, ADILA AIPIRE, LIJIE XIA, YI YANG, QIUYAN CHEN, JIE LV, XINHUI WANG a JINYAO LI
Abstraktní
Cistanche tubulosamá různé biologické funkce. V této studii byl zkoumán protinádorový účinek ve vodě rozpustných fenylethanoidních glykosidů C. tubulosa (CTPG-W) na karcinom jícnu. Buňky Eca-109 byly ošetřeny CTPG-W a životaschopnost buněk byla měřena testem MTT. Apoptóza, buněčný cyklus, mitochondriální membránový potenciál (Δψm) a reaktivní formy kyslíku byly analyzovány průtokovou cytometrií. Hladiny proteinů v apoptotických drahách byly detekovány analýzou western blot. Bylo zjištěno, že CTPG‑W významně snižuje životaschopnost buněk Eca{4}} prostřednictvím indukce apoptózy a zástavy buněčného cyklu. Po léčbě CTPG-W bylo Δψm Eca-109 výrazně sníženo, což je spojeno s upregulovanými hladinami B-buněčného lymfomu -2 (Bcl-2) asociovaného X a downregulovanými hladinami Bcl{11}}. V důsledku toho byly zvýšeny hladiny cytochromu c a c-Jun NH2-terminální kinázy, což zvýšilo hladinu štěpené-poly (ADP-ribóza) polymerázy a štěpené-kaspázy-3, {{18} } a -9, ale ne caspase-8. V souladu s tím vykazovaly hladiny reaktivních forem kyslíku v buňkách Eca{21}} významné změny. Tyto výsledky ukázaly, že CTPG-W indukoval apoptózu buněk Eca{23}} prostřednictvím mitochondriálně závislé dráhy.
Úvod
Karcinom jícnu je jedním z nejběžnějších typů rakoviny s 11. nejvyšší mírou nemocnosti a 6. nejvyšší úmrtností na celém světě a v roce 2015 způsobil ~439000 úmrtí (1). Incidence rakoviny jícnu se v různých regionech výrazně liší, přičemž východní Asie a východní a jižní Afrika vykazují nejvyšší míru výskytu a západní Afrika vykazuje nejnižší míru v roce 2012 (1,2). V Číně byly v roce 2015 odhadované případy rakoviny jícnu a úmrtnost 477,{10}} a 375,{12}} (3). Přestože se míra nemocnosti na rakovinu jícnu v letech 2005 až 2015 v zemích se středním a vysokým středním sociodemografickým indexem snížila, míra úmrtnosti zůstává vysoká kvůli špatné prognóze (1,4). K léčbě rakoviny jícnu se používá kombinace chirurgické resekce s chemoterapií nebo radioterapií, nicméně bylo hlášeno, že mezi lety 2003 a 2014 zůstala 5-letá míra přežití<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
Tradiční čínská bylinná medicína (CHM) se používá k léčbě různých typů rakoviny, včetně nemalobuněčného karcinomu plic (6), kolorektálního karcinomu (7), hepatocelulárního karcinomu (8). Nedávno klinické studie uvedly, že kombinace CHM s chemoterapií nebo radioterapií nejen prokázala řadu přínosů pro kvalitu života a zmírnění vedlejších účinků vyvolaných chemoterapií nebo radioterapií (9,10), ale také zlepšila míru přežití pacientů. s nemalobuněčným karcinomem plic, jater, žaludku, kolorekta, nosohltanu nebo děložního čípku (9). Existují však protichůdné důkazy týkající se účinnosti léčby CHM u karcinomu jícnu (10,11). Četné studie zjistily, že řada rostlinných léků nebo složek může inhibovat růst buněk rakoviny jícnu in vitro a in vivo, včetně Andrographis paniculata (12,13), Daikenchuto (14), icariin (15), Rosa Roxburghii Tratt a Fagopyrum Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (nový ent-kaurenový diterpenoid) (19), Qigesan (20) a tonglianský odvar (21). Cistanche je typ CHM a vykonává různé biologické funkce, včetně antioxidační, protizánětlivé a neuroprotektivní [22,23]. Naše předchozí studie to prokázalaFenylethanoidové glykosidy Cistanche tubulosa(CTPG) by mohl potlačit růst buněk melanomu B16-F10 in vitro a in vivo (24). Špatná rozpustnost dříve používaného CTPG ve vodě však omezuje vývoj léčiva (24). Proto byl použit ve vodě rozpustný CTPG (CTPG-W) a byl zkoumán protinádorový účinek na buňky rakoviny jícnu (Eca-109). Bylo zjištěno, že CTPG-W může v závislosti na dávce inhibovat životaschopnost buněk Eca-109 prostřednictvím indukce apoptózy prostřednictvím mitochondriálně závislé dráhy.
Materiály a metody Zvířata.
Samice myší C57BL/6 (6-8 týdnů, ~25 g) byly zakoupeny od Beijing Laboratory Animal Research Center (Peking, Čína) a umístěny v prostředí s řízenou teplotou (25 °C) se světelným cyklem (12/ 12) Zařízení pro zvířata Univerzity Sin-ťiang (Urumqi, Čína). Všechna zvířata dostávala vodu a potravu bez patogenů.
Buněčná linie a kultura. Buněčná linie lidského karcinomu jícnu (Eca{0}}) byla uchována v Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Čína) a kultivována v RPMI{{1} } médium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) doplněné 10 procenty tepelně inaktivovaného fetálního bovinního séra (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Čína), 1 procento L -glutamin (100 mM), 100 U/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu při 37 °C ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 procent CO2.
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). CTPG-W (kat. č. SGJG20170410) byl zakoupen od Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Hlavní sloučeniny CTPG byly kvalifikovány a kvantifikovány pomocí HPLC podle naší předchozí studie (24). Krátce, HPLC byla provedena na koloně ZORBAX SB‑C18 (250x4,6 mm; 5 µm) při 30 °C a eluována 0,2% roztokem kyseliny mravenčí a gradientem methanolu začínajícím na 23%, protože se každou minutu přidal 1 ml. po dobu 45 minut až do dosažení 31 procent . Celkem bylo nastříknuto 10 ul vzorku a detekováno při 330 nm. Echinakosidový standard byl zakoupen od Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Čína) a akteosidový standard byl zakoupen od Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Německo). Standardy byly použity k analýze složek CTPG-W.
MTT test. Buněčná proliferace byla měřena pomocí MTT testu. Buňky Eca{{0}} byly naočkovány do 96-jamkových destiček v hustotě 5x103 buňky v 100 µl RPMI{{5 }} médium/jamka a kultivováno při 37 °C po dobu 24 hodin, poté ošetřeno různými koncentracemi (0, 200, 400, 600 a 800 µg/ml) CTPG-W nebo 0,4 procenta dimethylsulfoxidu (DMSO) po dobu 24, 48 a 72 hodin. DMSO byl použit jako kontrola rozpouštědla (800 ug/ml CTPG-W obsahující 0,4 procenta DMSO). Jako pozitivní kontrola byla použita cisplatina (20 ug/ml). Následně byl supernatant odstraněn po centrifugaci při 225 xg po dobu 5 minut při teplotě místnosti a do každé jamky bylo přidáno 100 ul roztoku MTT (0,5 mg/ml v RPMI-1640 médiu bez FBS) a inkubováno při 37 °C. na 3 h. Vytvořené krystaly formazanu byly rozpuštěny ve 200 ul DMSO. Hodnoty optické hustoty (OD) byly měřeny při vlnové délce 490 nm 96-jamkovou čtečkou mikrodestiček (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Relativní životaschopnost buněk byla vypočtena podle vzorce: Životaschopnost buněk (procenta)=(ODléčené/ODneléčené)x100 procent. Morfologie buněk Eca‑109 byla pozorována pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu (zvětšení x 200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokio, Japonsko).
Pro proliferaci splenocytů byly myši C57BL/6 usmrceny cervikální dislokací a byly izolovány sleziny. Byla vyrobena jednobuněčná suspenze a splenocyty byly vysety do 96-jamkových destiček v hustotě 1x105 buněk/jamka ve 100 ul RPMI-1640 média a poté ošetřeny různými koncentracemi (0, 200, 400, 600 a 800 ug/ml) CTPG-W po dobu 24, 48 a 72 hodin při 37 °C s 5 procenty CO2. Proliferace splenocytů byla měřena MTT testem podle výše uvedeného protokolu. Stimulační index{20}}ODléčený/ODneléčený.
Měření apoptózy a buněčného cyklu. Buňky Eca{{0}} byly kultivovány v miskách o průměru 60 mm při hustotě 2,5x105 buněk/misku po dobu 24 hodin a ošetřeny různými koncentracemi ({{31} }, 200, 400, 600 a 800 µg/ml) CTPG-W nebo 0,4 procenta DMSO po dobu 24 hodin při 37 °C s 5 procenty CO2. Buňky byly shromážděny a obarveny soupravou pro detekci apoptózy Annexin V-fluorescein isothiokyanát (FITC)/propidium jodid (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Čína), podle protokolů výrobce. Vzorky byly odebrány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) a analyzovány pomocí FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). K analýze účinku CTPG-W na buněčný cyklus bylo 2,5x105 Eca{24}} buněk nasazeno do 60 mm kultivačních misek a ošetřeno CTPG-W (0, 100, 200 a 400 ug/ml) nebo 0,4 procenta DMSO po dobu 24 hodin při 37 °C s 5 procenty CO2. Všechny buňky byly sklizeny a dvakrát promyty ledově vychlazeným PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), poté fixovány v 70% ledově studeném ethanolu při 4 °C po dobu 30 minut. Po dvojnásobném promytí ledově chladným PBS byly buňky resuspendovány ve 300 ul PI/RNázového barvícího pufru (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Distribuce buněčného cyklu byla analyzována pomocí softwaru ModFit LT 3.0 průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur).
Analýza mitochondriálního membránového potenciálu (Δψm) a reaktivních forem kyslíku (ROS). K analýze Δψm byly buňky Eca{0}} ošetřeny CTPG-W (0, 400, 600 a 800 µg/ml) nebo 0,4% DMSO po dobu 24 h při 37 °C s 5 procenty CO2 a obarveno soupravou pro stanovení mitochondriálního membránového potenciálu pomocí JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Čína), podle protokolu výrobce, po dobu 20 minut při 37 °C . Po dvojnásobném promytí promývacím pufrem JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology) byly vzorky resuspendovány s 300 ul promývacího pufru JC‑1 a analyzovány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur). Fluorescence barviva JC‑1 v buňkách Eca‑109 byla také pozorována pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu (zvětšení, x 200; Nikon Eclipse Ti‑E). Pro analýzu ROS byly buňky Eca{21}} ošetřeny CTPG-W (0, 400, 600 a 800 µg/ml) po dobu 2, 4, 6, 12 a 24 hodin a obarveny reaktivními druhy kyslíku Assay Kit (Beyotime Institute of Biotechnology), podle protokolu výrobce, po dobu 20 minut při 37 °C. Po trojím promytí ledově studeným PBS byly vzorky odebrány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur) a analyzovány softwarem FlowJo 7.6.
Aktivita vychytávání radikálů 2,2‑difenyl‑1‑pikrylhydrazyl (DPPH). Aktivita CTPG-W zachycující volné radikály byla stanovena pomocí testu volných radikálů DPPH podle publikovaného protokolu s menší modifikací, protože methanol byl nahrazen ethanolem, aby se rozpustil DPPH (25,26). Pro měření v ustáleném stavu bylo 150 µl DPPH (100 mmol/l) v ethanolu smícháno s různými koncentracemi CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 a 600 ug/ml) v 50 ul PBS a inkubovány ve tmě po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Absorbance při 517 nm byla detekována v přítomnosti a nepřítomnosti CTPG-W. Jako pozitivní kontrola bylo použito celkem 50 ul vitaminu C. Aktivita vychytávání radikálů DPPH byla vypočtena pomocí vzorce: Vychytávání ( procenta )=[1-(A sample-Ablank)/A0] x100, kde Ablank je absorbance kontroly (bez DPPH), Vzorek je absorbance vzorku a A0 je absorbance PBS s DPPH.
Western blot analýza. Buňky Eca{{0}} byly ošetřeny CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) nebo 0,4% DMSO po dobu 24 hodin při 37 °C s 5 procenty CO2. Následující promytí dvakrát PBS byly buňky lyžovány v radioimunoprecipitačním lyzačním pufru (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, Čína) po dobu 20 minut na ledu. Po centrifugaci při 10,000 xg po dobu 10 minut při 4 °C byly supernatanty shromážděny a koncentrace proteinu byly detekovány pomocí soupravy kyseliny bicinchoninové (Thermo Fisher Scientific, Inc.) podle protokolů výrobce. Analýza Western blot byla provedena podle našeho předchozího popisu (24). Protilátky proti kaspáze-7 (kat. č. D120077), kaspáze-8 (kat. č. D155240), kaspáze-9 (kat. č. D220078), B-buněčný lymfom{ {24}} (Bcl-2) asociovaný X (Bax) (kat. č. D220073) a Bcl-2 (kat. č. D260117) a anti-myší IgG-křenová peroxidáza (HRP ) (kat. č. D111050) a anti-králičí IgG-HRP (kat. č. D110058) byly zakoupeny od BBI Life Sciences (Shanghai, Čína). Protilátky proti kaspáze-3 (kat. č. E-AB-10050) a aktivní kaspáze-3 (kat. č. E-AB-22115) byly zakoupeny od společnosti Elabscience ( Wuhan, Čína). Další protilátky proti kaspáze -7 (kat. č. 9492), poly (ADP-ribóza) polymeráze (PARP) (kat. č. 9542), cytochromu c (kat. č. AC909), c-Jun NH{ {48}}terminální kináza (JNK) (kat. č. 9252S) a -aktin (kat. č. 58169) byly získány od Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Všechny primární a sekundární protilátky byly naředěny v poměru 1:1,000. Primární protilátky byly inkubovány při 4 °C přes noc a sekundární protilátky byly inkubovány při 37 °C po dobu 1 hodiny.
Cílové proteiny byly detekovány pomocí vylepšené chemiluminiscenční testovací soupravy (Beyotime Institute of Biotechnology), podle protokolu výrobce.
Statistická analýza. Statistická významnost byla vypočtena jednosměrnou analýzou rozptylu s Tukeyho post hoc testem a výsledky byly analyzovány pomocí softwaru GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) mezi léčebnými a kontrolními skupinami. Všechna data byla prezentována jako průměr ± standardní odchylka. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Fenylethanoidové glykosidy Cistanche tubulosa(CTPG)
Výsledek
CTPG‑W potlačuje růst buněk Eca‑109. Složky CTPG-W byly kvalifikovány a kvantifikovány pomocí HPLC (obr. 1), které byly porovnány se standardy echinakosidu a akteosidu. Podle retenčních časů píku a ploch píku obsahoval CTPG-W 39,16 procent echinakosidu a 2,44 procent akteosidu. Nejprve byl pomocí testu MTT stanoven účinek CTPG-W na životaschopnost buněk Eca{9}}. CTPG-W byl rozpuštěn v DMSO na 200 mg/ml a zředěn médiem RPMI-1640 obsahujícím 10 procent teplem inaktivovaného FBS na uvedené koncentrace. Buňky Eca-109 byly ošetřeny CTPG-W a životaschopnost buněk byla analyzována pomocí MTT testu v uvedených časových bodech. Léčba CTPG‑W významně snížila životaschopnost buněk Eca-109 způsobem závislým na dávce a čase (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
CTPG‑W indukuje apoptózu v buňkách Eca‑109. Aby se zjistilo, zda CTPG-W potlačuje růst buněk Eca{2}} prostřednictvím indukce apoptózy nebo nekrózy, byly buňky ošetřeny různými koncentracemi CTPG-W. Po 24 hodinách byla apoptóza a nekróza buněk Eca{5}} detekována barvením Annexinem V/PI. Jak je znázorněno na obr. 3A, buňky Annexin V-/PI plus byly uzavřeny jako nekrotické buňky a buňky Annexin V plus /PI plus a Annexin V plus /PI- byly uzavřeny jako apoptotické buňky. CTPG-W primárně indukoval apoptózu Eca{10}} buněk způsobem závislým na dávce, ačkoli nekrotické Eca{12}} buňky také významně vzrostly při léčbě 600 a 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
CTPG‑W indukuje zástavu buněčného cyklu ve fázi S v buňkách Eca‑109. Narušení cyklu rakovinných buněk potlačí buněčný růst a podpoří apoptózu (27). Distribuce buněčného cyklu v buňkách Eca-109 byla detekována pomocí barvení PI po ošetření CTPG-W po dobu 24 hodin. Bylo pozorováno, že buňky ve fázi S se zvýšily a buňky ve fázích G0/G1 naznačovaly celkově významný pokles po léčbě CTPG-W (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
CTPG‑W snižuje Δψm a indukuje uvolňování cytochromu c. Apoptóza může být indukována mitochondriálně závislou cestou (28,29). Pro-a antiapoptotické členy rodiny BCL-2 proteinů hrají důležitou roli v regulaci integrity mitochondriální membrány (30,31). Po ošetření CTPG-W po dobu 24 hodin byl Δψm hodnocen pomocí barvení JC-1. Agregát JC‑1 (červená fluorescence detekovaná v FL‑2) se rozpadne na monomer (zelená fluorescence detekovaná v FL-1), když se Δψm snižuje (32). Jak je znázorněno na obr. 5A, frekvence buněk FL-1 plus FL-2-/plus se významně zvýšily způsobem závislým na dávce, což ukazuje, že Δψm buněk Eca-109 se snížil. Změny fluorescence v buňkách Eca‑109 byly také pozorovány pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu (obr. 5B). Se zvyšujícími se koncentracemi CTPG‑W se červená fluorescence snižovala a zelená fluorescence zvyšovala, což je v souladu s údaji z průtokové cytometrie. Bylo také pozorováno, že hladina cytochromu c v cytosolu byla výrazně zvýšena (obr. 5C), což je výsledkem snížení Δψm. To potvrzuje závěr vyvozený ze zvýšeného počtu FL-1 plus FL-2-/plus buněk, že Δψm se snížil v důsledku léčby CTPG-W. Bylo hlášeno, že JNK může regulovat aktivaci rodiny proteinů BCL-2 způsobující uvolňování cytochromu c (33-35). Bylo také stanoveno, že hladina JNK byla po léčbě CTPG-W výrazně zvýšena (obr. 5C). Výsledky ukázaly, že CTPG-W může indukovat apoptózu buněk Eca{30}} prostřednictvím mitochondriálně závislé dráhy.
Vliv CTPG‑W na intracelulární tvorbu ROS. ROS by mohla snížit Δψm, aby vyvolala apoptózu (36). Aby se zjistilo, zda CTPG-W může zvýšit produkci ROS, buňky Eca-109 byly ošetřeny různými koncentracemi CTPG-W. Buňky byly shromážděny v uvedených časových bodech a obarveny DCFH-DA. Produkce intracelulárních ROS v buňkách Eca{5}} byla stanovena průtokovou cytometrií. Jak je znázorněno na obr. 6A, 800 ug/ml CTPG-W významně zvýšilo produkci ROS od 2-6h a snížilo od 12-24h. Navíc 400 µg/ml CTPG‑W významně zvýšilo produkci ROS od 12-24 h. Kromě toho 200 ug/ml CTPG-W významně nezměnilo produkci ROS. Dynamické změny produkce ROS mohou souviset s apoptózou buněk Eca{15}}. Bylo také stanoveno, že CTPG-W měl aktivitu vychytávání volných radikálů (obr. 6B), což může souviset se sníženou produkcí ROS v buňkách Eca-109 ošetřených 800 ug/ml CTPG-W po 12 hodinách.
CTPG-W upreguluje aktivitu kaspázy-3, kaspázy-7, kaspázy-9 a PARP. Uvolnění cytochromu c v důsledku redukce Δψm by mohlo aktivovat kaspázové proteázy k indukci apoptózy (29,30,37). Po ošetření CTPG-W po dobu 24 hodin byla pomocí analýzy western blot detekována aktivace kaspázy-3, 7, 8, 9 a PARP. V porovnání s kontrolní skupinou byly úrovně štěpené kaspázy-9, štěpené kaspázy-7, štěpené kaspázy-3 a štěpené-PARP, ale nikoli úrovně štěpené kaspázy{{ 20}}, byly upregulovány léčbou CTPG způsobem závislým na dávce (obr. 7). Tyto výsledky ukázaly, že CTPG-W redukoval Δψm a podporoval uvolňování cytochromu c k aktivaci kaspáz, které indukují apoptózu Eca-109 buněk.
Extrakt z Cistanche tubulosa
Diskuse
Tradiční CHM by mohla indukovat apoptózu buněk zhoubného nádoru jícnu prostřednictvím různých drah, včetně vnějšího receptoru smrti, vnitřních drah mitochondriálního a endoplazmatického retikula (29). Naše předchozí studie prokázala, že CTPG jako hlavní složka C. tubulosa inhibuje růst buněk melanomu B16-F10 prostřednictvím indukce apoptózy prostřednictvím mitochondriálně závislé dráhy (24). V této studii byl zkoumán protinádorový účinek CTPG-W na Eca-109 buňky a bylo zjištěno, že CTPG-W potlačoval růst Eca{8}} buněk, indukoval apoptózu a zástavu buněčného cyklu, snížil Δψm, zvýšil uvolňování cytochromu c a aktivovaných kaspáz. CTPG a CTPG-W by mohly indukovat apoptózu a zastavení buněčného cyklu v rakovinných buňkách. Přesné mechanismy se však liší kvůli různým složkám CTPG (26,64 procenta echinakosidu, 10,19 procenta akteosidu a 1,71 procenta isoakteosidu) a CTPG-W (39,16 procenta echinakosidu a 2,44 procenta akteosidu). CTPG zastavil buňky B16-F10 ve fázích G0/G1, ale CTPG-W zastavil buňky Eca-109 ve fázi S (24). Produkce ROS byla CTPG zvýšena v závislosti na dávce, ale indikovala změnu v závislosti na čase vysokou dávkou CTPG-W, která se významně zvýšila na začátku léčby CTPG-W (2-6 h) a významně poklesly po 12 hodinách ve srovnání s kontrolou. Možným důvodem je, že hlavní složkou CTPG-W je echinakosid. Řada studií uvádí, že echinakosid může inhibovat produkci ROS a apoptózu indukovanou ROS a uplatnit své neuroprotektivní účinky a účinky proti stárnutí (38-40). Podobně byla v této studii pozorována aktivita vychytávání volných radikálů. Proto se spekulovalo, že některé složky, včetně verbascosidu, iso-verbascosidu a salidrosidu ve vysoké dávce CTPG-W, by mohly okamžitě vyvolat tvorbu ROS, která by způsobila apoptózu Eca-109 buněk (41,42), a pak ROS byl vyčištěn echinakosidem. Dalším možným důvodem rozdílů v produkci ROS pomocí CTPG a CTPG-W je to, že v této studii a v předchozí studii byly použity různé buněčné linie (24). Dong et al (43) uvedli, že echinakosid by mohl indukovat apoptózu lidských buněk kolorektálního karcinomu SW480 prostřednictvím generování oxidativního poškození DNA bez zvýšených hladin ROS.
Léčba CTPG-W snížila Δψm a způsobila uvolnění cytochromu c, který podporuje štěpení kaspázy-9 (28). V souladu s tím byly hladiny štěpené kaspázy-9 regulovány léčbou CTPG-W. Následně může aktivní kaspáza-9 aktivovat kaspázu-3 k indukci apoptózy (44). Hladiny štěpené kaspázy{10}} byly také zvýšeny léčbou CTPG-W. Kaspáza-8 však nebyla aktivována CTPG-W, což naznačuje, že vnější dráha receptoru smrti nebyla zapojena do apoptózy indukované CTPG-W. Tato pozorování naznačují, že CTPG-W indukuje apoptózu buněk Eca{16}} prostřednictvím aktivace mitochondriálně závislé dráhy.
PARP hraje důležitou roli v genomové stabilitě a může být štěpena aktivními kaspázami, zejména kaspázou-3 a -7 (45). Bylo zjištěno, že léčba CTPG-W aktivovala kaspázu-3 a -7, které mohou štěpit PARP za účelem inhibice opravy DNA a způsobit apoptózu.
CTPG-W také v závislosti na dávce a čase potlačuje růst buněk lidského hepatocelulárního karcinomu BEL-7404 (nepublikovaná data). Ačkoli CTPG-W inhibuje růst Eca{5}} a BEL{6}} buněk, podporuje proliferaci splenocytů, což může být způsobeno obsahem polysacharidů (~50 procent) v CTPG-W (46 ). Podobně řada studií uvádí, že polysacharidy mohou podporovat proliferaci splenocytů (46-49). Na myším modelu bylo zjištěno, že CTPG‑W významně zvýšil index sleziny ve srovnání s kontrolní skupinou, ale neovlivnil tělesnou hmotnost a další orgánové indexy včetně srdce, jater, ledvin a plic (nepublikovaná data), což ukazuje, že CTPG-W nemá žádný cytotoxický účinek na normální buňky.
Souhrnně data naznačovala, že CTPG-W inhibuje růst buněk Eca-109 indukcí apoptózy prostřednictvím mitochondriálně závislé dráhy.
cistanche výhody: anti-apoptóza
Poděkování
Autoři by rádi poděkovali Dr. Jianhua Yangovi (Baylor College of Medicine) za vyleštění rukopisu.
Financování
Tato studie byla podpořena 13. pětiletým plánem pro klíčové disciplíny biologie nabídkového projektu (grant č. 17SDKD0202), Xinjiang Normal University a Key Laboratory of Special Environment Biodiversity Application and Regulation in Xinjiang (grant č. XJTSWZ-2017-04) JL a grant Čínské národní nadace pro přírodní vědy (grant č. 31760260) pro XW.
Dostupnost dat a materiálů
Údaje a materiály použité a analyzované v průběhu této studie jsou k dispozici od odpovídajícího autora na přiměřené vyžádání.
Příspěvky autorů
CF, AA, YY a QC provedly experimenty. LX, JLv a XW analyzovaly data a připravená čísla. JinyuL a JinyaoL navrhli projekt a napsali rukopis.
Etický souhlas a souhlas s účastí
Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny Výborem pro etiku pokusů na zvířatech Klíčové laboratoře biologických zdrojů a genetického inženýrství Xinjiang (schválení, č. BRGE-AE001; Univerzita Xinjiang).
Souhlas pacienta se zveřejněním
Nelze použít.
Konkurenční zájmy
Autoři prohlašují, že nemají žádné konkurenční zájmy.
Reference
Wu CR, Lin HC a Su MH: Reverze působením vodyextrakty z Cistanche tubulosaz behaviorálních deficitů v modelu potkanů podobných Alzheimerově chorobě: Relevance pro ukládání amyloidu a funkci centrálního neurotransmiteru. BMC Complement Altern Med 14: 202, 2014.
Li J, Aspire A, Gao L, Huo S, Luo J a Zhang F:Fenylethanoidové glykosidy z Cistanche tubulosainhibuje růst B16-F10 buněk in vitro i in vivo indukcí apoptózy prostřednictvím mitochondrie-dependentní dráhy. J Rak 7: 1877-1887, 2016.
Brand-Williams W, Culver ME a Berset C: Použití metody volných radikálů k hodnocení antioxidační aktivity. LWT-Food Sci Technol 28: 25-30, 1995.
