Analýza aromatických složek a diferenciálních metabolitů v Cistanche Musalais na základě GC-MS a metabolismu
Nov 28, 2025
Abstraktní:Tato studie připravila Cistanche Musalais pomocí tradičních technik s červenými hrozny Xinjiang Hetian a různými přísadami Cistanche. Optimální podmínky zpracování byly stanoveny jednocestnou ANOVA. GC–MS a necílená metabolomika byly použity k analýze aromatických složek a diferenciálních metabolitů a byly kvantifikovány aktivní složky, jako jsou celkové flavonoidy a celkové polyfenoly. Optimální podmínky byly: počáteční obsah cukru 32 stupňů Bx, teplota fermentace 25 stupňů a 7% přídavek Cistanche deserticola. Za těchto podmínek obsah alkoholu, celková kyselost, celkové flavonoidy a celkové polyfenoly dosáhly (12,6 ± 0,6) % obj., (3,82 ± 0,19) g/l, (0,80 ± 0,01) g/l, respektive (0,60 ± 0,00) g/l. GC–MS detekovalo 38 aromatických sloučenin, přičemž nejrozšířenější třídou byly estery (24 sloučenin), dále 6 alkoholů, 2 ketony a 2 aldehydy. Ve srovnání s Musalais vyrobeným výhradně z hroznové šťávy vykazoval Cistanche deserticola Musalais výrazně vyšší hladiny klíčových esterů, včetně ethylacetátu (6,42 % vs Metabolomics identifikoval 230 různých metabolitů (VIP větší nebo rovno 1, P < 0,05), obohacených o dráhy související s transportéry ABC a biosyntézou aminokyselin. Složky jako trigonellin a crocin byly významně zvýšeny. Metabolismus aminokyselin přispěl k vytvoření charakteristického chuťového profilu. Tato studie poskytuje teoretický a technický základ pro vývoj a zlepšování kvality Cistanche Musalais. Budoucí výzkum by měl zahrnovat molekulární senzorické techniky, jako je GC–O, aby bylo možné lépe identifikovat klíčové aktivní sloučeniny odpovědné za celkový profil chuti.
Klíčová slova: Cistanche;Musalais; GC-MS; metabolomika
CistancheMusalais
Podrobnosti nabídky Cistanche Musalais
Musalais (Msalais)je tradiční fermentovaný nápoj jedinečný pro Xinjiang, vyrobený z červených hroznů Awati nebo červených hroznů Hetian (Hotan). Vyrábí se odšťavňováním, zahušťováním a spontánní fermentací a je charakterizován jako primitivní, přírodní a zelený. Jako jedinečný čínský přirozeně kvašený alkoholický nápoj vykazuje Musalais zřetelné regionální charakteristiky ve smyslových vlastnostech, nutriční hodnotě a funkčních činnostech. Alkoholy, estery, aldehydy, kyseliny, fenoly a terpeny generované během fermentace nejen propůjčují jedinečnou chuť, ale jsou také spojeny s výhodami, jako je podpora krevního oběhu, snížení krevních lipidů, tonizace ledvin a posílení těla, regulace cholesterolu a udržení kardiovaskulárního a cerebrovaskulárního zdraví, takže je vhodný pro spotřebitele různého věku [1].
V posledních letech, s rostoucí spotřebitelskou poptávkou po zdravých nápojích, se trh s funkčními lihovinami rychle rozšířil. Na základě tradičního vaření obsahují funkční likéry specifické funkční komponenty, které splňují potřeby pro wellness, udržování zdraví nebo specifickou fyziologickou regulaci. Jejich kvalitu ovlivňují suroviny, procesy, mikrobiální společenstva a stabilita funkčních složek [2]. V lidové praxi jižního Sin-ťiangu se během přípravy Musalais často přidávají místní doplňky, jako je kustovnice, světlice barvířská, Cistanche a šafrán, aby se zvýšily zdravotní přínosy a obohatily rozmanitost chutí [3]. Mezi nimi je Cistanche bohatý na polysacharidy, aminokyseliny, fenylethanoidní glykosidy, iridoidní glykosidy a alkaloidy – má tonizující účinky na jang ledvin, moduluje neuroendokrinní funkce a bojuje proti únavě, čímž si vysloužil název „ženšen pouště“ [4–5].
Industrializace Cistanche Musalais však v současnosti čelí výzvám, včetně nedostatku výrobních norem, neúplné technologie zpracování a nedostatečného výzkumu chuťových látek, což omezuje její propagaci na trhu a zlepšování kvality. V této studii byl Cistanche použit jako doplněk k optimalizaci procesu fermentace Musalais. GC-MS a necílená metabolomika byly použity k systematickému řešení aromatických složek a diferenciálních metabolitů s cílem poskytnout teoretický základ a technickou podporu pro standardizovanou výrobu, modulaci chuti a funkční vylepšení Cistanche Musalais, a tím podpořit modernizaci a rozvoj hodnoty tohoto tradičního nápoje.
1 Materiály a metody
1.1 Materiály a činidla
Cistanche tubulosa (tubulární Cistanche): prvotřídní komerční vzorky pocházející z Hetian (Hotan), Xinjiang, s baculatou texturou a bez plísní a nečistot.
Červené hrozny Hetian: komerční ovoce s neporušeným vzhledem a silným aroma, pocházející z Hetian, Xinjiang.
Metanol a acetonitril: Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
Kyselina mravenčí: TCI (Shanghai) Development Co., Ltd.
L-2-chlorofenylalanin: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Přístroje a vybavení
08-2T magnetické míchadlo s konstantní teplotou, Shanghai Meiyingpu Instrument Co., Ltd.
Zařízení 57330-U SPME a vlákno 57348-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME, Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.
6890N-5973 GC–MS systém, Agilent Technologies (China) Co., Ltd.
Chlazená odstředivka 5430R, Eppendorf (Shanghai) International Trading Co., Ltd.
TL-48R vysoce výkonná bruska tkáně, Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.
Vakuový koncentrátor SCIENTZ-1LS, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.
Vanquish Flex UHPLC, Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
SDAJ-0.5 Linka na výrobu vína v čínském stylu, Shandong Anji Bio-Fermentation Equipment Technology Co., Ltd.
1.3 Experimentální metody
1.3.1 Průběh procesu
Cistanche byl napařen pro pozdější použití. Hrozny Hetian červené byly umyty a vybrány, odstopkovány a rozdrceny. Hroznová šťáva byla extrahována lisem, poté zahřívána a koncentrována, aby se upravily indikátory koncentrace šťávy. Nakonec byl zapařený produkt Cistanche smíchán s koncentrovanou hroznovou šťávou a fermentován za kontrolované teploty a časových parametrů. Po fermentaci byl produkt vyčeřen a získal se Cistanche Musalais.
1.3.2 Příprava Cistanche
S menšími úpravami Gong et al. [6], vysoce kvalitní, neznehodnocená sušená Cistanche byla oloupána, nakrájena, zabalena do gázy a napařena po dobu 20 minut pro pozdější použití.
1.3.3 Příprava hroznové šťávy
Byly použity červené hrozny Hetian s počáteční rozpustnou sušinou (cukr) 18 stupňů Bx. Nahnilé, poškozené a nerovnoměrně vyzrálé hrozny byly odstraněny. Po umytí a oloupání se hrozny lisovaly. Šťáva byla vařena (koncentrována) při vysoké teplotě a koncentrace byla zastavena, když cukr dosáhl 26, 29 nebo 32 stupňů Bx. Šťáva byla ochlazena na pokojovou teplotu pro pozdější použití.
1.3.4 Fermentační proces Cistanche Musalais
Steamed Cistanche byl přidán v definovaných poměrech (3 %, 5 %, 7 %) do 600 ml koncentrované hroznové šťávy ve fermentoru. Zbytkový cukr byl měřen každých 24 hodin během fermentace, aby se sledoval průběh. Když zbytkový cukr klesl na 4 g/l, fermentace byla ukončena. Supernatant se shromáždil a pasterizoval při 85 stupních po dobu 30 minut, aby se získal Cistanche Musalais.
1.3.5 Jednofaktorový experimentální design pro Cistanche Musalais
Byly zkoumány účinky přidání Cistanche (3 %, 5 %, 7 %), počátečního obsahu cukru (26, 29, 32 stupňů Bx) a teploty fermentace (22, 25, 28 stupňů) na fyzikálně-chemické vlastnosti a bioaktivitu.
1.3.6 Analýzy a měření
Obsah alkoholu, rozpustné sušiny a celková kyselost: stanoveny podle GB/T 15038-2006 "Obecné analytické metody pro víno a ovocná vína."
Celkové flavonoidy: stanoveno s odkazem na Xu et al. [7]. Byla připravena kalibrační křivka s koncentrací rutinu (X) na vodorovné ose a absorbancí (Y) při 510 nm na svislé ose, což dalo Y=0.8043X − 0,0278, R2=0.9999, což ukazuje na dobrou linearitu.
Celkové polyfenoly: stanoveny metodou Folin–Ciocalteu [8]. Byla připravena kalibrační křivka s obsahem kyseliny gallové (X) na vodorovné ose a absorbancí (Y) při 760 nm na svislé ose, což dalo Y=0.4177X + 0.1048, R2=0.9975, což ukazuje na dobrou linearitu.
1.3.7 GC–MS analýza
Vzorky ze dvou skupin - experimentální (32 stupňů Bx, 25 stupňů, 7 % Cistanche) a kontrolní bez Cistanche - byly podrobeny GC–MS.
Předúprava vzorku: Vzorek byl umístěn do 20ml extrakční lahvičky; Jako vnitřní standard bylo přidáno 100 ul 50 ug/ml isoamylfenylacetátu. Lahvička byla uzavřena a ekvilibrována v 60stupňové vodní lázni s magnetickým mícháním při 250 ot./min po dobu 20 minut. Vlákno SPME bylo poté vloženo na 30 minut extrakce. Před použitím bylo vlákno SPME kondicionováno na vstupu GC při 250 stupních po dobu 20 minut.
Podmínky GC–MS: kolona HP-INNOWax (60 m × 250 μm × 0,25 μm); vstup 250 stupňů; přenosová linka 250 stupňů; průtok nosného plynu 1,5 ml/min; rozdělení 4:1. Program trouby: 40 stupňů (5 min), náběh 5 stupňů/min až 250 stupňů, držení 10 min. Iontový zdroj 230 stupňů; kvadrupól 150 stupňů ; EI 70 eV; plné skenování 35–550 Da.
1.3.8 Necílená metabolomika
1.3.8.1 Příprava vzorku
Byly testovány dvě skupiny: experimentální (32 stupňů Bx, 25 stupňů, 7 % Cistanche) a kontrolní bez Cistanche; n=3 biologických replikací na skupinu, celkem 6 vzorků. Po rozmrazení a vortexování bylo 300 μl každého vzorku přeneseno do 1,5 ml zkumavky a centrifugováno při 12 000 ot./min., 4 stupně po dobu 15 minut. Poté bylo 100 ul supernatantu přemístěno do zkumavky o objemu 2 ml, rychle zmraženo v kapalném dusíku a lyofilizováno. Přidá se 1 ml předem vychlazeného methanolu:acetonitrilu (1:1, obj./obj.), vortexuje se 30 s; zmrazit na -20 stupňů po dobu 30 minut; centrifugujte při 12 000 ot./min, 4 stupně po dobu 10 minut; odeberte 850 μl supernatantu a osušte ve vakuu až do úplného dokončení; rekonstituujte ve 150 μl 50% methanolu (s 5 ppm 2-chlorfenylalaninu), vortexujte 30 s; centrifuga 12 000 ot./min, 4 stupně po dobu 10 min; filtrovat přes 0,22 μm membránu a přenést filtrát do lahviček. Zkombinujte 10–20 μl z každého vzorku a vytvořte vzorek kontroly kvality pro vyhodnocení stability přístroje a spolehlivosti dat; Kontrola kvality je vynechána, pokud je zahrnuto méně než 5 vzorků.
1.3.8.2 Analytické podmínky
Chromatografie: kolona ACQUITY UPLC HSS T3 (100 Á, 1,8 um, 2,1 mm x 100 mm); průtok 0,4 ml/min; sloupec 40 stupňů; autosampler 8 stupňů ; injekce 2 μl. Mobilní fáze A: voda s 0,1 % (v/v) kyseliny mravenčí; mobilní fáze B: acetonitril s 0,1% (v/v) kyselinou mravenčí.
Hmotnostní spektrometrie: rozprašovací napětí +3.5 kV/-3,0 kV; plášťový plyn 40 arb; pomocný plyn 10 arb; kapilára 320 stupňů; teplota pomocného plynu 300 stupňů; rozlišení MS1 60 000; rozsah skenování m/z 70–1 000; AGC cílový standard; Max IT 100 ms; data-dependentní MS/MS na horních 4 iontech s dynamickým vyloučením 4 s; rozlišení MS2 15 000; Energie srážky HCD 30 %.
1.3.8.3 Identifikace metabolitů
Identifikace metabolitů byla založena na databázi PSNGM (PerSonalbio Next-Generation Metabolomics Database), která obsahuje interní knihovnu standardů, mzCloud (https://www.mzcloud.org/), LIPID MAPS (https://www.lipidmaps.org/), HMDB (https://hmdb.ca/), MoNA (https://mona.fievisedMS/IST) a AI-predikovanou MS/MS spektrální knihovnu.
Poznámka k externím databázím použitým v anotaci:
HMDB: Komplexní databáze lidských metabolomů (verze 5.0) obsahující podrobné chemické, klinické a biochemické informace pro 220 945 metabolitů s rozsáhlými křížovými odkazy na KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, UniProt a GenBank a podporující pokročilé vyhledávání textu/sekvencí/spektr a MS/NMR. Také spojeno s DrugBank, T3DB, SMPDB a FooDB.
LIPID MAPS: An open-access lipidomics resource providing databases (e.g., LMSD with >50 000 upravených lipidových struktur), spektra, cesty, nástroje pro analýzu MS, kreslení struktury a zdroje nomenklatury/klasifikace.
mzCloud: Pokročilá knihovna hmotnostních spekter podporující vyhledávání spektra, struktury, substruktury, stromu a m/z s 32 330 sloučeninami, 51 002 spektrálními stromy a 16 531 567 spektry (s významnými přírůstky v roce 2024), optimalizovaná pro desktopový přístup Firefox/Chrome.
1.3.8.4 Vícerozměrná statistická analýza
Multivariační analýzy byly aplikovány na data metabolitů ze 6 vzorků pro provedení PCA, objasňující metabolické rozdíly mezi Cistanche Musalais a Musalais. Diferenciální metabolity napříč skupinami byly skrínovány pomocí OPLS-DA proměnné důležitosti v projekci (VIP), násobku změny a hodnot P (prahová hodnota VIP a významnost, jak je uvedeno výše), s následnou biologickou interpretací včetně obohacení KEGG dráhy [9].
Reference
[1] Zhu LX, Wang LL, Song HZ a kol. Kvalitativní analýza hlavních aromatických sloučenin spojených s tradičním zpracováním Musalais v Xinjiang v Číně. Journal of the Institute of Brewing. 2012;118(2):236–242.
[2] Zhao B, Li DD, Yuan Y, a kol. Pokrok moderního výzkumu fermentovaného funkčního likéru. Výroba lihovin. 2025;52(2):43–49.
[3] Zhu LX, Hou XJ, Xu Q. Diskuse o strategiích rozvoje hroznového vína Xinjiang Msalais. Liquor-Making Science & Technology. 2008(7):111–113.
[4] Píseň ZH, Lei L, Tu PF. Pokroky ve výzkumu farmakologické aktivity v rostlinách Cistanche Hoffing. et Link. Tradiční čínské a bylinné drogy. 2003;34(9):U018.
[5] Shi TT, Ge WH. Vývoj výzkumu Cistanche Hoffmg. Et Link. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy. 2009;18(9):7–9.
[6] Gong X, Zhong T, Zhou JY a kol. Studie o technologii nového fermentovaného vína Cistanche. Moderní jídlo. 2019(5):64–68;79.
[7] Xu HT, Li H, Zhao YZ a kol. Antioxidační a antibakteriální aktivity celkových flavonoidů z Nervilia fordii. Severní zahradnictví. 2017(16):161–165.
[8] Yu H, Xu X, Hao JX a kol. Smíšená fermentace výlisků citrusové kůry s Trichoderma koningii, Aspergillus oryzae a Lactobacillus casei: optimalizace procesu, antioxidační aktivity a necílená metabolomická analýza. Food Bioscience. 2025;66:106180.
[9] Zhou JN, Hou DH, Zou WQ a kol. Srovnání široce cílené metabolomiky a necílené metabolomiky divokého Ophiocordyceps sinensis. Molekuly. 2022;27(11):3645.
[10] Li XH. Výzkum technologie Rosa kwangsiensis var. sterilis fermentované víno [diplomová práce]. Chongqing: Jihozápadní univerzita; 2017.
[11] Li ZJ, Zhang XD, Long BX a kol. Výzkum vývoje produktu a optimalizace povrchu odezvy hrušky Msalais. Zpracování zemědělských produktů. 2025;3:1–10.
[12] Zhang L, Jiang XF. Ověření adaptability metody stanovení mědi v GB/T15038-2006 obecné analytické metodě vína a ovocného vína. Výroba lihovin. 2020;47(5):104–107.
[13] Zhong DL, Yang H, Wang Z a kol. Vliv teploty jablečno-mléčné fermentace na kvalitu vína Cabernet Sauvignon. Zhejiang Agricultural Sciences. 2025;66(7):1724–1732.
