Glykosidy Cistanche zmírňují prostatickou fibrózu u benigní hyperplazie prostaty regulací MiRNA-483-3p

 

ABSTRAKTNÍ

Objektivní:Zkoumat zlepšující účinky cistanche glykosidů na prostatickou fibrózu u benigní hyperplazie prostaty (BPH) a mechanismus zahrnující regulaci microRNA (miRNA)-483-3p.

Metody:Samci myší byli náhodně rozděleni do pěti skupin: normální kontrola, kontrola modelu BPH, finasterid, glykosidy cistanche a glykosidy cistanche + antagonista miRNA-483-3p. Model BPH byl založen bilaterální orchiektomií následovanou denní subkutánní injekcí testosteron propionátu. Po 30 dnech byla vyhodnocena prostatická depozice kolagenu Massonovým trichromem a barvením Sirius Red a byl měřen obsah hydroxyprolinu (Hyp). Hladiny prostatické mRNA transformujícího růstového faktoru‑1 (TGF‑1), mitogenem aktivované proteinkinázy 2 (MK2) a mitogenem aktivované proteinkinázy 6 (MKK6) a také hladiny miRNA‑483‑3p byly stanoveny pomocí kvantitativní real-time PCR (qPCR). Hladiny prostatického proteinu TGF‑1, MK2, fosforylovaného MK2 (p‑MK2), MKK6 a fosforylovaného MKK6 (p‑MKK6) byly hodnoceny metodou Western blotting. Přímá vazba miRNA-483-3p na MK2 byla zkoumána pomocí luciferázového reportérového testu.

Výsledky:Ve srovnání s normální kontrolní skupinou vykazovala kontrolní skupina modelu BPH významně zvýšené ukládání kolagenu v prostatě; zvýšené hladiny mRNA TGF‑ 1, MK2 a MKK6; a vyšší hladiny proteinů TGF‑ 1, p‑MK2 a p‑MKK6 (všechny P < 0,01), zatímco hladiny miRNA‑483‑3p byly významně sníženy (P < 0,01). Ve srovnání s kontrolní skupinou modelu BPH glykosidy cistanche upregulovaly miRNA-483-3p, snižovaly hladiny mRNA TGF-1, MK2 a MKK6, snižovaly hladiny proteinů TGF-1, p-MK2 a p-MKK6 a zmírňovaly ukládání kolagenu v prostatě. Současné podávání antagomiru miRNA‑483‑3p s glykosidy cistanche významně snížilo miRNA‑483‑3p, zvýšilo ukládání kolagenu a zvýšilo hladiny mRNA TGF‑ 1, MK2 a MKK6 a také hladiny proteinů TGF‑ 1, p‑MK2 a PcistanK6 samostatně (ve srovnání se samotným p‑cistanK6). Luciferázový test prokázal, že miRNA-483-3p přímo cílí na MK2.

Závěr: Glykosidy Cistanche zmírňují prostatickou fibrózu u BPH regulací miRNA‑483‑3p a inhibicí signalizace MK2.

Klíčová slova: Cistanche glykosidy; miRNA-483-3p; prostaty;fibróza; benigní hyperplazie prostaty

 

 

 

Špičková Cistanche Deserticola

Více informací o bylince pro léčbu BPH

 

Podpůrná služba Wecistanche-Největší vývozce cistanche v Číně:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
 

 

Zavedení

Benigní hyperplazie prostaty (BPH)je běžným stavem u mužů středního a staršího věku, přičemž prevalence se zvyšuje s věkem. Zprávy naznačují, že prevalence BPH přesahuje 50 % u mužů starších 50 let. BPH a související symptomy dolních močových cest (LUTS) značně zatěžují kvalitu života a dlouhodobé náklady na zdravotní péči. Klinicky se jako farmakoterapie doporučují 5 -inhibitory reduktázy a blokátory ‑adrenergních receptorů. Blokátory však nesnižují objem prostaty a 25–30 % pacientů nevykazuje žádné zlepšení LUTS s inhibitory 5 -reduktázy; navíc 5–7 % se může dokonce zhoršit. Přestože chirurgické inovace, jako je prostatektomie thuliovým laserem, jsou ve srovnání s transuretrální resekcí prostaty stále více využívány, pooperační LUTS se stále vyskytují v míře přesahující 23 %.

Současné důkazy naznačují tři hlavní patobiologické procesy u BPH: glandulární hyperplazie, kontrakce hladkého svalstva a prostatická fibróza. Tyto procesy působí nezávisle nebo synergicky a řídí klinickou progresi. BPH běžně (i když ne vždy) koexistuje s LUTS; fibróza, charakterizovaná nadměrným ukládáním extracelulární matrix, narušuje flexibilitu uretry v prostatě a přispívá k obstrukci moči. Terapeutické možnosti specificky zaměřené na orgánovou fibrózu však zůstávají omezené.

Cistanche (Cistanche spp.) je tradiční léčivá a výživná rostlina. Jeho charakteristické fenylethanoidní glykosidy (zde souhrnně označované jako cistanche glykosidy, jako je echinakosid a akteosid) vykazují široké biologické aktivity, včetně antimikrobiálních, hypolipidemických, antialergických, kardiotonických, antidiabetických, protinádorových, neuroprotektivních, antioxidačních a imunomodulačních účinků. Hromadné důkazy naznačují antifibrotické účinky těchto glykosidů v orgánech, jako jsou ledviny, plíce, srdce a játra. Jejich účinky na prostatickou fibrózu však nebyly popsány. Tato studie zkoumala vliv cistanche glykosidů na prostatickou fibrózu a zkoumala základní mechanismy se zaměřením na osu miRNA-483-3p/MK2 relevantní pro remodelaci extracelulární matrix.

Špičková Cistanche Deserticola

 

Materiály a metody

Materiály

 

miRNA-483-3p antagomir (chemicky modifikovaný): zakoupen od Shanghai GenePharma Co., Ltd. (číslo šarže: 12953).

Injekce testosteronu propionátu: Tianjin Jinyao Pharmaceutical Co., Ltd. (číslo šarže: 150822).

Cistanche glykosidy: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (čistota větší nebo rovna 98 %, šarže č.: M14062). Poznámka pro nutraceutické vývojky: materiál odpovídá standardizované frakci fenylethanoidových glykosidů; zajistit specifikaci pomocí obsahu HPLC (např. celkové PEGL, echinakosid/akteosid).

Tablety finasteridu: MSD (Hangzhou) Pharmaceutical Co., Ltd. (číslo šarže: U011856; 5 mg/tableta).

Luciferázová reportérová testovací souprava (č. šarže: E2920) a vektor psiCHECK‑2 (číslo šarže: C8021): Promega (USA).

Detekční souprava qPCR: KAPA Biosystems (číslo šarže: KM4101).

Hydroxyprolinová (Hyp) testovací souprava: Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (číslo šarže: 20190626).

Primery pro TGF‑1, MK2 a MKK6 byly syntetizovány společností Wuhan Tianyi Huiyuan Biotechnology Co., Ltd.

Špičková Cistanche Deserticola

 

Zvířata

Sedmitýdenní samci myší C57BL/6 (22–24 g) bez specifických patogenů (SPF) byli získáni z Huazhong Agricultural University (č. výrobní licence: SCXK Hubei 2015-0019). Zvířata byla chována při 23 ± 2 stupních, 50 ± 5% vlhkosti, v cyklu 12 h světlo/12 h tma.

 

Zařízení

 

Systém PCR v reálném čase StepOnePlus (Applied Biosystems, USA).

Luminoskan 5200110 mikrodestičkový luminometr (Thermo Fisher Scientific, USA).

Experimentální design a BPH model
Po 1 týdnu aklimatizace byly myši náhodně rozděleny (tabulka náhodných čísel) do pěti skupin (n=6 na skupinu): normální kontrola, kontrola modelu BPH, finasterid, glykosidy cistanche a glykosidy cistanche + miRNA-483-3p antagomir. Model BPH byl indukován chirurgickou kastrací plus denní subkutánní injekcí testosteron propionátu v dávce 7,5 mg.kg-1 po dobu 30 dnů. Skupina s finasteridem dostávala perorálně finasterid 1 mg·kg⁻¹ denně (rozpuštěný v 0,5% CMC-Na). Skupina cistanche glykosidů dostávala perorálně cistanche glykosidy 100 mg·kg⁻¹ denně. Kombinovaná skupina dostávala perorálně cistanche glykosidy 100 mg·kg⁻¹ denně plus injekci miRNA-483-3p antagomir do ocasní žíly v dávce 10 mg·kg⁻¹ každých 5 dní podle pokynů výrobce. Kontrolní skupiny s normálním modelem a modelem BPH dostaly orálně stejný objem 0,5 % CMC-Na.

Po 30 dnech byly myši anestetizovány intraperitoneální injekcí pentobarbitalu sodného (80 mg.kg-1) a usmrceny cervikální dislokací. Prostaty byly vyříznuty; části byly fixovány a zapuštěny pro barvení Massonovým trichromem a Sirius Red a čerstvé tkáně byly zpracovány pro qPCR, Western blot a biochemické testy. Postupy se zvířaty byly v souladu s nařízeními provincie Hubei o hospodaření s laboratorními zvířaty (číslo kvalifikace provozovatele: TY20190784).

Špičková Cistanche Deserticola

 

Vyšetření prostatické fibrózy

Depozice kolagenu byla hodnocena barvením Sirius Red a Massonovým trichromem. Obsah Hyp ve tkáni prostaty byl kvantifikován podle instrukcí sady. Pro každé sklíčko byla pomocí Image‑Pro Plus 6.0 analyzována tři náhodná pole, aby se vypočítalo procento pozitivně obarvené oblasti.

Hodnocení aktivity MK2 Pathway

qPCR: Byly měřeny hladiny prostatické mRNA MK2, TGF‑ 1 a MKK6. Sekvence primerů:

MK2 (264 bp) dopředný 5'-GGAAGTGCCTGCTGAT-3', zpětný 5'-AGTTGTGACTGGTGGTTT-3';

TGF‑ 1 (153 bp) vpřed 5'-AGGAGACGGAATACAGGG-3', vzad 5'-ATGAGGAGCAGGAAGGG-3';

MKK6 (146 bp) dopředný 5'-CCTCAGACCAGTTCCAC-3', zpětný 5'-CGCATCTTCTCCACCA-3'.

Western blot: Hladiny proteinů TGF‑1, MK2, p‑MK2, MKK6 a p‑MKK6 byly stanoveny podle dříve zavedených protokolů.

Měření miRNA-483-3p
miRNA‑483‑3p primery: dopředný 5'-GGGTCACTCCTCCCCT-3', reverzní 5'-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3'; RT primer 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAGACGGG-3'. qPCR byla provedena podle pokynů k soupravě.

 

Luciferase Reporter Assay

MK2 3'UTR byl klonován do vektoru psiCHECK‑2, aby se zkonstruovaly reportérové ​​plazmidy divokého typu (WT) a mutantní (MUT). Buňky HEK‑293T byly kotransfekovány miRNA‑483‑3p a reportérovými plazmidy pomocí Lipofectamine 3000; kontrolní buňky přijaly prázdný vektor. Po 24 hodinách byla měřena aktivita luciferázy podle protokolu kitu.

Statistická analýza
Data byla analyzována pomocí SPSS 17.0. Jednocestná ANOVA byla aplikována po potvrzení normality a homogenity rozptylu. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± SD. LSD post hoc testy byly použity pro vícenásobná srovnání. Rozdíly byly považovány za statisticky významné při P < 0,05.

 

Výsledky

Ve srovnání s normální kontrolní skupinou vykazovala kontrolní skupina modelu BPH výrazné zvýšení ukládání kolagenu v prostatě; zvýšené mRNA exprese TGF‑ 1, MK2 a MKK6; a vyšší hladiny proteinů TGF‑ 1, p‑MK2 a p‑MKK6 (všechny P < 0,01). Hladiny miRNA‑483‑3p byly významně sníženy (P < 0,01).

Ve srovnání s kontrolou modelu BPH glykosidy cistanche významně upregulovaly miRNA-483-3p, snížily hladiny mRNA TGF-1, MK2 a MKK6, snížily hladiny proteinů TGF-1, p-MK2 a p-MKK6 a zmírnily ukládání kolagenu v prostatě.

Ve srovnání se samotnými cistanche glykosidy, kombinace cistanche glykosidů s miRNA-483-3p antagomir významně snížila miRNA-483-3p a zvýšila ukládání kolagenu, plus hladiny mRNA TGF-1, MK2 a MKK6, stejně jako hladiny proteinů TGF-1, p1-MK2, p1-MK2, p1-MK2.

Luciferázový reportérový test potvrdil, že miRNA-483-3p přímo cílí na MK2.

 

Diskuse (krátká, zaměřená na nutraceutika)

Tato studie ukazuje, že glykosidy cistanche zeslabují prostatickou fibrózu v modelu BPH vyvolané kastrací/testosteronem tím, že upregulují miRNA-483-3p a potlačují aktivitu dráhy MK2 downstream od signalizace TGF-. Vzhledem k omezením současných farmakoterapií BPH při řešení fibrotické remodelace mohou cistanche glykosidy představovat doplňkovou nutraceutickou strategii zaměřenou na rovnováhu extracelulární matrix.

Při vývoji doplňků stravy je třeba vzít v úvahu:

Standardizace: definujte celkové fenylethanoidní glykosidy a markerové sloučeniny (např. echinakosid větší nebo rovný 20 %, akteosid větší nebo rovný 10 % pomocí HPLC).

Převod dávky: 100 mg·kg⁻¹ u myší odpovídá přibližně 8–12 mg·kg⁻¹ ekvivalentní dávce u člověka (HED) s použitím škálování plochy povrchu těla, zhruba 500–800 mg/den pro dospělého jedince s hmotností 60–70 kg; je nutná klinická validace.

Kvalita a bezpečnost: zajistit identitu (botanický zdroj, kontaminanty, těžké kovy, pesticidy) a posoudit potenciální interakce s blokátory nebo inhibitory 5-reduktázy.

Tvrzení: Tvrzení o struktuře/funkci by se měla zaměřit na „podporu průtoku moči a rovnováhy tkáně prostaty“ a vyhnout se mluvě o léčbě nemoci bez klinických důkazů.

 

Závěry

Cystanche glykosidyzmírňují prostatickou fibrózu u BPH regulací miRNA-483-3p a inhibicí signalizace MK2. Tato zjištění podporují další translační výzkum standardizovaných extraktů cistanche jako doplňkových nutraceutik pro zdraví prostaty.

 

Poděkování

Tuto práci podpořila Čínská národní přírodní vědecká nadace (č. grantu. 81703594).

Informace o autorovi
Yang Chuhao (1991-), žena, Wuhan, Hubei, klinický farmaceut, MS; hlavní výzkumná oblast: klinická farmacie. ORCID: 0000-0002-8921-5758; Tel: +86-27-82440854.