Abstraktní

Předkládaný vynález popisuje aExtrakt z cistanche pro zlepšení minerální hustoty kostí (BMD). V extraktu jecelkový obsah echinakosidu a akteosidu (verbaskosidu)je>25 hm. %. Extrakt se připravuje provedenímextrakce destilovanou vodouzsurový prášek zCistanche tubulosa, následujefiltrace, odstřeďovánífiltrátu,koncentrace, extrakce kapalina-kapalina, koncentrace s odstraněním nečistot, ředění, doléčenía pakkonečná koncentrace a sušeník získání extraktu Cistanche.

 

 

Proces extrakce Cistanche

V extraktu Cistanche pro zlepšení minerální hustoty kostí podle vynálezu jecelkový obsah echinakosidu a akteosiduje25–30 % hmotn.(kromě 25 % hmotn.) a extrakt je také bohatý nakyselina šikimovástejně jakosložky typu kyseliny fenylpropionovéasložky alkaloidního typu, který to umožňujestabilně vykazují účinek zlepšující hustotu kostí.

 

Nároky

1. Způsob přípravy

1. Způsob přípravy extraktu Cistanche pro zlepšení minerální hustoty kostí, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

zdrcujícíCistanche tubulosazískat surový prášekCistanche tubulosa;

přidáním destilované vody k surovému práškuCistanche tubulosapro extrakci, filtraci, odstředění filtrátu a zahuštění za získání koncentrovaného roztokuCistanche tubulosa;

extrakcí koncentrovaného roztokuCistanche tubulosazakoncentrování spodní extrakční fáze pro odstranění nečistot a zředění pro získání nanášecího roztoku;

následné zpracování nanášecího roztoku, následované zahuštěním a sušením, aby se získal extrakt Cistanche.

2. Poměr materiálu k vodě

2. Způsob podle nároku 1, kde poměr hmotnosti k objemu surového práškuCistanche tubulosado destilované vody je1 : (15–25).

3. Teplota extrakce

2. Způsob podle nároku 1, kde teplota extrakce destilovanou vodou je60-100 stupňů.

4. Poměr během extrakce kapalina–kapalina

2. Způsob podle nároku 1, kde během extrakce koncentrovaného roztoku je objemový poměr koncentrovaného roztokuCistanche tubulosado extrakčního rozpouštědla je1 : (1–5).

5. Extrakční rozpouštědlo

5. Způsob podle nároku 4, kde extrakční rozpouštědlo obsahuje alespoň jeden zpetrolether, ethylacetát, n-hexan nebo cyklohexan.

6. Proces po ošetření

2. Způsob podle nároku 1, kde následná úprava plnicího roztoku zahrnuje: průchod plnicího roztoku skrz amakroporézní pryskyřicea poté se postupně eluuje sdestilovaná vodaaethanolový roztok.

7. Eluční objemy

7. Způsob podle nároku 6, kde objemový poměr destilované vody k makroporézní pryskyřici je(5–10) : 1a objemový poměr ethanolového roztoku k makroporézní pryskyřici je(3–9) : 1.

8. Výpis

8. Extrakt z cistanche pro zlepšení minerální hustoty kostí, vyznačující se tím, že je připraven podle kteréhokoli z nároků 1–7.

9. Obsah aktivních značek

9. Extrakt z Cistanche podle nároku 8, kde celkový obsah echinakosidu a akteosidu je25–30 % hmotn., kromě 25 % hm..

10. Aplikace

10. Použití extraktu z cistanche podle kteréhokoli z nároků 8–9 při přípravě produktu pro zlepšení minerální hustoty kostí, přičemž koncentrace extraktu z cistanche v produktu je12,5–25 ug/ml.

 

Technický obor

Oblast techniky [0001] Předkládaný vynález se týká oblastilékařské formulacea konkrétně se týká aExtrakt z cistanche pro zlepšení minerální hustoty kostí, jehozpůsob přípravyaaplikací.

Pozadí

[0002] Cistanche se vztahuje na sušený dužnatý stonek se šupinovitými listy rostlin OrobanchaceaeCistanche deserticola YC ManeboCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Cistanche má více aktivit, jako napřimunitní regulace, protizánětlivé, proti únavě, antioxidant, neuroprotektivníapodpora reprodukčního systému.

Fenylethanoidní glykosidy (PhGs)-sechinakosidaakteosid (verbaskosid)jsou hlavní PhGs v Cistanche – jsou důležitými složkami.Echinakosidbylo prokázáno, že má vliv nazlepšení minerální hustoty kostí. Zjistili jsme však, že účinek extraktů z Cistanche na zlepšení hustoty kostí anonejen koreluje s obsahem echinakosidu. Jednoduchá kontrola obsahu echinacosidunemůže zajistitže extrakt budestabilněprojevují účinek na zlepšení hustoty kostí. Proto je klíčové vyvinout extrakt z Cistanche a způsob přípravy, který to dokážestabilněposkytují požadovaný účinek podporující hustotu kostí.

[0003] Čínská patentová přihláška na vynálezCN102441040Apopisuje způsob přípravy celkových fenylethanoidových glykosidů z Cistanche pulverizací, extrakcí, adsorpcí na makroporézní pryskyřici, elucí, koncentrací atd. Za slabě kyselých podmínek (pH 2–4) se stabilita fenylethanoidových glykosidů Cistanche výrazně zlepšuje a výsledné celkové glykosidy obsahují >90% podíl echinakosidu a účinku. Neověřuje však, zda výrobek umístabilnězlepšit minerální hustotu kostí.

Čínská patentová přihláška na vynálezCN105111255Apopisuje způsob extrakce a separace echinakosidu a akteosidu z Cistanche za použití 75% ethanolu jako extrakčního rozpouštědla, AB-8 makroporézní pryskyřice jako výplňového materiálu a 55% ethanolové eluce, čímž se získá extrakt Cistanche s echinakosidem > 25 %, akteosidem > 10 % a celkovým PhGs > 80 %. Stále však nemusí zaručit astabilníúčinek zlepšující hustotu kostí.

 

Shrnutí vynálezu

[0004] Vyvinout extrakt z Cistanche a způsob přípravy, který můžestabilněpodporují zlepšenou minerální hustotu kostí, vynález poskytuje:

První aspekt: ​​Způsob přípravy

1. Způsob přípravy extraktu Cistanche pro zlepšení minerální hustoty kostí, zahrnující:

zdrcujícíCistanche tubulosazískat surový prášek;

extrakci surového prášku destilovanou vodou, filtraci, odstředění a koncentraci za získání koncentrovaného roztoku;

provádění extrakce; koncentrování spodní fáze pro odstranění nečistot; ředění za účelem získání plnicího roztoku;

následné zpracování nakládacího roztoku, zahuštění a sušení za účelem získání extraktu Cistanche.

[0005] V jednom provedení se surový prášek nechá projít a40-oksíto.

[0006] V jednom provedení je poměr hmotnosti k objemu surového prášku k destilované vodě1 : (15–25).

[0007] V jednom provedení je poměr hmoty k objemu1 : 20.

[0008] V jednom provedení je teplota extrakce60-100 stupňů.

[0009] V jednom provedení je teplota extrakce80 stupňů.

[0010] V jednom provedení se provádí extrakce1–2krát, pokaždé 1 hodinu.

[0011] V jednom provedení se filtrace provádí přes an80-okfiltr.

[0012] V jednom provedení je rychlost odstřeďování3000–4000 ot./mina čas je3–9 min.

[0013] V jednom provedení je rychlost odstřeďování3500 ot./mina čas je5 min.

[0014] V jednom provedení se po odstředění filtrát koncentruje při teplotě místnosti70 stupňůna18%–28%počátečního objemu.

[0015] V jednom provedení je během extrakce koncentrovaného roztoku objemový poměr koncentrovaného roztoku k extrakčnímu rozpouštědlu1 : (1–5).

[0016] V jednom provedení je poměr1 : 3.

V jednom provedení extrakční rozpouštědlo obsahuje alespoň jeden zpetrolether, ethylacetát, n-hexan nebo cyklohexan.

[0018] V jednom provedení se extrakce provádí postupně s použitímpetrolethernásledujeethylacetát.

[0019] V jednom provedení "koncentrace s odstraněním nečistot" znamená koncentraci spodní extrakční fáze na pastu, která se rozpustí v300 ml 50% hmotn. vodného ethanoluk odstranění nečistot a přizpůsobení1,0–1,5 g surové byliny na mljako nakládací řešení.

[0020] V jednom provedení je koncentrace nanášecího roztoku1,0–1,5 g surové byliny/ml vody.

[0021] V jednom provedení následná úprava zahrnuje průchod plnicího roztoku skrzmakroporézní pryskyřicea poté se postupně eluuje sdestilovaná vodaaethanolový roztok.

[0022] V jednom provedení je průtoková rychlost plnění makroporézní pryskyřicí1–5 ml/min.

[0023] V jednom provedení je pryskyřiceAB-8 makroporézní pryskyřices objemem pryskyřice0.93 L.

[0024] V jednom provedení je objemový poměr destilované vody k pryskyřici(5–10) : 1a objemový poměr ethanolového roztoku k pryskyřici je(3–9) : 1.

[0025] V jednom provedení je objemový poměr destilované vody k pryskyřici7 : 1a poměr ethanolového roztoku k pryskyřici je6 : 1.

[0026] V jednom provedení je ethanolový roztok80% (hmotn./hmotn.) vodný ethanol.

Druhý aspekt: ​​Extrakt

Vynález dále poskytuje extrakt Cistanche připravený výše uvedeným způsobem.

V jednom provedení je celkový obsah echinakosidu a akteosidu25–30 % hmotn.s výjimkou 25 % hmotn.

Třetí aspekt: ​​Použití

Vynález dále poskytuje použití extraktu Cistanche při přípravě produktů pro zlepšení minerální hustoty kostí, kde koncentrace extraktu v produktu je12,5–25 ug/ml.

 

Výhody / Prospěšné účinky

Ve srovnání s dosavadním stavem techniky má vynález následující příznivé účinky:

Extrakt Cistanche obsahuje25–30 % hmotn.celkový echinakosid a akteosid a je bohatý nakyselina šikimová, složky typu kyseliny fenylpropionové, alkaloidyamastné kyseliny, který to umožňujestabilněpodporuje zlepšení minerální hustoty kostí.

V rámci12,5–25 ug/mlkoncentrační rozsah, extrakt podporuje proliferaciMC3T3-E1buňky s vynikajícími proliferačními účinky.

Extrakt vykazuje stejný trend související s dávkou v podpoře buněčné proliferace aAktivita ALPa může stabilně podporovat proliferaci a diferenciaci. Při podpoře mineralizace osteoblastů vykazuje lepší účinek než pozitivní kontrola17 -estradiol.

Extrakt stimuluje transkripční faktory specifické pro osteoblastyRunx2aOsxzvyšuje diferenciaci osteoblastů a podporuje expresi osteogenních markerůOPNaOCNa tím podporuje tvorbu kostí. Také se zvyšujeBmp2 mRNAexprese ke zvýšení diferenciace osteoblastů a novotvorby kosti aktivacíBMP/Smad cesta; dále regulacíLrp5 mRNA, Lrp6 mRNAaWnt3 mRNA, aktivuje seWnt/ -catenin signalizaceovlivňuje downstream expresi transkripčního faktoru a podporuje diferenciaci osteoblastů a tvorbu kostí.

Způsob přípravy poskytuje extrakt obsahující fenylethanoidové glykosidy (echinakosid a akteosid), kyselinu šikimovou a kyseliny fenylpropionové, alkaloidy a mastné kyseliny. Tyto složky společně umožňují extraktu vykazovat konzistentní závislost na dávce v proliferaci, diferenciaci a mineralizaci, což umožňuje stabilní účinky podporující hustotu kostí.

 

Stručný popis výkresů

[0035] Obr. 1: Účinek extraktu (příklad 1) na proliferaci buněk MC3T3-E1
Obr. 2: Účinek extraktu (příklad 2) na proliferaci buněk MC3T3-E1
Obr. 3: Účinek extraktu (příklad 3) na proliferaci buněk MC3T3-E1
Obr. 4: Účinek extraktu (příklad 1) na aktivitu ALP
Obr. 5: Účinek extraktu (příklad 2) na aktivitu ALP
Obr. 6: Účinek extraktu (příklad 3) na aktivitu ALP
Obr. 7: Fotografie barvení alizarinovou červení mineralizace osteoblastů (Příklad 2)
Obr. 8: Kvantitativní výsledky mineralizace osteoblastů (Příklad 2)
Obr. 9–12: Účinky příkladu 2 na expresi mRNA Runx2, Osx, Opn, Ocn
Obr. 13: Účinek příkladu 2 na expresi mRNA Bmp2 (BMP/Smad)
Obr. 14–16: Účinky příkladu 2 na expresi mRNA Lrp5, Wnt3, Lrp6 (Wnt/-catenin)
Obr. 17–18: Účinky příkladu 2 na expresi proteinů Osx a RUNX2

 

Podrobný popis / Provedení

Příklad 1

[0036] Způsob přípravy zahrnuje:

zdrcujícíCistanche tubulosa40 mesh sítem200 gsurový prášek;

extrakce sdestilovaná voda o hmotnosti 5×(jak je popsáno), extrahování at75 stupňůpro2krát, 1 h každý, soustředění na70 stupňůna poměr koncentrace1 : 2.2pro získání koncentrovaného roztoku;

přidání absolutního ethanolu do koncentrovaného roztoku pro stupňované ethanolové vysrážení s konečnými hmotnostními koncentracemi ethanolu20%, 40%, 60%, 80%, srážející se při5 stupňů po dobu 24 hodina poté se shromáždil supernatant80 hm. %srážení ethanolem;

koncentrování a sušení při70 stupňůk získání extraktu Cistanche s výtěžkem20.75%.

Příklad 2

[0037] Způsob přípravy zahrnuje:

zdrcujícíCistanche tubulosazískat240 gsurový prášek;

extrakci destilovanou vodou, filtraci, odstředění a zahuštění za získání koncentrovaného roztoku;

extrakci koncentrovaného roztoku; koncentrování spodní fáze pro odstranění nečistot; ředění za účelem získání plnicího roztoku;

dodatečná úprava nakládacího roztoku; koncentrování a sušení při70 stupňůzískat extrakt, s výtěžkem19.69%.

Surový prášek prochází sítem 40 mesh.
Poměr hmotnosti k objemu surového prášku k destilované vodě je1 : 20.
Teplota extrakce je80 stupňů.
Provede se extrakce1–2krát, 1 h každý.
Filtrace se provádí přes an80-okfiltr.
Centrifugace je3500 ot./min po dobu 5 min.
Zahuštění po odstředění: zahuštění při teplotě místnosti70 stupňůna20%počátečního objemu.
Během extrakce je objemový poměr koncentrovaného roztoku k rozpouštědlu1 : 3.
[0046] Extrakce se provádí postupně spetroletheraethylacetát.
Spodní fáze se zahustí na pastu a rozpustí se300 ml 50% hmotn. vodného ethanoluk odstranění nečistot.
[0048] Koncentrace nanášecího roztoku:1,0 g surové byliny/ml vody.
Následné zpracování: projít makroporézní pryskyřicí, eluovat destilovanou vodou a poté roztokem ethanolu.
Průtok pryskyřicí:3 ml/min.
[0051] Pryskyřice:AB-8, objem pryskyřice0.93 L.
Poměr objemu destilované vody k pryskyřici:7 : 1. Poměr ethanolu a roztoku k pryskyřici:6 : 1.
[0053] Ethanolový roztok:80% (w/w)vodný ethanol.

 

Kliknutím získáte další podrobnosti o továrně cistanche

Příklad 3

[0053] Způsob přípravy zahrnuje:

zdrcujícíCistanche tubulosa40 mesh sítem120 gsurový prášek;

extrakce s12× hmotnostz50 % hmotn. vodného ethanolu, extrahování v70 stupňů, 2krát, 1 h každý, soustředění na70 stupňůk poměru1 : 2.5pro získání koncentrovaného roztoku;

přidání vody pro úpravu koncentrace0,2 g surové byliny/ml vody, odstřeďování při3500 ot./min po dobu 5 minza použití supernatantu jako nanášecího roztoku;

průchod přes makroporézní pryskyřici; postupná eluce destilovanou vodou a roztokem ethanolu; sbírání ethanolové eluce a koncentrování/sušení při70 stupňůzískat extrakt s výtěžkem24.30%.

[0054] Pryskyřice:HPD750, objem pryskyřice0.93 L.
Poměr destilované vody k pryskyřici:3 : 1. Poměr ethanolu a roztoku k pryskyřici:4 : 1.
[0056] Ethanolový roztok:30% (w/w)vodný ethanol.

 

Testování výkonu

1.1 Test buněčné proliferace

Osteoblasty jsou hlavní funkční buňky odpovědné za tvorbu kosti, zahrnující proliferaci pre-osteoblastů, produkci kostní matrice a konečnou diferenciaci. TheMC3T3-E1buněčná linie se běžně používá ke studiu osteogenní aktivity. Diferenciace osteoblastů zahrnuje proliferaci, diferenciaci a mineralizaci – projevující se zvýšeným počtem pre-osteoblastů, zráním na osteoblasty a tvorbou nové kostní matrix.

Alkalická fosfatáza (ALP)je protein související s fenotypem osteoblastů detekovatelný během buněčné proliferace a zrání matrice a je běžně používaným časným markerem diferenciace osteoblastů.

Vyhodnocením proliferace MC3T3-E1 a aktivity ALP byla tedy porovnána aktivita podporující osteogenezi extraktů připravených v příkladech 1–3.

Buňky MC3T3-E1 byly oživeny a pasážovány. Po stabilizaci byly buňky štěpeny, centrifugovány a shromážděny. Hustota buněk byla upravena tak, aby každých 100 ul obsahovalo 5 x 1035 x 10^35 x 103 buněk a bylo naočkováno do 96-jamkové destičky. Po kultivaci přes noc bylo médium nahrazeno kompletním médiem obsahujícím extrakty z příkladu 1–3 v koncentracích6,25, 12,5, 25 a 50 ug/mlnebo obsahující0,1 M estradiolu(pozitivní kontrola) nebo samotné médium (slepá kontrola) a kultivováno pro48 h. Za podmínek chráněných před světlem byl přidán zásobní roztok MTT (10 %–20 % objemu jamky) a inkubován po dobu4 hv CO₂ inkubátoru, médium odstraněno a200 ul DMSOpřidán k rozpuštění formazanu. Hodnoty OD byly měřeny při490 nm.

Výsledky: Obr. 1 (Příklad 1), Obr. 2 (Příklad 2), Obr. 3 (Příklad 3).

[0058] Míra proliferace buněk (%)=OD(příklad 1–3)−OD(prázdný)OD(prázdný)×100%\\frac{OD(\\text{příklad 1–3}) - OD(\\text{prázdný})}{OD(\\text{prázdný})} \\krát 100% OD (příklad 100) 1–3)–OD (prázdné)​×100 %

[0059] Jak je znázorněno na obr. . 1-3, pozitivní kontrola podporovala proliferaci MC3T3-E1. Příklad 1 podporoval proliferaci při 6,25, 12,5 a 25 ug/ml; rychlost proliferace při 12,5 ug/ml byla 1,4x vyšší než u pozitivní kontroly, ale bez významného rozdílu (P > 0,05). Příklad 2 podporoval proliferaci při 6,25, 12,5, 25 a 50 ug/ml; při 12,5, 25 a 50 ug/ml byly jeho účinky lepší než u pozitivní kontroly (P < 0,01 nebo P < 0,001), s rychlostmi proliferace 2,55×, 3,46× a 2,59× ve srovnání s pozitivní kontrolou. Příklad 3 podporoval proliferaci při 6,25, 12,5, 25 a 50 ug/ml; při 12,5, 25 a 50 ug/ml byla lepší než pozitivní kontrola (P < 0,01 nebo P < 0,001), s rychlostmi proliferace 1,40×, 1,76× a 0,93× ve srovnání s pozitivní kontrolou. To ukazuje, že příklad 2 měl nejlepší účinek na podporu proliferace MC3T3-E1.

1.2 Test aktivity ALP

Aktivita ALP byla měřena pomocí testovací soupravy ALP. Zásobní koncentrace p-nitrofenolu byla 10 mM a koncentrace standardní křivky byly 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,2 a 0,25 mM, připravené gradientovým ředěním detekčním pufrem.

Pro každou jamku se vzorkem v 96jamkové destičce bylo přidáno 49 μl detekčního pufru, 1 μl proteinu extrahovaného z ošetřených buněk MC3T3-E1 (z části 1.1) a 50 μl chromogenního substrátu (přidaný jako poslední). Reakce probíhala 30 minut v inkubátoru chráněném před světlem, byla ukončena přidáním 100 μl zastavovacího roztoku a absorbance byla měřena při405 nm. Aktivita ALP byla vypočtena ze standardní křivky.

Výsledky: Obr. 4 (Příklad 1), Obr. 5 (Příklad 2), Obr. 6 (Příklad 3).

[0061] Aktivita ALP (U/L)=(relativní molární koncentrace proteinu) × 1000 × 100/30
(1000 pro konverzi molárních jednotek; 100 pro celkový reakční objem; 30 pro reakční dobu 30 minut)

ALP je časným markerem diferenciace MC3T3-E1. Obr. 4–6 ukazuje, že pozitivní kontrola zvýšila aktivitu ALP. Příklad 1 nepodporoval aktivitu ALP. Příklad 2 zvýšil aktivitu ALP při 12,5, 25 a 50 ug/ml; při 25 a 50 ug/ml byly rozdíly oproti slepému pokusu významné (P < 0,01). Příklad 3 zvýšil aktivitu ALP při 12,5 a 25 ug/ml (P < 0,001), ale se zvyšující se koncentrací se zvýšení snižovalo. To ukazuje, že pouze příklady 2 a 3 zvýšily aktivitu ALP a podpořily diferenciaci.

Celkově pouze příklad 2 ukázal na dávku pozitivní korelaci jak v proliferaci MC3T3-E1, tak v aktivitě ALP při 12,5 a 25 ug/ml. Příklad 3 ukázal na dávku pozitivní korelaci pro proliferaci, ale na dávku negativní korelaci pro ALP. Ve srovnání je příklad 2 vhodnější pro zlepšení kostní minerální hustoty.

1.3 Mineralizace (barvení alizarinovou červení) příkladu 2

Protože příklad 2 vykazoval nejlepší korelaci aktivity a dávky ve srovnání s příklady 1 a 3, byly provedeny mineralizační experimenty, aby se dále vyhodnotil jeho účinek.

[0064] Buňky MC3T3-E1 byly ošetřeny po 72 hodinách kultivace extraktem z příkladu 2 při12,5, 25 a 50 ug/ml, inkubováno při 37 stupních pro14 days(na základě tvorby kalciových nodulů), s výměnou média každé 2 dny. Bylo provedeno barvení alizarinovou červení: médium bylo odstraněno, buňky fixovány 10% neutrálním formalínem (300 μl/jamka) po dobu 30 minut, opláchnuty, barveny 0,1% alizarinovou červení (300 μl/jamka) po dobu 30 minut (pokojová teplota, chráněno před světlem) a promyty, dokud nezůstala žádná červená barva. Byly pořízeny snímky. Poté byl přidán 10% roztok cetylpyridiniumchloridu (400 ul/jamka) a třepán po dobu 1 hodiny, aby se rozpustily kalcifikované uzliny. Rozpuštěný roztok byl přenesen na 96-jamkovou destičku (100 ul/jamku) a OD měřena při562 nmpro výpočet rychlosti mineralizace. Fotografie: Obr. 7; kvantitativní výsledky: Obr. 8.

[0065] Míra mineralizace (%)=OD(příklad 2)−OD(prázdný)OD(prázdný)×100%\\frac{OD(\\text{Příklad 2}) - OD(\\text{prázdný})}{OD(\\text{prázdný})} \\krát 100)\\%OD(B) 2)−OD(prázdné)​×100%

[0066] Obr. 7 ukazuje, že počty kalciových uzlů se postupně zvyšovaly s koncentrací oproti slepému pokusu. Obr . 8 ukazuje, že příklad 2 podporoval mineralizaci způsobem závislým na koncentraci při 12,5, 25 a 50 ug/ml, s nejsilnějším účinkem při 50 ug/ml, významně lépe než pozitivní kontrola (P < 0,001). Protože mineralizované uzliny představují konečnou fázi diferenciace osteoblastů, tyto výsledky dále potvrzují účinek příkladu 2 na podporu kostní hustoty a demonstrují jeho stabilní aktivitu. Příklad 2 byl lepší než estradiol, což ukazuje na potenciální hodnotu pro produkty zdraví kostí.

Genová exprese a mechanismus dráhy (příklad 2)

[0067] Extrakt z příkladu 2 (12,5, 25, 50 ug/ml) byl aplikován na buňky MC3T3-E1 po dobu 3 dnů. Extrakce RNA, kvantifikace, reverzní transkripce (20 μl systém; 800 ng RNA vstup) a qRT-PCR byly provedeny pro kvantifikaci relativních úrovní expreseRunx2 mRNA, Osx mRNA, Opn mRNA a Ocn mRNA. Výsledky: Obr. 9–12.

[0068] Runx2 and Osx are key downstream regulators in BMP signaling, inducing osteoblast differentiation. Runx2 is important in the early commitment stage, while Osx functions in terminal differentiation. OPN and OCN are important indicators for osteoblast activity and tissue mineralization. Fig. 9–12 show that Example 2 increased relative expression of these markers, supporting enhanced osteoblast differentiation and bone formation.

[0069] Příklad 2 upregulovánBmp2 mRNA(obr. 13), což znamená aktivaciBMP/Smad cesta, který podporuje diferenciaci osteoblastů a novotvorbu kosti.

Příklad 2 zvýšil relativní expresiLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA a Wnt3 mRNA(obr. 14–16), podporující aktivaciWnt/ -catenin signalizace, která úzce souvisí s proliferací, diferenciací a tvorbou kostí osteoblastů.

Proteinová exprese (příklad 2)

Analýza Western blot ukázala, že v příkladu 2 došlo ke zvýšeníOsxaRUNX2exprese proteinu (obr.. 17–18), což ukazuje na regulaci na transkripční i translační úrovni k podpoře diferenciace osteoblastů.

Tyto testy aktivity ukazují, že příklad 2 poskytl nejlepší účinek na podporu proliferace a byl jediný s konzistentní korelací dávky jak pro proliferaci, tak pro ALP. Příklad 2 byl také lepší než estradiol v podpoře proliferace a mineralizace MC3T3-E1 se srovnatelnými diferenciačními účinky, což naznačuje optimální potenciál podpory kostní hustoty.

 

Testování chemického složení

6.1 Obsah fenylethanoidních glykosidů

S odkazem na testovací metodu "Cistanche" v čínském lékopisu byly měřeny obsahy echinakosidu a akteosidu v příkladech 1 až 3 (výsledky jsou uvedeny v tabulce 1). Na základě echinakosidu, akteosidu a celkových PhGs byl trend konzistentní: Příklad 3 > Příklad 1 > Příklad 2 a akteosid v příkladu 3 byl 3,85× a 4,27× oproti příkladu 1 a 2, v daném pořadí. Kombinace výsledků aktivity a obsahu ukazuje, že samotný echinakosid a akteosid neurčují přímo osteogenní účinky.

 

Table 1. Contents of Echinacoside and Acteoside in Cistanche Extracts (%)

Ukázka (příklad)	Echinakosid (%)	akteosid / verbaskosid (%)	Celkem (%)
Příklad 1	28.68	1.63	30.31
Příklad 2	26.27	1.47	27.74
Příklad 3	30.39	6.27	36.66

 

6.2 Další součásti (UPLC/Q-TOF/MS)

[0078] UPLC/Q-TOF/MS byla použita k porovnání chemických složek mezi příklady 1–3. Hodnoty odezvy jsou uvedeny v tabulce 2.

Příklad 2 kromě echinakosidu a akteosidu obsahoval dalšíkyselina šikimová a složky typu kyseliny fenylpropionovéa takéalkaloidy. Ve srovnání s příklady 1 a 3 měl příklad 2 11 složek souvisejících s fenylpropionovou/šikimovou kyselinou s nejvyššími odezvami, včetně:

Tabulka 2. Hodnoty odezvy UPLC/Q-TOF/MS klíčových komponent v extraktech Cistanche (příklady 1–3)

注:原表为"响应值(hodnota odezvy)";我保留为纯数值,不加单位(与图表一致).表内廄:为2Kyselina šikimová a deriváty kyseliny fenylpropionové(莽草酸及苯丙酸类)与 Alkaloidy(生物碱).

A. Kyselina šikimová a deriváty kyseliny fenylpropionové

Sloučenina	Příklad 1	Příklad 2	Příklad 3
Kyselina isodanfenolová B (异丹酚酸B)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Kyselina p-hydroxyfenylpropionová (对羟基苯丙酸)	2,897,237.374	6,144,507.902	1,139,582.918
Kyselina šikimová (莽草酸)	6,539,932.014	8,883,034.928	7,442,038.152
kyselina (2R)-2-[(E)-3-[3-[(lR)-1-karboxy-2-(3,4-dihydroxyfenyl)ethoxy]karbonyl-2-(3,4-dihydroxyfenyl)-7-hydroxy-2,3-dihydrobenzofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oxy-3-(3,4-dihydroxyfenyl)propanová	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Benzoylaceton (苯甲酰丙酮)	4,235,952.540	4,526,539.189	4,297,281.060
Epipinoresinol 4′-O- -D-glukosid (表丁香树脂酚 4′-O- -D-葡萄糖苷)	2,758,386.748	4,338,477.068	1,182,637.856
Yangmei Changshan glykosid* (杨梅常山苷)	713,259.014	9,202,359.822	841,791.016
Jionosid A1 (焦地黄苯乙醇苷A1)	2,184,856.679	3,736,929.302	3,098,713.743
Kyselina 3,4-dimethylbenzoová (3,4-2甲基苯甲酸)	585,269.7562	1,386,349.28	1,400,433.204
Robustaside D	1,693,753.421	3,272,248.064	4,236,657.164
7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxytetrahydropyran-2-yl]oxymethyl]tetrahydropyran-2-yl]oxychromen-2-on	4,489,728.765	1,167,879.841	824,633.4

 

---

B. Alkaloidy

Sloučenina	Příklad 1	Příklad 2	Příklad 3
Verticine (野百合碱)	1,306,481.28	524,919.97	4,057,704.757
Dihydrokoptisin (氢化可他宁碱)	6,406,217.365	9,533,850.521	4,649,410.535
tymin (胸腺嘧啶)	2,658,397.084	2,715,160.269	554,956.4602
gelsemine (钩吻碱)	3,698,263.919	1,554,195.385	5,144,366.562
Yohimbin (育亨宾)	3,929,806.438	1,286,932.427	9,431,924.132

kyselina isodanfenolová B,

kyselina p-hydroxyfenylpropionová,

kyselina (2R)-2-[(E)-3-[3-[(lR)-1-karboxy-2-(3,4-dihydroxyfenyl)ethoxy]karbonyl-2-(3,4-dihydroxyfenyl)-7-hydroxy-2,3-dihydrobenzofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oxy-3-(3,4-dihydroxyfenyl)propanová,

benzoylaceton,

epipinoresinol 4′-O- -D-glukosid,

glykosid související s myricetinem (jak je uveden),

jionosid A1,

kyselina 3,4-dimethylbenzoová,

robustaside D,

7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxytetrahydropyran-2-yl]oxymethyl]tetrahydropyran-2-yl]oxychromen-2-on.

Obsahuje také 5 alkaloidů, včetně:

verticine,

dihydrokoptisin (jak je uvedeno v seznamu),

tymin,

alkaloid příbuzný gelseminu (jak je uvedeno),

yohimbin.

[0080] Na základě srovnávacích výsledků proliferace/aktivity ALP, testů fenylethanoidových glykosidů a chemického profilování lze usuzovat, že fenylethanoidní glykosidy (echinakosid a akteosid), šikimové/fenylpropionové kyseliny, alkaloidy a terpenoidy společně tvoří specifické složení extraktu produkujícího dávku 12 (závislost 12). ug/ml) napříč proliferací, diferenciací a mineralizací, což umožňuje stabilní účinky podporující hustotu kostí.

Tabulka 2: Hodnoty odezvy komponent.
Vynález, prostřednictvím postupu z příkladu 2, poskytuje extrakt z Cistanche s celkovým obsahem echinakosidu + akteosidu > 25 % a obohacenými kyselinami šikimovými/fenylpropionovými a alkaloidy, což umožňuje stabilní účinky podporující hustotu kostí. V rozmezí 12,5–25 ug/ml podporuje proliferaci, diferenciaci a mineralizaci MC3T3-E1 způsobem zvyšujícím dávku s konzistentní korelací dávky, podporuje lepší a stabilnější výsledky v oblasti zdraví kostí a umožňuje použití v produktech souvisejících se zlepšením hustoty kostních minerálů.