Polysacharid Cistanche Deserticola inhibuje OVX-indukovaný úbytek kostní hmoty u myší a RANKL-indukovanou osteoklastogenezi
Feb 25, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
ABSTRAKTNÍ
Osteoporóza je závažné onemocnění kostí postihující stárnoucí populaci. Bylo prokázáno, že Cistanche deserticola (CD), tonikum a léčivá potravina široce používaná v Číně, poskytuje účinnou léčbu osteoporózy. Polysacharid Cistanche deserticola (CDP), extrahovaný z CD, má různé farmakologické vlastnosti, ale jeho úlohaosteoklastickétvorba a funkce, stejně jako osteoporóza, zůstává neznámá. Účelem této studie bylo extrahovat a purifikovat CDP, aby se dále prozkoumal jeho potenciální mechanismus účinku na osteoporózu. Výsledky ukázaly, že léčba CDP zabránila osteoporóze vyvolané OVX a zlepšila ztrátu kostní hmoty potlačením aktivity a funkce osteoklastů. Kromě toho léčba CDP významně inhibovala RANKL-indukovanou osteoklastogenezi, kostní resorpci a genovou expresi specifickou pro osteoklasty. CDP mechanicky inhiboval RANKL-indukovanou aktivaci signálních drah NF-KB a MAPK a následně ovlivnil downstream aktivaci NFATc1. Zjištění v této studii naznačují, že CDP je potenciálně bezpečný lék pro léčbu osteoporózy. (10 výhod, které může Cistanche poskytnout)
Úvod
Osteoporóza – onemocnění charakterizované úbytkem kostní hmoty, abnormální mikrostrukturou kostní tkáně, zvýšenou křehkostí kostí a zlomeninami (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli a Ginaldi, 2006) – v současnosti postihuje více než 200 milionů lidí na celém světě a představuje významný zdravotní a socioekonomická zátěž moderní společnosti (Strom et al., 2011). Klinická léčba osteoporózy se zaměřuje především na hormonální substituci,bisfosfonátnebo terapie denosumabem. Tyto metody jsou účinné, ale mají dlouhodobé vedlejší účinky, jako je potenciální riziko rakoviny prsu a atypických zlomenin femuru (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof Bauer, 2011). Existuje tedy naléhavá potřeba prozkoumat léky, které mohou nejen inhibovat osteoporózu, ale mají také méně nežádoucích vedlejších účinků. Cistanche deserticola (CD), tonikum a léčivá potravina široce používaná v Číně, známá jako „pouštní ženšen“, je sušený šťavnatý stonek se šupinovým listem C. deserticola YC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) a má různé a účinné farmakologické aktivity, jako je imunitní regulace,antioxidačnía vlastnosti proti osteoporóze (Hu a kol., 2020; Li a kol., 2012; Zhang a kol., 2014). Předchozí studie o aktivních látkách CD při léčbě osteoporózy se zaměřily hlavně na fenylethanoidní glykosidy (Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). CD však obsahuje i další účinné složky jako jsou iridoidy, lignany, polysacharidy (Wang, Zhang, & Xie, 2012). Klinickou aplikací tradiční čínské medicíny (TCM) je především odvar z vody. Polysacharidy jsou ve vodě rozpustné složky a s největší pravděpodobností jsou hlavními farmakodynamickými složkami TCM. U polysacharidů extrahovaných z TCM bylo divoce hlášeno, že mají účinek proti osteoporóze a několik nežádoucích vedlejších účinků, které se obecně používají na klinikách (např. polysacharidy extrahované zEpimedium brevicornum(Zheng, He, Wu, Cai a Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang a Yan, 2018) a Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Proto jsme předpokládali, žePolysacharid Cistanche deserticola(CDP) extrahovaný z CD může být potenciálně bezpečným lékem pro léčbu osteoporózy. Resorpce kosti a tvorba kosti obvykle udržují dynamickou rovnováhu během remodelace kosti v koordinaci s několika typy buněk, včetně osteoklastů,osteoblasty, buňky kostní výstelky a osteocyty (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Narušení této rovnováhy může vést k řadě metabolických onemocnění kostí, jako je osteoporóza (Zhu et al., 2018) a osteoskleróza (Ihde et al., 2011). Osteoklasty, jako endově diferencované buňky odvozené z mononukleární/makrofágové linie, jsou jediné buňky s funkcí kostní resorpce (Teitelbaum, 20{{106}}0). Existují dva klíčové cytokiny, které se účastní diferenciace a zrání osteoklastů (Koga et al., 2004): faktor stimulující kolonie makrofágů (M-CSF) a receptorový aktivátor ligandu jaderného faktoru κB (NF-κB) (RANKL). M-CSF zprostředkovává diferenciaci hematopoetických kmenových buněk na progenitory osteoklastů a podporuje diferenciaci osteoklastů upregulací exprese RANK receptoru (Takayanagi, 2007). Vazba RANKL a RANK na buněčný povrch osteoklastů vede k následujícímu: (1) náboru signálních adaptorových molekul, jako je faktor 6 spojený s TNF receptorem (TRAF6); (2) aktivace více downstream cílů, včetně NF-kB a mitogenem aktivovaných proteinkináz (MAPK); a (3) upregulace úrovní exprese jaderného faktoru aktivovaných T-buněk, cytoplazmatický 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Aktivace těchto signálních drah přímo reguluje expresi osteoklastových genů, včetně kyselé fosfatázy 5 (Acp5) [kódující kyselou fosfatázu rezistentní na tartrát (TRAcP)], matrix metaloproteinázy 9 (MMP9) a katepsinu K (CTSK) (Boyle, Simonet & Lacey, 2003). Inhibice RANKL-indukovaných signálních drah souvisejících s diferenciací osteoklastů je tedy potenciální terapeutickou metodou pro osteoporózu. V této studii jsme se zaměřili na stanovení účinků léčby CDP na myším modelu osteoporózy indukované ovariektomií (OVX) in vivo a na aktivitu osteoklastů indukovanou RANKL in vitro, se zaměřením na expresi genů specifických pro osteoklasty a aktivaci NFATc1 a signálních drah NF-KB a MAPKs. Naše zjištění mohou poskytnout nový pohled na potenciál CDP jako bezpečného a účinného léku pro léčbu osteoporózy. 2. Materiály a metody 2.1. CD s chemikáliemi a sbírkou vzorků (č. 180801) bylo zakoupeno od Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Čína) a identifikováno profesorem Haibo Huangem ze School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Čína . Tablety estradiol valerátu byly zakoupeny od Bayer (Leverkusen, Severní Porýní-Vestfálsko, Německo). Alfa modifikované minimální esenciální médium (-MEM) a fetální bovinní sérum (FBS) byly získány od Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penicilin/streptomycin a souprava pro barvení TRAcP byly získány od společnosti Solarbio (Peking, Čína). Rekombinantní myší M-CSF a rekombinantní myší RANKL byly získány od R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Hydroxyapatitem potažené destičky byly zakoupeny od Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). Primární protilátky pro NFATcl a CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IkB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK a P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan vers, MA, USA); a -aktin (CWBIO, Peking, Čína). Ostatní činidla použitá v této studii byla analytické kvality a voda byla čištěna systémem pro čištění vody Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). 2.2. Extrakce CDP CD bylo rozemleto na jemný prášek a třikrát smícháno s petroletherem, aby se porazilo. Pevný zbytek se sebere filtrací a poté se suší při teplotě místnosti. Polysacharidy byly extrahovány z předem upravených vzorků třikrát vodou po dobu 2 hodin, zakoncentrovány, vysráženy přidáním bezvodého ethanolu na konečnou koncentraci 80 procent (v/v) a skladovány při 4 °C po dobu 24 hodin. Precipitáty byly shromážděny centrifugací při 3000 ot./min po dobu 20 minut, rozpuštěny v destilované vodě a purifikovány (odstranění volných proteinů) pomocí metody Sevag (Zhao et al., 2019). Získané polysacharidy byly dialyzovány, sušeny a skladovány do dalšího použití. Kromě toho výsledky chemického složení ukázaly, že celkový obsah cukru, kyseliny uronové, sulfátu a bílkovin v CDP byl 67,63 ± 0,98 procenta, 21,05 ± 0,49 procenta, 1,90 ± 0,24 procenta a 8,81 ± 0,36 procenta. Monosacharidové složení a infračervená analýza s Fourierovou transformací CDP byly ukázány na doplňkovém obrázku 1 a 2. 2.3. Myší model osteoporózy vyvolané OVX Všechny experimenty na zvířatech byly schváleny Výborem pro etiku zvířat při Guangzhou University of Chinese Medicine (schváleno SYXK 2019-0202). Třicet 6-týdenních myších samic C57BL/6 bylo dodáno Experimentálním zvířecím centrem Guangzhou University of Chinese Medicine. Po aklimatizaci po dobu 1 týdne byla jedné skupině myší podána falešná operace (Sham skupina), zatímco zbývající myši byly podrobeny operaci ovariektomie (OVX skupina). Po operaci se myši nechaly 1-týden zotavovat. Poté byly úspěšně modelované myši náhodně rozděleny do 5 skupin, po 6 myších na skupinu: (1) falešná skupina: léčena destilovanou vodou, (2) skupina OVX: léčena destilovanou vodou, (3) skupina OVX plus E2 (E2) : léčeni 0,13 mg/kg tabletami estradiolvalerátu, (4) OVX plus CDP skupina s nízkou dávkou (CDP-L): léčena 300 mg/kg CDP, (5) OVX plus CDP skupina s vysokou dávkou (CDP H): léčena s 600 mg/kg CDP. Destilovaná voda, E2 nebo CDP byly podávány sondou jednou denně. Všechny myši byly utraceny po 12-týdenním období léčby (obr. 1A). Dělohy byly odebrány a zváženy a byly odebrány levé tibie pro následná vyšetření. Vzorky plné krve byly odebrány a centrifugovány při 5000 ot./min po dobu 15 minut při 4 °C. Sérové supernatanty byly odsáty a skladovány při -80 ◦C až do další analýzy. 2.4. Analýza mikropočítačovou tomografií (mikro-CT) a kostní histomorfometrie Levé tibie byly fixovány 4% paraformaldehydem po dobu 48 hodin a následně umístěny do centrifugačních zkumavek obsahujících fyziologický roztok. Fixované vzorky byly skenovány přístrojem Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgie) s použitím následujících nastavení: napětí, 80 kV; proud zdroje, 100 μA; Al, 0,5 mm filtr; velikost pixelu, 9,76 μm; a rotační krok, 0,6◦. Několik parametrů trabekulární kosti, včetně kostní minerální hustoty (BMD), objemové frakce kosti (BV/TV), kostního povrchu na celkový objem (BS/TV), trabekulárního počtu (Tb. N) a trabekulární vzdálenosti (Tb.Sp ) byly měřeny pomocí softwaru CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Trojrozměrné obrazy byly generovány pomocí softwaru CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). Po mikro-CT analýze byly levé tibie dekalcifikovány ve 14% roztoku EDTA a zality do parafínu pro nařezání. Vzorky byly nakrájeny na 5 um řezy pomocí mikrotomu před experimenty s hematoxylinem a eosinem (H&E) a TRAcP barvením. Obarvené řezy byly zkoumány a dokumentovány pomocí mikroskopu Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japonsko). 2.5. Analýza séra Koncentrace vápníku (Ca) a fosforu (P) byly stanoveny podle instrukcí soupravy navržené Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína). Hladiny TRAcP-5ba RANKL v séru byly analyzovány pomocí soupravy TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, Čína) a soupravy RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Čína).
CD s chemikáliemi a sbírkou vzorků (č. 180801) bylo zakoupeno od Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Čína) a identifikováno profesorem Haibo Huangem ze School of Farmaceutické vědy, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Čína. Tablety estradiol valerátu byly zakoupeny od Bayer (Leverkusen, Severní Porýní-Vestfálsko, Německo). Alfa modifikované minimální esenciální médium (-MEM) a fetální bovinní sérum (FBS) byly získány od Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penicilin/streptomycin a souprava pro barvení TRAcP byly získány od společnosti Solarbio (Peking, Čína). Rekombinantní myší M-CSF a rekombinantní myší RANKL byly získány od R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Hydroxyapatitem potažené destičky byly zakoupeny od Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). Primární protilátky pro NFATcl a CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IkB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK a P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan vers, MA, USA); a -aktin (CWBIO, Peking, Čína). Ostatní činidla použitá v této studii byla analytické kvality a voda byla čištěna systémem pro čištění vody Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). 2.2. Extrakce CDP CD bylo rozemleto na jemný prášek a třikrát smícháno s petroletherem, aby se porazilo. Pevný zbytek se sebere filtrací a poté se suší při teplotě místnosti. Polysacharidy byly extrahovány z předem upravených vzorků třikrát vodou po dobu 2 hodin, zakoncentrovány, vysráženy přidáním bezvodého ethanolu na konečnou koncentraci 80 procent (v/v) a skladovány při 4 ◦C po dobu 24 hodin. Precipitáty byly shromážděny centrifugací při 3000 otáčkách za minutu po dobu 20 min, rozpuštěny v destilované vodě a purifikovány (odstranění volných proteinů) metodou Sevag (Zhao et al., 2019). Získané polysacharidy byly dialyzovány, sušeny a skladovány do dalšího použití. Kromě toho výsledky chemického složení ukázaly, že celkový obsah cukru, kyseliny uronové, sulfátu a bílkovin v CDP byl 67,63 ± 0,98 procenta, 21,05 ± 0,49 procenta, 1,90 ± 0,24 procenta a 8,81 ± 0,36 procenta. Monosacharidové složení a infračervená analýza s Fourierovou transformací CDP byly ukázány na doplňkovém obrázku 1 a 2. 2.3. Myší model osteoporózy indukované OVX Všechny experimenty na zvířatech byly schváleny Výborem pro etiku zvířat na Guangzhou University of Chinese Medicine (schváleno SYXK 2019-0202). Třicet 6-týdenních myších samic C57BL/6 bylo dodáno Experimentálním zvířecím centrem Guangzhou University of Chinese Medicine. Po aklimatizaci po dobu 1 týdne byla jedné skupině myší podána falešná operace (Sham skupina), zatímco zbývající myši byly podrobeny operaci ovariektomie (OVX skupina). Po operaci se myši nechaly 1-týden zotavovat. Poté byly úspěšně modelované myši náhodně rozděleny do 5 skupin, po 6 myších na skupinu: (1) falešná skupina: léčena destilovanou vodou, (2) skupina OVX: léčena destilovanou vodou, (3) skupina OVX plus E2 (E2) : léčeni 0,13 mg/kg tabletami estradiolvalerátu, (4) OVX plus CDP skupina s nízkou dávkou (CDP-L): léčena 300 mg/kg CDP, (5) OVX plus CDP skupina s vysokou dávkou (CDP H): léčena s 600 mg/kg CDP. Destilovaná voda, E2 nebo CDP byly podávány sondou jednou denně. Všechny myši byly utraceny po 12-týdenním období léčby (obr. 1A). Dělohy byly odebrány a zváženy a byly odebrány levé tibie pro následná vyšetření. Vzorky plné krve byly odebrány a centrifugovány při 5000 ot./min po dobu 15 minut při 4 °C. Sérové supernatanty byly odsáty a skladovány při -80 ◦C až do další analýzy. 2.4. Analýza mikropočítačovou tomografií (mikro-CT) a kostní histomorfometrie Levé tibie byly fixovány 4% paraformaldehydem po dobu 48 hodin a následně umístěny do centrifugačních zkumavek obsahujících fyziologický roztok. Fixované vzorky byly skenovány přístrojem Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgie) s použitím následujících nastavení: napětí, 80 kV; proud zdroje, 100 μA; Al, 0,5 mm filtr; velikost pixelu, 9,76 μm; a rotační krok, 0,6◦. Několik parametrů trabekulární kosti, včetně kostní minerální hustoty (BMD), objemové frakce kosti (BV/TV), kostního povrchu na celkový objem (BS/TV), trabekulárního čísla (Tb. N) a trabekulární vzdálenosti (Tb. Sp ) byly měřeny pomocí softwaru CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Trojrozměrné obrazy byly generovány pomocí softwaru CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). Po mikro-CT analýze byly levé tibie dekalcifikovány ve 14% roztoku EDTA a zality do parafínu pro nařezání. Vzorky byly nakrájeny na 5 um řezy pomocí mikrotomu před experimenty s hematoxylinem a eosinem (H&E) a TRAcP barvením. Obarvené řezy byly zkoumány a dokumentovány pomocí mikroskopu Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japonsko). 2.5. Analýza séra Koncentrace vápníku (Ca) a fosforu (P) byly stanoveny podle instrukcí soupravy navržené společností Nanjing
Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína). Hladiny TRAcP{{0}}ba RANKL v séru byly analyzovány pomocí soupravy TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, Čína) a soupravy RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Čína) , resp. 2.6. Test osteoklastogeneze in vitro BMM byly izolovány z tibie a femuru 6-týdenních samic myší C57BL/6. Izolované buňky byly kultivovány v -MEM médiu obsahujícím 25 ng/ml M-CSF, 10 procento FBS a 1 procento penicilin/streptomycin. Po dosažení konfluence byly BMM (1 × 104 buňky/jamka) nasazeny na 96-jamkové destičky a ošetřeny CDP v přítomnosti 50 ng/ml RANKL. Médium a CDP byly vyměňovány každé 2 dny. Po 7 dnech byly buňky fixovány 4% paraformaldehydem a obarveny na přítomnost stop. Počet osteoklastů, definovaných jako TRAcP pozitivní buňky se třemi nebo více jádry, byl spočítán a dokumentován pomocí světelného mikroskopu. 2.7. Test buněčné proliferace BMM (1 x 104 buněk/jamka) byly nasazeny na 96-jamkovou destičku a inkubovány přes noc. Poté byly buňky ošetřeny různými koncentracemi CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 a 40 ug/ml) po dobu 48 hodin. Konfluence buněk byla detekována a analyzována pomocí IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA), dlouhodobého dynamického systému zobrazování živých buněk v reálném čase. 2.8. Test resorpce hydroxyapatitu BMM (1 x 104 buněk/jamka) byly nasazeny na destičku potaženou hydroxyapatitem, ošetřeny CDP v uvedených koncentracích (0, 5 a 10 ug/ml) a kultivovány v kompletním -MEM obsahujícím 25 ng/ ml M-CSF a 50 ng/ml RANKL. Po 7 dnech byly buňky promyty 10% roztokem bělidla, aby se odstranily buněčné složky. Obrazy oblastí resorpce hydroxyapatitu byly zachyceny pomocí IncuCyte ZOOM® a analyzovány pomocí softwaru ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003). 2.9. Izolace RNA a analýza kvantitativní PCR s reverzní transkripcí (RT-qPCR) v reálném čase. CDP v různých koncentracích (0, 5 a 10 ug/ml) po dobu 5 dnů. Celková RNA byla izolována z buněk nebo kostní tkáně myší pomocí činidla TRIzol (Sigma Aldrich). Komplementární DNA byla syntetizována z 2 ug celkové RNA za použití soupravy pro reverzní transkriptázu (TransGen Biotech, Beijing, Čína). Reakce RT-qPCR byly připraveny pomocí PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) a detekovány systémem ABI 7500 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Parametry cyklování pro PCR byly nastaveny následovně: 95 ◦C po dobu 5 minut, následovalo 40 cyklů 95 ◦C po dobu 15 s a 60 ◦C po dobu 30 s. Specifické použité primery jsou uvedeny v tabulce 1 a množství každého cílového genu bylo normalizováno na GAPDH (interní kontrola).
2.10. Analýza Western blot BMM (5 x 105 buněk/jamka) byly nasazeny na 6-jamkovou destičku. Pro krátkodobé experimenty byly buňky předem inkubovány s různými koncentracemi CDP (0, 5 a 10 µg/ml) po dobu 1 hodiny a poté ošetřeny 5{{ 58}} ng/mL RANKL po dobu 30 min. Po dlouhou dobu byly buňky stimulovány 50 ng/ml RANKL ve dnech 3, 5 a 7 v přítomnosti CDP (0, 5 a 10 ug/ml). Celkové proteiny byly extrahovány pomocí RIPA lyzačního pufru (CWBIO). Proteiny byly odděleny 10% SDS-PAGE a přeneseny na PVDF membrány. Membrány byly blokovány 5% odstředěným mlékem při pokojové teplotě po dobu 2 hodin, inkubovány s primárními protilátkami přes noc při 4 °C a poté s odpovídajícími sekundárními protilátkami po dobu 1,5 hodiny. Membrány byly vyvinuty pomocí činidel ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) a snímky byly pořízeny pomocí systému Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, Čína). 2.11. Detekce translokace NFATc1 pomocí imunofluorescenčního testu BMM byly naočkovány na 12-krycí sklíčka jamek, stimulovány RANKL a M-CSF a ošetřeny 10 ug/ml CDP po dobu 5 dnů. Buňky byly fixovány 4% paraformaldehydem po dobu 15 minut, promyty třikrát PBS a permeabilizovány 0,1% Tritonem X-100 po dobu 10 minut. Buňky byly smíchány s 10% kozím sérem (CWBIO) a inkubovány po dobu 2 hodin. Následně byly buňky inkubovány s primární protilátkou přes noc při 4 °C a poté s Alexa Fluor 488 kozí anti-myší sekundární protilátkou (Abcam, Cambridge, MA, USA) ve tmě po dobu 1 hodiny. Krycí sklíčka byla omyta PBS, upevněna v Prolong Gold Antifade Reagent s 4′, 6-diamidino-2-fenylin-dolem (DAPI) (Solar) a kontrolována pomocí Zeiss LSM 800 s konfokálním mikroskopem Airyscan ( Carl Zeiss, Oberkochen, Německo). 2.12. Statistická analýza Všechna experimentální data byla analyzována pomocí statistického softwaru SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Data pro studie na zvířatech a buňkách jsou vyjádřena jako průměr ± SEM a průměr ± SD. Výsledky jsou pomocí jednosměrné analýzy rozptylu nebo Studentova t-testu. Hodnoty p < 0,05="" byly="" považovány="" za="" statisticky="" významné.="" 3.="" výsledky="" 3.1.="" cdp="" zabraňuje="" ovx-indukovanému="" úbytku="" kostní="" hmoty="" in="" vivo="" použili="" jsme="" myší="" model="" osteoporózy="" indukované="" ovx="" ke="" zkoumání="" účinků="" léčby="" cdp="" na="" osteoporózu="" in="" vivo.="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" sham="" se="" tělesná="" hmotnost="" ovx="" myší="" významně="" zvýšila,="" zatímco="" uterinní="" index="" se="" snížil,="" což="" ukazuje,="" že="" model="" osteoporózy="" byl="" zkonstruován="" úspěšně="" (obr.="" 1b="" a="" d).="" micro-ct="" analýza="" tibií="" ve="" skupině="" ovx="" ukázala="" rozsáhlou="" kostní="" ztrátu.="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" ovx="" se="" počet="" kostních="" trabekul="" ve="" skupině="" cdp-l="" zvýšil,="" zatímco="" nárůst="" ve="" skupinách="" cdp-h="" a="" e2="" byl="" významnější="" a="" trabekuly="" v="" posledních="" dvou="" skupinách="" zhrubly="" a="" mezera="" se="" zmenšila="" (="" obr.="" 1c).="" kvantitativní="" analýza="" potvrdila,="" že="" několik="" kostních="" histomorfometrických="" parametrů,="" včetně="" bmd,="" bv/tv,="" bs/tv="" a="" tb.="" n="" měl="" významně="" zvýšené="" hodnoty,="" zatímco="" tb.="" sp="" vykazoval="" snížené="" hodnoty="" ve="" skupině="" cdp-h="" (obr.="" 1e="" a="" f).="" jeho="" patologické="" vyšetření="" pomocí="" h&e="" barvení="" odhalilo,="" že="" počet="" kostních="" trabekul="" ve="" skupinách="" cdp-h="" a="" e2="" byl="" významně="" vyšší="" než="" ve="" skupině="" ovx,="" zatímco="" ve="" skupině="" cdp-l="" nedošlo="" k="" žádnému="" významnému="" zlepšení="" (obr.="" 1g).="" navíc="" barvení="" tracp="" ukázalo,="" že="" počet="" osteoklastů="" se="" výrazně="" zvýšil="" ve="" skupině="" ovx,="" ale="" snížil="" se="" ve="" skupinách="" cdp-h="" a="" e2="" (obr.="" 1h).="" skupiny="" cdp-l,="" cdp-h="" a="" e2="" vykazovaly="" inhibici="" ovx-indukovaného="" zvýšení="" obsahu="" p,="" ale="" zvýšily="" obsah="" ca="" v="" krevním="" séru.="" markery="" kostní="" absorpce,="" rankl="" a="" tracp-5b,="" vykazovaly="" klesající="" trend="" v="">
ve skupině bez statistického rozdílu, zatímco ve skupině CDP-H byly významně sníženy (obr. 1I). Dále jsme zkoumali účinek CDP na expresi genů osteoklastových markerů v kostní tkáni pomocí RT-qPCR. Hladiny mRNA NFATcl, Acp5, Mmp9 a CTSK ve skupině OVX byly významně vyšší než ve skupině Sham. Skupiny CDP-H ukázaly snížení hladiny mRNA NFATc1, Acp5 a CTSK o 1.74-, 1.70- a 2.{14}}krát ve srovnání se skupinou OVX. (Obr. 1J). 3.2. CDP potlačuje RANKL-indukovanou osteoklastogenezi in vitro Sledovali jsme buněčnou proliferaci BMM ošetřených CDP pomocí dlouhodobého dynamického analyzátoru zobrazování živých buněk v reálném čase. Ve srovnání s kontrolní skupinou se konfluence buněk ve skupinách léčených CDP v dávce nezměnila<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="" cdp="" on="" ranklinduced="" osteoclastogenesis,="" bmms="" were="" stimulated="" with="" rankl="" and="" mcsf="" in="" the="" presence="" of="" cdp="" for="" 7="" days.="" tracp,="" a="" characteristic="" enzyme="" of="" osteoclasts,="" is="" considered="" as="" an="" indicator="" of="" osteoclast="" function="" (minkin,="" 1982).="" tracp="" staining="" showed="" that="" the="" osteoclasts="" treated="" with="">1,25 ug/ml CDP vykazovalo významně sníženou velikost a počet (obr. 2B a C). Tyto výsledky ukázaly, že CDP účinně inhibuje očekávanou RANKL-indukovanou osteoklastogenezi bez ovlivnění životaschopnosti buněk. 3.3. CDP inhibuje RANKL-indukovanou aktivitu osteoklastické resorpce a expresi genu specifickou pro osteoklasty. Dále jsme určili účinky léčby CDP na aktivitu kostní resorpce osteoklastů pomocí destiček potažených hydroxyapatitem. Kostní resorpce je hlavní funkcí a standardem pro měření aktivity a schopnosti osteoklastů (Novack & Faccio, 2011). Výsledky ukázaly, že CDP může významně snížit kostní resorpční plochu osteoklastů způsobem závislým na dávce, což ukazuje, že CDP inhibuje aktivitu kostní resorpce indukovanou RANKL (obr. 3A a B). Konkrétně se osteoklastická kost resorpční plocha snížila na přibližně 6,3 procenta po léčbě 10 ug/ml CDP. Abychom lépe zjistili překážku CDP na osteoklastogenezi, měřili jsme hladiny transkripce genů souvisejících s osteoklasty. Bez léčby CDP indukce RANKL podpořila expresi genů NFATcl, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 a Mmp9. Naopak, současná aplikace CDP a RANKL významně downregulovala těchto pět genů (obr. 3C a D).
3.4. CDP inhibuje aktivaci NFATc1 indukovanou RANKL Barvení TRAcP odhalilo, že léčba CDP významně snížila očekávané zvýšení počtu zralých osteoklastů po stimulaci RANKL po dobu 3–7 dnů (obr. 4A a B). Dále jsme zkoumali, zda léčba CDP může účinně narušit diferenciaci osteoklastů inhibicí exprese NFATc1. Výsledky ukázaly, že NFATc1 byl vysoce exprimován po stimulaci RANKL po dobu 5 dnů, což bylo významně inhibováno po léčbě CDP (obr. 4C a D). Kromě toho léčba CDP potlačila hladiny exprese CTSK, proteinu potřebného pro normální tvorbu a funkci osteoklastů (Bossard et al., 1996) (obr. 4E a F). Vybrali jsme reprezentaci RANKL stimulace v čase po dobu 5 dnů, abychom dále prozkoumali účinek léčby 10 µg/ml CDP na translokaci NFATc1. Jak se očekávalo, léčba CDP významně inhibovala RANKL-indukovanou jadernou translokaci NFATc1 (obr. 4G a H).
Obr. 4. CDP potlačuje RANKL-indukovanou aktivaci NFATc1. (A) BMM byly nasazeny do 6-jamkové destičky a stimulovány RANKL a M-CSF v přítomnosti CDP (0, 5 a 10 µg/ml) pro uvedené dny. Reprezentativní snímky ukazující TRAcP-pozitivní vícejaderné buňky. Zvětšení, ×100. Měřítko {{10}}} μm. (B) Kvantifikace TRAcP-pozitivních vícejaderných buněk (jádra větší nebo rovna 3). (CF) Western blot analýza exprese proteinů NFATc1 a CTSK v BMM stimulovaných M CSF a RANKL po dobu 3–7 dnů v přítomnosti CDP. (G) BMM byly ošetřeny 10 ug/ml CDP a stimulovány M-CSF a RANKL po dobu 5 dnů, poté imunobarveny pomocí NFATc1 (zelená) a DAPI (modrá) a pozorovány pomocí konfokálního mikroskopu. Zvětšení, ×200. Měřítko=20 μm. (H) Intenzita fluorescence byla analyzována pomocí Image-Pro Plus. Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SD (n=3). *p < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" vs.="" kontrolní="" skupina;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" vs.="" skupina="" rankl.="" 3.5.="" cdp="" inhibuje="" rankl-indukovanou="" aktivaci="" nf-kb="" a="" mapk="" signálních="" drah="" abychom="" objasnili="" mechanismy="" zahrnuté="" v="" cdp-indukované="" inhibici="" diferenciace="" osteoklastů,="" zkoumali="" jsme="" dopad="" léčby="" cdp="" na="" dráhy="" nf-kb="" a="" mapk.="" výsledky="" ukázaly,="" že="" léčba="" cdp="" měla="" supresivní="" účinky="" na="" degradaci="" iκb="" a="" fosforylaci="" p65="" v="" závislosti="" na="" dávce="" (obr.="" 5a="" a="" b).="" fosforylace="" tří="" členů="" rodiny="" mapk,="" konkrétně="" extracelulární="" signálem="" regulovaná="" kináza="" (erk),="" c-jun="" n-terminální="" kináza="" (jnk)="" a="" p38,="" byly="">
Diskuse
Osteoporóza je běžné a degenerativní onemocnění kostí. V současné době existuje mnoho léků chemické syntézy používaných v klinické léčbě osteoporózy, jako je estrogen a bisfosfonát. Dlouhodobé užívání těchto léků však postupně oslabí klinickou účinnost a dokonce způsobí mnoho závažných vedlejších účinků, včetně zvýšeného rizika rakoviny vaječníků, prsu a endometria a osteonekrózy čelisti (Beral, 20}03 Khan a kol., 2009; Lacey a kol., 2002). Zatímco v této studii jsme vybrali CDP, účinnou složku extrahovanou z CD, jako terapeutické činidlo a prokázali jsme, že CDP má ochranný účinek proti úbytku kostní hmoty u OVX myší a inhibuje tvorbu a funkci osteoklastů indukovanou RANKL. Mezitím, podle teorie "ledviny řídící kost" tradiční čínské medicíny, je ztráta kostní hmoty připisována nedostatkům ledvin. Bylo prokázáno, že CD jako léčivá potravina tonizující ledviny poskytuje účinnou léčbu osteoporózy (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li a Zhang, 2016). CDP extrahovaný z této přírodní byliny je tedy lepší a bezpečnější lékovou možností. V současné době je myší model OVX klasickým modelem postmenopauzálního úbytku kostní hmoty u žen, který zkoumá příčiny úbytku kostní hmoty a provádí intervenci (Wehrle et al., 2015). V souladu s tím jsme provedli bilaterální ooforektomii na samicích myší C57BL/6J, abychom vytvořili model osteoporózy. V předchozích studiích byly dávky CDP podávané zvířatům 50–200 mg/kg (nízká dávka) a 1800 mg/kg (vysoká dávka) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). Zde byla vysoká dávka CDP u myší 600 mg/kg, což vycházelo z vysoké klinické dávky 30 g CD v odvaru; je tedy podobný současné klinické praxi. V této studii léčba CDP významně inhibovala OVX-indukovaný nárůst tělesné hmotnosti, což je běžný jev pozorovaný u OVX myší (Davis et al., 2019). Pomocí mikro-CT skenování a 3D rekonstrukce jsme zjistili, že OVX vedlo ke znatelnému snížení BMD, BV/TV, BS/TV a Tb.N a zvýšení Tb.Sp, zatímco léčba CDP zvrátila všechny tyto změny . Zejména ve srovnání s pozitivním lékem by CDP mohla významně zlepšit BMD myší OVX, což je důležitý marker kvality kostí a používá se k vyjádření stupně osteoporózy (Fuggle et al., 2019), což naznačuje, že CDP má výhodu nad pozitivním lékem při zlepšování BMD. Kromě toho histologické výsledky ukázaly, že léčba CDP by mohla snížit zvýšené množství TRAcP-pozitivních osteoklastů indukované OVX. Tyto výsledky naznačují, že podávání CDP účinně zmírnilo ztrátu kostní hmoty u osteoporózy indukované OVX, pravděpodobně inhibicí tvorby osteoklastů. V souladu s výše uvedenými výsledky jsme zjistili, že CDP v závislosti na dávce inhibuje tvorbu a funkci osteoklastů indukovanou RANKL, zatímco CDP má v našich experimentech in vitro malý účinek na proliferaci prekurzorových buněk osteoklastů indukovanou M-CSF. Vazba RANKL a RANK může vést k náboru TRAF6 a následné aktivaci několika downstream signálních drah, jako jsou NF-KB a MAPK (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). Signální dráha NF-κB hraje důležitou roli v regulaci diferenciace osteoklastů a umlčení genů kódujících klíčové proteiny v této dráze může vést k abnormálnímu vývoji kostí (Leibbrandt & Penninger, 2008). Je dobře známo, že NF-KB je přítomen v cytoplazmě nestimulovaných buněk v komplexu s IkB, ale po stimulaci RANKL rychle vstupuje do jádra (Boyle et al., 2003). Uvolněný IκB je pak rychle degradován, zatímco NF-κB aktivuje specifickou genovou transkripci, čímž podporuje diferenciaci, zrání a apoptózu osteoklastů (Abdelmagid et al., 2015). V této studii výsledky ukázaly, že léčba CDP potlačila RANKL indukovanou aktivaci signální dráhy NF-κB, jak bylo prokázáno inhibicí degradace IκB a fosforylací p65 v závislosti na dávce, což může zahrnovat jeho antiosteoklastogenní účinek . Kromě toho se signální dráha MAPK, včetně ERK, JNK a p38, úzce podílí na osteoklastogenezi indukované RANKL (Li et al., 2002). Kromě toho mohou dominantní inhibitory p38 a JNK zabránit osteoklastogenezi indukované RANKL (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), zatímco ERK hraje významnou roli v přežití osteoklastů (Miyazaki et al., 2000). Je dobře známo, že RANKL aktivuje signální dráhu MAPK zvýšením fosforylace ERK, JNK a p38 (Mizukami et al., 2002). V naší studii jsme prokázali, že CDP potlačil RANKL-indukovanou fosforylaci klíčových proteinů v signální dráze MAPK. Celkově vzato tyto výsledky naznačují, že inhibice aktivace signálních drah NF-KB a MAPK přispívá k inhibičnímu účinku CDP proti osteoklastogenezi. Aktivace signálních drah NF-KB a MAPK podporuje expresi několika klíčových transkripčních faktorů, jako je buněčný onkogen fos, aktivátorový protein 1 a NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, důležitý člen rodiny NFAT, se podílí na diferenciaci terminálních osteoklastů jako hlavní regulátor transkripce (Asagiri et al., 2005). Bylo hlášeno, že embryonální kmenové buňky s deficitem NFATc{64}} se nemohou pod stimulací RANKL diferencovat na osteoklasty a ektopická exprese NFATc1 způsobuje, že prekurzorové buňky podléhají diferenciaci a obcházejí signalizaci RANKL, což naznačuje, že NFATc1 má kritickou roli v diferenciace osteoklastů (Takayanagi et al., 2002). Výsledky naší studie ukázaly supresivní účinek CDP na expresi NFATc1 a jeho následujícího proteinu CTSK. Je zajímavé, že jsme pozorovali, že hladina proteinové exprese NFATc1 se nejprve zvýšila a poté snížila, přičemž nejvyšší hladiny dosáhla 5. den po stimulaci RANKL. To bylo v souladu s výsledky Baek et al. (2014), kteří pozorovali degradaci NFATc1 indukovanou M-CSF během pozdní fáze osteoklastogeneze prostřednictvím Cbl-indukované ubikvitinace NFATc1 způsobem závislým na Src kináze. Výsledky imunofluorescenčního testu konzistentně podporovaly inhibiční účinek CDP na aktivaci transkripce NFATc1. Kromě toho, geny specifické pro osteoklasty, včetně CTSK, Acp5, Mmp9 a Atp6v0d2, jsou všechny regulovány přímo NFATc1 (Y. Kim et al., 2005), byly potlačeny pomocí CDP. Tato zjištění ilustrují, že NFATc1 je cílem inhibičního účinku CDP na signální dráhy NF-KB a MAPK.
Závěr
V souhrnu jsme extrahovali a purifikovali aktivní polysacharid z CD a prokázali, že CDP vykazoval ochranný účinek na osteoporózu indukovanou OVX a zmírnil ztrátu kostní hmoty potlačením aktivity a funkce osteoklastů. Kromě toho může CDP inhibovat diferenciaci a funkci osteoklastů indukovanou RANKL tím, že interferuje se signálními cestami NF-KB a MAPKs a následně ovlivní downstream aktivaci NFATc1. Závěrem lze říci, že naše zjištění poskytují základ pro rozšíření a aplikaci CDP v léčbě osteoporózy.
Tento článek pochází ze seznamů obsahu dostupných na domovské stránce časopisu ScienceDirect Journal of Functional Foods: www.elsevier.com/locate/jff
