Extrakt z Cistanche Deserticola zvyšuje tvorbu kostí v osteoblastech
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Te-Mao Lia, Hsin-Chih Huangb, Chen-Ming Suc, Tin-Yun Hoa, Chi-Ming Wua, Wen-Chi Chend, Yi-Chin Fonga,ea Chih-Hsin Tangf,c
Abstraktní
Cíle:Zkoumali jsme účinekCistanche deserticola Ma. (CD) na tvorbu kosti kultivovanými osteoblasty.MetodyTest tvorby mineralizovaných uzlin byl použit ke zkoumání in vitro účinků CD na tvorbu kosti. Exprese mRNA alkalické fosfatázy (ALP), kostních morfogenetických proteinů (BMP)-2 a osteopontinu (OPN) byla analyzována kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase. Mechanismus účinku CD extraktu byl zkoumán pomocí Western blotu. In vivo antiosteoporotický účinek CD extraktu byl hodnocen u myší po ovariektomii.Klíčové poznatkyCD extrakt neměl žádný vliv na proliferaci, migraci nebo hojení ran kultivovaných osteoblastů, ale zvýšil ALP, BMP{0}} a OPN mRNA a mineralizaci kostí. Inhibitory mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) nebo nukleárního faktoru (NF)-kB snižovaly tvorbu kostí indukovanou CD extraktem a expresi ALP, BMP-2 a OPN. CD extrakt však neovlivnil osteoklastogenezi. Kromě toho CD extrakt zabránil ztrátě kostní hmoty vyvolané ovariektomií in vivo.ZávěryCD může být novým činidlem pro tvorbu kostí pro léčbu osteoporózy.
Úvod
Kost je komplexní tkáň složená z několika typů buněk, které podstupují nepřetržitý proces obnovy a opravy nazývaný „remodelace kostí“. Dva hlavní typy buněk odpovědné za remodelaci kosti jsou osteoklasty, které resorbují kost, a osteoblasty, které tvoří novou kost. Remodelaci kostí reguluje několik systémových hormonů (např. parathormon, 1, 25-hydroxyvitamin D3, pohlavní hormony a kalcitonin) a lokální faktory (např. oxid dusnatý, prostaglandiny, růstové faktory a cytokiny).[1]
Osteoporóza vzniká, když resorpce a tvorba kosti jsou nekoordinované a nadměrný rozpad kosti převyšuje kostní stavbu.[2] Současná léčba osteoporózy zahrnuje bisfosfonáty, kalcitonin a estrogen, což jsou inhibitory kostní resorpce, které udržují kostní hmotu inhibicí aktivity osteoklastů.[3] Účinek těchto léků na zvýšení nebo obnovení kostní hmoty je však relativně malý, rozhodně ne více než 2 procenta ročně.[3] Existuje proto potřeba látek pro stavbu kostí, jako je teriparatid, které stimulují novotvorbu kosti a opravují změnu v trabekulární mikroarchitektuře, která je charakteristická pro zavedenou osteoporózu.[4,5] Protože tvorba nové kosti je primárně funkcí osteoblasty, látky, které působí buď zvýšením proliferace buněk osteoblastické řady nebo indukcí diferenciace osteoblastů, mohou zvýšit tvorbu kosti.[5,6]
Ačkoli mechanismy osteoporózy zůstávají nejasné, pravděpodobně souvisí se sníženou dostupností nebo účinky růstových faktorů kostí, jako jsou kostní morfogenetické proteiny (BMPs).[7] BMP, které jsou strukturně příbuzné superrodině trans-formujícího růstového faktoru-b, byly původně identifikovány podle své schopnosti vyvolat ektopickou tvorbu kostí u hlodavců.[8] BMP hrají důležitou roli při tvorbě kosti a diferenciaci kostních buněk tím, že stimulují aktivitu alkalické fosfatázy (ALP) a také syntézu proteoglykanu, kolagenu a osteopontinu (OPN).[9] Nedávná studie nalezla souvislost mezi osteoporózou a specifickými polymorfismy v genech BMP-2, ALP a OPN, což naznačuje, že jsou spojeny s rozvojem osteoporózy.[10]
Cistanche deserticola Ma.(Orobanchaceae; zkráceně CD) je původní bylina v Číně a je široce používána v tradiční medicíně jako terapeutické činidlo díky svým sedativním, analgetickým a imunostimulačním vlastnostem.[11] Moderní farmakologické studie prokázaly, že CD extrakty mohou stimulovat imunitu[12], vychytávat volné radikály[13] a zvyšovat aktivitu superoxiddismutázy[14]. Protizánětlivé a antioxidační látky mají potenciál léčit osteoporózu zvýšením kostní tvorby a/nebo potlačením kostní resorpce.[15,16] Účinek CD na funkci kostních buněk však dosud nebyl stanoven. Zde uvádíme, že CD extrakt neovlivnil proliferaci, migraci nebo aktivitu hojení ran kultivovaných osteoblastů, ale zvýšil expresi ALP, BMP-2 a OPN a mineralizaci kostí. Navíc jsme ukázali, že mitogenem aktivovaná proteinkináza (MAPK) a signální dráhy nukleárního faktoru (NF)-kB se mohou podílet na CD-zprostředkovaném zvýšení genové exprese a mineralizace kostí. Naproti tomu CD extrakt nepotlačoval osteoklastogenezi in vitro. Je pozoruhodné, že léčba myší CD extraktem zabránila ztrátě kostní hmoty vyvolané ovariektomií in vivo. Naše data proto naznačují, že CD může být použito ke stimulaci tvorby kosti pro léčbu osteoporózy.
Cistanche deserticola
Materiály a metody
Extrakt a materiály Cistanche deserticola
CD extrakt byl zakoupen od Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). Extrakce a izolace CD byly sledovány, jak bylo popsáno dříve (na základě spektrálních dat identifikovali chemické složení zahrnující beta-sitosterol, daukosterol, kyselinu jantarovou, triakontanol, akteosid, betain a polysacharid).[17] Králičí polyklonální protilátky specifické pro p-extracelulární signálem regulované kinázy (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminální kinázy (JNK), JNK, p-p65 a p65 byly zakoupeny od Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, USA). Souprava osteokalcin ELISA byla zakoupena od Biosource Technology (Nivelles, Belgie). C-koncové telopeptidy kolagenové ELISA soupravy typu I byly získány od Cross Laps (Herlev, Dánsko). Dominantně-negativní mutant p38 poskytl Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA). Dominantně-negativní mutant JNK byl poskytnut Dr. M. Karin (University of California, San Diego, USA). Dominantně-negativní mutant ERK2 poskytl Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Všechna ostatní činidla byla získána od Sigma-Aldrich (St Louis, USA).
Buněčná kultura
Buněčná linie myších osteoblastů MC3T3-E1 byla zakoupena od American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Buňky byly kultivovány v 95 procentech vzduchu, 5 procentech CO2 s a-MEM, který byl doplněn 20 mm HEPES a 10 procenty tepelně inaktivovaného fetálního telecího séra, 2 mm glutaminu, penicilinu (100 U/ml) a streptomycinu (100 mg /ml).
Měření tvorby mineralizovaných uzlíků
Tvorba mineralizovaných uzlin byla hodnocena tak, jak je popsáno.[18] Stručně řečeno, osteoblasty byly kultivovány v médiu obsahujícím vitamín C (50 mg/ml) a b-glycerofosfát (10 mm) po dobu dvou týdnů a médium bylo měněno každé tři dny. Po inkubaci s CD extraktem po dobu 12 dnů byly buňky dvakrát promyty 20 mm Tris-pufrovaným fyziologickým roztokem obsahujícím
0,15 m NaCl (pH 7,4), fixováno v ledově chladném 75% (v/v) ethanolu po dobu 30 minut a sušeno na vzduchu. Depozice vápníku byla stanovena pomocí barvení alizarinovou červení-S. Stručně, ethanolem fixované buňky a matrice byly barveny po dobu 1 hodiny 40 mm alizarinovou červení-S (pH 4,2) a důkladně opláchnuty vodou. Navázané barvivo bylo eluováno 10% (hmotn./obj.) cetylpyridiniumchloridem a alizarinová červeň-S ve vzorcích byla kvantifikována měřením absorbance při 550 nm a porovnána se standardní křivkou. Jeden mol alizarinové červeně-S selektivně váže přibližně dva moly vápníku.
Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase
Celková RNA byla extrahována z osteoblastů pomocí soupravy TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). Reverzní transkripce byla provedena za použití 2 mg celkové RNA a oligo(dT) primeru.[19,20] Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qPCR) byla provedena pomocí TaqMan® onestep PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Byla přidána celková cDNA (100 ng na 25-ml reakce) se sekvenčně specifickými primery a sondami Taqman®. Všechny primery a sondy cílových genů byly zakoupeny komerčně, včetně b-aktinu jako vnitřní kontroly (Applied Biosystems). Testy qPCR byly provedeny v triplikátech na sekvenčním detekčním systému StepOnePlus (Applied Biosystems). Podmínky cyklování byly 10-minutová aktivace polymerázy při 95 stupních následovaná 40 cykly při 95 stupních po dobu 15 sekund a 60 stupních po dobu 60 sekund. Prahová hodnota byla nastavena nad kontrolním pozadím bez šablony a v rámci lineární fáze amplifikace cílového genu pro výpočet počtu cyklů, ve kterých byl detekován transkript (označeno CT).
Western blot analýza
Buněčné lyzáty byly připraveny tak, jak bylo popsáno dříve.[21,22] Proteiny byly rozděleny pomocí SDS-PAGE a přeneseny na polyvinyldifluoridové membrány Immobilon (Millipore, Billerica, USA). Bloty byly blokovány 4% hovězím sérovým albuminem po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a poté byly sondovány králičími anti-lidskými protilátkami proti p-65 nebo p-p65 (1:1000) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Po třech promytích byly bloty inkubovány s peroxidázou konjugovanou oslí anti-králičí sekundární protilátkou (1:1000) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Bloty byly vizualizovány zesílenou chemiluminiscencí za použití filmu X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, USA).
Osteoporóza vyvolaná ovariektomií
Pro tuto studii byly použity samice myší ICR, staré čtyři týdny, 22~28 g. Myším byla provedena ovariektomie bilaterálně pod anestezií trichloracetaldehydem (100 mg/kg) a kontrolní myši byly pro srovnání falešně operovány (Sham). Minerální hustota kostí a obsah kostních minerálů byly měřeny po orálním podávání různých koncentrací CD extraktů každé dva dny po dobu čtyř týdnů. Celková tělesná hustota kostních minerálů a obsah kostních minerálů byly stanoveny pomocí dvouenergetického rentgenového absorbéru (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) s použitím režimu pro malé subjekty, jak bylo popsáno dříve.[18, 23] Všechny protokoly byly v souladu s institucionálními směrnicemi a byly schváleny Výborem pro péči o zvířata Čínské lékařské univerzity.
Statistická analýza
Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru Prism 4.{6}}1. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Uvedené hodnoty jsou průměr ± SEM. Statistická analýza mezi dvěma vzorky byla provedena pomocí Studentova t-testu. Statistická srovnání více než dvou skupin byla provedena pomocí jednosměrné analýzy rozptylu s Bonfer-Roniho posthoc testem. Ve všech případech bylo P < 0,05="" považováno="" za="">
Extrakt z Cistanche deserticola
Výsledek
Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje mineralizaci kostí osteoblasty
Přidání CD extraktu po dobu 24 nebo 48 hodin neovlivnilo proliferaci myších osteoblastových buněk MC3T3-E1 v testu MTT (data nejsou uvedena). Protože diferenciace osteoblastů je komplexní proces zahrnující buněčnou proliferaci a migraci, testovali jsme také migrační schopnost buněk MC3T3-E1 po ošetření CD extraktem. Pomocí Transwell a testů hojení ran jsme zjistili, že CD extrakt neovlivnil migraci osteoblastů (data nejsou uvedena). Tvorba mineralizovaných uzlů je jedním z markerů zrání osteoblastů. Barvení alizarinovou červení S ukázalo, že mineralizované uzliny se vytvořily, když byly osteoblasty kultivovány po dobu dvou týdnů v médiu obsahujícím vitamín C (50 mg/ml) a b-glycerofosfát (10 mm), a to bylo zvýšeno v závislosti na koncentraci přidáním CD (obrázek 1a). Proto CD extrakt indukoval tvorbu kostních nodulů kultivovanými osteoblasty, ale ne jejich proliferaci nebo migraci. Také jsme zkoumali roli CD extraktu v RANKL-indukované osteoklastogenezi, ale nenašli jsme žádný účinek (data nejsou uvedena).
Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje expresi alkalické fosfatázy, kostního morfogenetického proteinu-2 a osteopontinu v kultivovaných osteoblastech
Diferencované osteoblasty vykazují zvýšenou aktivitu ALP, která koreluje s vysokou úrovní exprese enzymů.[18] Zjistili jsme, že léčba CD extraktem po dobu 72 hodin významně zvýšila aktivitu ALP osteoblastů (obrázek 1b). Vzhledem k zásadní roli BMP-2, ALP a OPN v diferenciaci osteoblastů jsme testovali, zda extrakt CD uplatňuje svůj účinek na diferenciaci osteoblastů regulací exprese BMP-2, ALP a OPN. Ošetření buněk extraktem CD zvýšilo expresi mRNA ALP, BMP-2 a OPN způsobem závislým na koncentraci (obrázek 1c), což dokazuje, že extrakt CD indukoval diferenciaci osteoblastů upregulací ALP, BMP-2 a výraz OPN.
Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje tvorbu kostních uzlů prostřednictvím mitogenem aktivované proteinkinázové dráhy
Bylo hlášeno, že MAPK hraje důležitou roli při tvorbě kosti [24,25], takže jsme dále zkoumali, zda je tato signální dráha zapojena do mineralizace kostí indukované CD extraktem. Předběžné ošetření buněk inhibitorem ERK U0126, inhibitorem p38 SB203580 nebo inhibitorem JNK SP600125 snížilo mineralizaci kostí zvýšenou CD extraktem (obrázky 2a, 3a a 4a). Kromě toho inhibitory také blokovaly CD extraktem indukovanou expresi ALP, BMP-2 a OPN (obrázky 2b–4c). Transfekce buněk mutantou ERK2, p38 nebo JNK snížila nárůst CD extraktu v expresi mRNA ALP, BMP-2 a OPN (obrázky 2c, 3c a 4c). Dále jsme přímo zkoumali aktivaci ERK, p38 a JNK po ošetření CD extraktem. Inkubace buněk s CD extraktem indukovala fosforylaci ERK, p38 a JNK (obrázky 2d, 3d a 4d). Proto ERK, p38 a JNK zprostředkovávají zvýšenou tvorbu kosti indukovanou ošetřením osteoblastů CD.
Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje tvorbu kostních uzlíků cestou nukleárního faktoru-kB
Jak již bylo zmíněno, aktivace NF-kB je nezbytná pro tvorbu kosti.[26,27] Dále jsme ošetřili osteoblasty inhibitory NF-kB pyrrolidindithiokarbamátem (PDTC) a N-tosyl-L-fenylalanin chlormethylketonem (TPCK) byly zakoupeny od Calbiochem (Darmstadt, Německo), aby se zjistilo, zda se aktivace NF-kB podílí na mineralizaci kostí indukované CD extraktem. Obrázek 5a ukazuje, že předběžné ošetření osteoblastů PDTC nebo TPCK inhibovalo tvorbu kostních uzlin indukovanou CD extraktem a také snížilo zvýšení exprese ALP, BMP-2 a OPN (obrázek 5b a 5c). Fosforylace podjednotky NF-kB p65 je indikátorem aktivace NF-kB;[28] v souladu s tím jsme zjistili, že extrakt CD zvýšil fosforylaci p65 v osteoblastech (obrázek 5d). Tyto výsledky ukázaly, že aktivace NF-kB je důležitá pro expresi ALP, BMP-2 a OPN a tvorbu kostních nodulů indukovanou CD extraktem.
Inhibice úbytku kostní hmoty extraktem Cistanche deserticola u ovariektomizovaných myší
Pro zkoumání účinku CD extraktu na úbytek kostní hmoty byla u samic myší indukována ovariektomií osteoporóza. Jak se očekávalo, myši po ovariektomii vykazovaly sníženou celkovou tělesnou hustotu kostních minerálů a obsah kostních minerálů (obrázek 6a a 6b). Léčba CD extraktem po dobu čtyř týdnů inhibovala ztrátu kostní minerální denzity a kostního minerálního obsahu způsobem závislým na dávce (obrázek 6a a 6b). Krevní koncentrace ALP mohou odrážet osteoblastickou aktivitu.[29] Jak je znázorněno na obrázku 6c, CD extrakt inhiboval pokles aktivity ALP v séru vyvolaný ovariektomií. Kromě toho CD extrakt také zvýšil hladinu osteokalcinu, markeru tvorby kosti, a snížil hladinu C-terminálních telopeptidů kolagenu typu I, markeru kostní resorpce (obrázek 6d a 6e). Tato zjištění tak podporují potenci a účinnost CD extraktu při prevenci úbytku kostní hmoty in vivo.
Diskuse
Cistanche deserticolaMa, původní bylina v Číně, je široce používána v tradiční medicíně pro různé terapeutické léčby díky své sedativní, analgetické a imunostimulační aktivitě.[11–15] Zde jsme ukázali, že extrakt CD indukoval mineralizaci kostí v kultivovaných osteoblastech, ale ano. neovlivňují jejich buněčnou migraci nebo proliferaci. Navíc jsme zjistili, že ALP, BMP-2 a OPN jsou cílové proteiny signalizace indukované CD extraktem, která vyžaduje aktivaci ERK, p38, JNK a NF-kB.
Kost je komplexní tkáň složená z několika typů buněk, které neustále procházejí procesem obnovy a opravy.[30] Když je resorpce a tvorba kosti nevyvážená, rozpad kosti převáží nad tvorbou kosti a výsledkem je osteoporóza.[30] Použili jsme ovariektomizované myši ke zkoumání antiosteoporotického účinku CD extraktu. Myši po ovariektomii měly sníženou celkovou tělesnou hustotu kostních minerálů a obsah kostních minerálů, což bylo zmírněno ošetřením CD extraktem. CD extrakt také zvýšil sérové hladiny osteogenního markeru ALP a osteokalcinu. Proto je CD látkou pro tvorbu kosti, která zabraňuje ztrátě kostní hmoty způsobené ovariektomií in vivo.
Ačkoli mechanismy osteoporózy nejsou zcela jasné, pravděpodobně souvisí se sníženou dostupností nebo sníženými účinky růstových faktorů kostí, jako jsou ALP, BMP{0}} a OPN. Tyto tři faktory hrají důležitou roli v procesu tvorby a remodelace kosti[31] a bylo dobře zdokumentováno, že stimulace diferenciace buněk osteoblastů je charakterizována především zvýšenou expresí ALP, BMP-2 a OPN.[32] ] V této studii jsme zjistili, že CD extrakt zvýšil expresi ALP, BMP-2 a OPN a zvýšil mineralizaci kostí. CD extrakt tedy zprostředkovává tvorbu kosti zčásti zvýšením exprese ALP, BMP-2 a OPN.
Bylo popsáno, že p38 se podílí na regulaci exprese ALP během diferenciace osteoblastických buněk;[33] podobně je ERK1/2 důležitý pro proliferaci a diferenciaci osteoblastů.[34,35] JNK se podílí na tvorbě osteoklastů. .[36] Ukázali jsme zde, že CD extraktem indukovaná fosforylace ERK, p38 a JNK a inhibitory těchto enzymů antagonizovaly potenciaci kostní mineralizace zprostředkovanou CD extraktem, což naznačuje, že aktivace ERK, p38 a JNK hrají povinnou roli při tvorbě kostí indukované CD extraktem. osteoblasty. Kromě toho enzymové inhibitory a dominantně negativní mutanty ERK, p38 a JNK snižovaly expresi CD extrahovaných ALP, BMP-2 a OPN. Tato data naznačují, že pro zvýšení exprese a zrání ALP, BMP-2 a OPN způsobené CD extraktem v osteoblastech je nutná aktivace drah ERK, p38 a JNK. Bylo popsáno, že ERK zvyšuje proliferaci a diferenciaci osteoblastů.[34,35] Nezjistili jsme však vliv CD extraktu na proliferaci osteoblastů. Proto jiné dráhy mohly působit proti ERK efektu po stimulaci CD extraktem nebo být nezbytné pro proliferaci. V tomto ohledu jsme zjistili, že inhibitory PI3K a Akt také snižují mineralizaci kostí indukovanou CD extraktem a expresi mRNA ALP, BMP-2 nebo OPN (data nejsou uvedena). Proto mohou být tyto dráhy vyžadovány pro tvorbu kosti indukovanou CD extraktem.
Bylo prokázáno, že NF-kB řídí funkci osteoblastů v kosti.[37] Výsledky této studie ukazují, že aktivace NF-kB přispívá k mineralizaci kostí indukované extraktem CD a expresi ALP, BMP-2 a OPN v kultivovaných osteoblastech a že inhibitory signální dráhy závislé na NF-kB (PDTC a TPCK ) inhibovala mineralizaci kostí indukovanou CD extraktem a expresi ALP, BMP-2 a OPN. p65 je fosforylován na Ser536 řadou kináz v několika signálních drahách, což zvyšuje potenciál transaktivace p65.[38] Výsledky této studie ukázaly, že CD extrakt zvýšil fosforylaci p65. Celkově vzato tyto výsledky naznačují, že aktivace NF-kB je nutná pro tvorbu kosti indukovanou CD extraktem v kultivovaných osteoblastech. Také jsme zjistili, že inhibitory ERK, p38 a JNK zvrátily aktivitu NF-kB luciferázy indukovanou CD extraktem (data nejsou uvedena), což je v souladu s tím, že tyto enzymy jsou upstream mediátory aktivace NF-kB indukované CD extraktem. Extrakt CD tedy indukuje tvorbu kosti prostřednictvím drah ERK/p38/JNK/ a NF-kB.
Závěry
Tato studie prokázala, že CD extrakt indukuje diferenciaci a zrání osteoblastů, ale ne proliferaci nebo migraci. CD extrakt také zvýšil expresi ALP, BMP-2 a OPN a mineralizaci kostí. Ukázali jsme, že dráhy ERK, p38, JNK a NF-kB se podílejí na tvorbě kostí zprostředkované CD extraktem a expresi ALP, BMP-2 a OPN. Kromě toho CD extrakt zabránil in vivo ztrátě kostní hmoty vyvolané ovariektomií. Proto může být CD prospěšné při stimulaci tvorby kosti při léčbě osteoporotických onemocnění.
