Aktivní flavonoidní složky a potenciální mechanismy vzdušných částí Glycyrrhiza Uralensis pro chronickou prostatitidu na základě farmakologie sítě a experimentální validace
Nov 06, 2025
Abstraktní:
Cíl: Stanovit účinné látky a možné mechanismy účinku flavonoidů z nadzemních částí Cistanche u chronické prostatitidy. Metody: Ultravýkonná kapalinová chromatografie – kvadrupól – elektrostatické pole Hmotnostní spektrometrie Orbitrap s vysokým rozlišením (UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS) byla použita k identifikaci hlavních flavonoidních složek v alkoholovém extraktu nadzemních částí Cistanche. Síťová farmakologie a molekulární dokování byly použity k predikci hlavních složek a klíčových cílů souvisejících s chronickou prostatitidou. Krysí model chronické prostatitidy byl indukován karagenanem a histopatologické změny v prostatách potkanů byly pozorovány barvením HE. Sérové hladiny DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA a TNF- byly měřeny pomocí ELISA, aby se vyhodnotila terapeutická účinnost extraktu. Výsledky: V alkoholovém extraktu bylo identifikováno celkem 44 flavonoidů. Síťová farmakologie ukázala, že základní složky, včetně glycyrrhizinu, trichothecenových isoflavonů, pichlavého manzanita florifera a glycyrrhizinu (předpokládá se jako reprezentativní složky), vykazují účinky proti chronické prostatitidě působením na klíčové cíle, jako jsou AKT1, TNF, VEGFA, EGFR, a tím regulují související signální dráhy. Molekulární dokování ukázalo příznivé vazebné afinity mezi základními složkami a klíčovými cíli. Pokusy na zvířatech prokázaly, že alkoholový extrakt z nadzemních částí Cistanche měl jasný terapeutický účinek na chronickou prostatitidu u potkanů. Závěr: Účinnost nadzemních částí Cistanche proti chronické prostatitidě je ověřena. Aktivní složky, včetně ostnitého aristolochicinu, trichostatinových isoflavonů a glycyrrhizinu, mohou působit prostřednictvím signální dráhy PI3K–AKT k modulaci EGFR, AKT1 a MMP9.
Klíčová slova: vzdušné části Cistanche; chronická prostatitida; flavonoid; UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS; síťová farmakologie
cistanche přínosy pro zdraví prostaty
Zavedení:
Tradiční čínská léčivá bylina Cistanche (Cistanche spp.) obsahuje sušený léčivý materiál primárně využívaný v TCM. Jedná se o důležitý hromadný léčivý zdroj v Číně s funkcemi, jako je tonizace a podpora tělesných funkcí, čištění tepla a detoxikace, zmírnění bolesti a harmonizující receptury, a běžně se používá jako doplňková složka v mnoha receptech s více bylinami. Poptávka na trhu je vysoká jak na domácím, tak mezinárodním trhu. Nadzemní části, včetně stonků a listů, jsou bohatým zdrojem, který čeká na vývoj a využití.
Chronická prostatitida je časté urologické onemocnění u mužů v mladém a středním věku. Mezi klinické příznaky patří bolest v podbřišku nebo pánvi, dysurie a frekvence močení. Bez včasné léčby může vést k sexuální dysfunkci, jako je předčasná ejakulace a erektilní dysfunkce, což vážně ovlivňuje fyzické a duševní zdraví mužů.
Flavonoidy se hojně vyskytují ve vzdušných částech Cistanche a vykazují pozoruhodné protizánětlivé a protinádorové účinky. Předchozí studie ukázaly, že nadzemní části jsou bohaté na flavonoidy s protinádorovými a protizánětlivými účinky. Obohacení flavonoidů z nadzemních částí prokázalo dobrou antioxidační aktivitu in vitro. Farmakodynamický výzkum také zjistil, že flavonoidy z nadzemních částí mají preventivní a léčebné účinky na chronickou prostatitidu.
V této studii byl UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS použit k profilování flavonoidů v alkoholovém extraktu nadzemních částí Cistanche. Síťová farmakologie byla použita k predikci klíčových cílů a cest pro chronickou prostatitidu, molekulární dokování bylo použito k odvození mechanismů a byly provedeny experimenty na zvířatech k ověření antichronické prostatitidy, což poskytlo reference pro následný vývoj léčiv a klinickou aplikaci.
Materiály
Zvířata
Samci potkanů SD stupně SPF (n=24), stáří 6–7 týdnů, tělesná hmotnost 230–250 g [Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd.; výrobní licence: SCXK (Jing) 2019-0010]. Zvířata byla umístěna ve zvířecím zařízení SPF v Experimentálním zvířecím centru Pekingské univerzity čínské medicíny. Protokol byl schválen institucionální etickou komisí (č. schválení: BUCM-2023110204-4271).
Nástroje
Ultimate 3000 UPLC systém (Dionex, USA)
Thermo Q Exactive Plus hmotnostní spektrometr s vysokým rozlišením (Thermo Fisher Scientific, USA)
KH500DE digitální ultrazvuková čistička (Kunshan Hechuang)
Elektronická váha FA2004N (Beijing Sartorius)
H1650 nízkorychlostní chlazená odstředivka (Changsha Xiangyi)
RE-5023 rotační výparník (Shanghai Yarong)
Elektronický topný plášť s řízenou teplotou (Tianjin Teste)
Multiskan MK3 čtečka mikrodestiček (Thermo Scientific, Shanghai)
B032 fluorescenční invertovaný biologický mikroskop (Nikon Instruments, Shanghai)
N5000 UV spektrofotometr (Shanghai Youke)
Reagencie
Nadzemní části Cistanche (stonky, listy a malé množství lusků) byly sklizeny v září 2019 z okresu Guazhou, město Jiuquan, provincie Gansu, a ověřeny prof. Wangem Wenquanem (Institut pro vývoj léčivých rostlin, CAMS) jako Cistanche spp.
Další činidla: Ulatan (Shandong Keyuan Biochemical Co., šarže C15887472); karagenan (Beijing Solarbio, šarže 20220601); tablety Qianliekang Pule'an (Zhejiang Conba Pharmaceutical); sodná sůl karboxymethylcelulózy (CMC-Na; Shanghai YuanYe, šarže S14016); soupravy ELISA pro potkaní DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA a TNF- (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology); Multiskan MK3 čtečka mikrodestiček (Thermo Scientific); tkáňový fixátor (Guangzhou Shuopu, šarže 23257838); ethanol (Beijing Chemical Works, analytická čistota); methanol, kyselina mravenčí, acetonitril (Fisher Scientific, MS stupeň); voda (Wahaha Group). Referenční standardy (čistota > 98 %, Shanghai YuanYe): liquiritigenin, puerarin, isoorientin II, naringenin, isoquercitrin, isoliquiritin, ononin, isoquercitrin, quercetin, astragalin, kaempferol, formononetin.
Metody a výsledky
2.1 Chemické profilování alkoholového extraktu z nadzemních částí Cistanche
2.1.1 Příprava vzorku
Příslušná množství nadzemních částí byla extrahována 70% ethanolem. Extrakt byl zahuštěn do sucha. Zbytek byl ultrazvukem rozpuštěn ve vodě po dobu 20 minut, centrifugován při 3000 r·min-1 po dobu 15 minut a supernatant byl zakoncentrován do sucha. Vhodné množství vysušeného vzorku bylo umístěno do 5ml odměrné baňky a doplněno na objem methanolem, aby se získal testovaný roztok.
2.1.2 Chromatografické a hmotnostní spektrometrické podmínky
Podmínky UPLC: kolona ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 mm x 100 mm, 1,7 um); mobilní fáze A, acetonitril; mobilní fáze B, 0,5% kyselina mravenčí ve vodě; gradientová eluce (0-20 min, 5%-20% A; 20-70 min, 20%-30% A); průtok 0,2 ml·min−1; injekční objem 2 μl; teplota kolony 30 stupňů.
Podmínky MS: zdroj HESI; kladné a záporné iontové módy; akvizice plného skenování; rozprašovací napětí +3.2 kV (kladné) a −3,0 kV (záporné); kapilární teplota 320 stupňů; plášťový plyn 40 arb; pomocný plyn 15 arb; pomocný ohřívač 350 stupňů; MS rozlišení 70 000; MS/MS rozlišení 17 500; rozsah skenování m/z 100–1500.
Seznam specifikací Cistanche
2.1.3 Identifikace součásti
Vzorek vzdušné části byl analyzován pomocí UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS za účelem získání TIC (obrázek 1). Data byla zpracována pomocí Thermo Xcalibur a porovnána s knihovnami komponent a literaturou, přičemž bylo identifikováno celkem 44 flavonoidů (tabulka 1).
2.2 Síťová farmakologie
Identifikované složky byly importovány do databáze TCMSP 2.3 (http://tcmspw.com/tcmsp.php). Na základě orální biologické dostupnosti (OB) větší nebo rovné 30,00 % a podobnosti léku (DL) větší nebo rovné 0,18 bylo testováno 19 aktivních složek. Předpokládané cíle aktivních složek a cíle onemocnění pro chronickou prostatitidu byly protnuty, čímž bylo získáno 88 společných cílů. Pro konstrukci sítě PPI byl použit STRING 11.0 (http://string-db.org). Mezi hlavní cíle seřazené podle stupně patřily AKT1, TNF, VEGFA, EGFR, SRC, ESR1, PTGS2, MMP9, BCL2L1 a MMP2. Obohacení GO a KEGG (DAVID 6.8, http://david.ncifcrf.gov) indikovalo biologické procesy, jako je pozitivní regulace proteinkinázy B, negativní regulace apoptózy a pozitivní regulace aktivity MAPK; buněčné složky včetně extracelulární oblasti, makromolekulárních komplexů a receptorových komplexů; molekulární funkce včetně aktivit tyrosin kinázy, serin kinázy a threonin kinázy. KEGG dráhy byly obohaceny o dráhy u rakoviny, signalizace PI3K–AKT, rakoviny prostaty a rezistence na inhibitory tyrozinkinázy EGFR. Cytoscape 3.7.1 byl použit ke konstrukci sítě „aktivní složka – jádro cíl – cesta“ (obrázek 2). Top 10 složek podle stupně byly liquiritigenin, spinacetin (reprezentativní flavon), isovitexin, chrysoeriol, santin, kaempferol, schaftosid, luteolin, ononin a formononetin.
Molekulární dokování bylo provedeno po párech mezi 10 základními komponentami a klíčovými cíli z analýzy PPI. Molekulární struktury komponent jádra byly staženy z TCMSP 2.3 (formát mol2) a 3D struktury klíčových cílů byly získány z PDB (http://www.rscb.org/) ve formátu pdb. Autodock byl použit pro dokování každého páru ligand-protein. Vazebné energie < −20,92 kJ·mol−1 indikovaly příznivou vazbu; čím nižší energie, tím lepší afinita. Nejlépe hodnocené páry cíl–ligand jsou uvedeny v tabulce 2. Reprezentativní dokovací komplexy s pěti cíli byly vizualizovány v PyMol (obrázek 3).
2.3 Validace in vivo
Krysí model chronické prostatitidy byl vytvořen pomocí karagenanu. Barvení HE odhalilo histopatologické léze charakteristické pro chronickou prostatitidu u modelových zvířat, zatímco léčba alkoholovým extraktem z nadzemních částí Cistanche zlepšila glandulární architekturu a snížila zánětlivou infiltraci. ELISA ukázala, že ve srovnání s modelovou skupinou vykazovaly léčebné skupiny regulaci sérového DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA a TNF- k normálním hladinám, což ukazuje na terapeutickou účinnost.
Diskuse
Komplexní analýza integrující profilování na bázi MS s vysokým rozlišením, síťovou farmakologii, molekulární dokování a validaci na zvířatech podporuje, že flavonoidy z nadzemních částí Cistanche mají účinky proti chronické prostatitidě. Předpokládané mechanismy zahrnují modulaci PI3K–AKT a souvisejících cest spojených se zánětem a proliferací a klíčových cílů, jako jsou EGFR, AKT1 a MMP9. Výsledky poskytují vědecký základ pro vývoj a klinickou aplikaci flavonoidových přípravků z letecké části od Cistanche při léčbě chronické prostatitidy.
Závěr
Flavonoidy z nadzemních částí Cistanche prokazují terapeutický potenciál proti chronické prostatitidě, pravděpodobně prostřednictvím regulace dráhy PI3K–AKT a interakce s EGFR, AKT1 a MMP9. Integrace chemického profilování, síťové farmakologie, molekulárního dokování a experimentů na zvířatech potvrzuje jejich účinnost a objasňuje věrohodné mechanismy.
