Cistanche může chránit ischemicko-reperfuzní poškození ledvin

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Jan H. Lindeman1, Leonie G. Wijermars1, Sarantos Kostidis2, Oleg A. Mayboroda2, Amy C. Harms3, & et al.

Zpožděná funkce štěpu jeprojev ischemického reperfuzního poškozenív souvislosti s transplantací ledvin. Zatímco stovky zásahůúspěšně redukovat ischemické reperfuzní poškozenív experimentálních modelech všechny klinické intervence selhaly. Toto explorativní klinické hodnocení zkoumalo možný metabolický původ klinického ischemického reperfuzního poškození kombinováním údajů z 18 pre- a postreperfuzních biopsií tkáně s 36 sekvenčními odběry arteriovenózní krve ze štěpu ve třech studijních skupinách. Tyto skupiny zahrnovaly štěpy žijících a zemřelých dárců s a bez opožděné funkce štěpu. Rozdělení do skupin bylo založeno na klinických výsledcích. Magický úhel NMR byl použit pro analýzu tkání a platformy založené na hmotnostní spektrometrii byly použity pro analýzu plazmy. Všechnoledvinybyly funkční po dobu jednoho roku. Integrace metabolomických dat identifikovala diskriminační profil pro rozpoznání budoucí opožděné funkce štěpu. Tento profil byl charakterizován postreperfuzním katabolismem ATP/GTP (výrazně narušená obnova fosfokreatinu a signifikantně přetrvávající (hypo)xantinová produkce) a významným pokračujícím poškozením tkáně. Selhající regenerace vysokoenergetického fosfátu se objevila navzdory aktivované glykolýze, oxidaci mastných kyselin, glutaminolýze a autofagii a souvisela s defektem na úrovni komplexu oxoglutarátdehydrogenázy v Krebsově cyklu. Klinicky opožděná funkce štěpu v důsledku ischemického reperfuzního poškození spojeného s postreperfuzním metabolickým kolapsem. Snahy o uhašení opožděné funkce štěpu v důsledku ischemického reperfuzního poškození by se tedy měly zaměřit na zachování metabolické kompetence, buď zachováním integrity Krebsova cyklu a/nebo náborem metabolických záchranných drah. Kidney International (2020) 98, 1476–1488; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.07.026

KLÍČOVÁ SLOVA: ATP; opožděná funkce štěpu; glykolýza; ischemické reperfuzní poškození; metabolismus; oxidační fosforylace

cistanche účinky: zabránitischemicko-reperfuzní poškození

ischemické reperfuzní poškození (IRI)je fenomén zvýšeného poškození tkáně po reperfuzi dříve ischemické tkáně.1,2 Je hlavním přispěvatelem k poškození orgánů po infarktu myokardu nebo mozku3 a poškození štěpu po transplantaci orgánů.4 Přestože nesčetné množství intervencí potlačuje IRI v preklinických modelech, klinický úspěch zůstává Mezi preklinickými modely a klinickým kontextem se tedy objevuje translační propast.

Zpožděná funkce štěpu (DGF) je projevem IRI při vznikuledvinatransplantaci.5 DGF je definován jako potřeba dialýzy v prvním týdnu nebo týdnech po transplantaci.6 Ačkoli je DGF v kontextu transplantací od žijících dárců extrémně vzácný, postihuje až 90 procent transplantací štěpu od zemřelého dárce.6 Předchozí práce prokázala souvislost mezi incidentálním DGF a postreperfuzní normoxickou glykolýzou.7 Toto pozorování naznačuje, že DGF souvisí s defektem energetické homeostázy štěpu v důsledku mitochondriální dysfunkce v reperfuzní fázi.7 Na tomto základě jsme předpokládali, že klinická DGF zahrnuje a může být řízen metabolickým defektem (nebo defekty). Cílem této studie bylo provést hloubkovou analýzu metabolických odpovědí naischemie-reperfuzes a bez IRI (DGF). Toto explorativní metabolické hodnocení je založeno na integrovaném, časově rozlišeném přístupu, který zahrnoval sekvenční hodnocení rozdílů arteriovenózní koncentrace (AV) oproti reperfundovaným štěpům a paralelní profilování biopsií štěpu (tkáně). Byly zahrnuty tři studijní skupiny: štěpy ze štěpů od zemřelého dárce s pozdější IRI a bez ní a štěpy od žijících dárců. Skupinová alokace štěpů od zemřelého dárce (þDGF a –DGF, v tomto pořadí) byla provedena retrospektivně na základě jejich klinického výsledku. Štěpy od žijících dárců byly zahrnuty jako reference, protože tyto štěpy jsou spojeny s okamžitým funkčním zotavením po reperfuzi. Pro pokrytí primárních aspektů metabolické homeostázy byla tato studie zaměřena na následující hrubé metabolické shluky: metabolismus nukleotidtrifosfátu, oxidace mastných kyselin (b), glykolýza/glutaminolýza, autofagie, Krebsův cyklus (defekty) a poškození buněk. Údaje jsou podle toho prezentovány.

(Korespondence: Jan H. Lindeman, oddělení chirurgie, Leiden University Medical Center, PO Box 9600, 2300 RC Leiden, Nizozemsko. E-mail: Lindeman@lumc.nl Přijato 20. ledna 2020; revidováno 8. června 2020; přijato 2. července 2020; zveřejněno online 8. srpna 2020)

cistanche účinky: zabránitischemicko-reperfuzní poškození

VÝSLEDEK

Studovaný vzorek zahrnoval 53 pacientů. Párové tkáňové biopsie byly získány od 18 pacientů a sekvenční odběr AV vzorků byl proveden u 36 pacientů. U jednoho pacienta byly odebrány obě biopsie a podstoupil AV odběr. Klinické podrobnosti pro 3 studijní skupiny jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1A (tkáňové biopsie) a S1B (AV odběr vzorků). Všechny případy DGF vyžadovaly vícenásobné dialýzy v časovém průběhu alespoň 7 dnů a všechny vykazovaly adekvátní funkční zotavení. Žádný ze zemřelých dárců bez DGF nevyžadoval po transplantaci dialýzu. Jednoroční přežití štěpu bylo 100 procent.

Nejprve jsme prozkoumali domnělé rozdíly v metabolických signaturách pro 3 skupiny dárců (štěpy žijících [referenčních] dárců, štěpy od zemřelého dárce –DGF a štěpy od mrtvého dárce þDGF [IRI]) mapováním plazmatického metabolomu (AV rozdíly) pro { {1}}minuty po reperfuzním časovém bodu (obrázek 1a) atkáňový metabolom(tkáňové biopsie) po dobu 40-minut po reperfuzi (obrázek 1b). Tyto časové body byly zvoleny tak, aby se zabránilo interferenci vymýváním metabolitů, které se nahromadily během ischémie nebo chladného skladování, nebo které byly složkami konzervační tekutiny (např. vymývání histidinu ze štěpů od žijících dárců; Doplňkový obrázek S1 ukazuje selektivní použití H [Histidin] TK konzervační tekutina v těchto štěpech.7 Výsledky (z-skóre) pro tyto časové body jsou shrnuty v tepelných mapách na obrázku 1a (AV rozdíly) a 1b (tkáň). Seskupení dat bylo provedeno podle 6 shluků, které pokrývají všechna metabolická data: (i) katabolismus nukleosidtrifosfátu, (ii) b-oxidace, (iii) glykolýza/glutaminolýza, (iv) autofagie, (v) defekty Krebsova cyklu, a (vi) poškození buněk.

Teplotní mapy pro AV rozdíly ukazují paralelní metabolické signatury pro žijícího dárce a –DGF štěpy a jasně rozlišovací signaturu pro þDGF štěpy (obrázek 1a). Podobný, i když méně výrazný vzorec byl pozorován u tkáňových metabolitů (obrázek 1b). Exkluzivní mapování štěpů –DGF a þDGF (bez štěpu od žijícího dárce) vedlo k podobným závěrům (neukázáno), což naznačuje, že zahrnutí (referenčních) dat od žijících dárců do analýzy neinterferovalo se závěry analýzy. Souhrnně data poskytují hrubý metabolický podpis pro renální IRI.

Kvůli přehlednosti jsou data jednotlivých metabolitů prezentována jako 6 metabolických shluků. Aby se zabránilo interferenci z počátečního vymývání metabolitů, které se nahromadily během skladování v chladu během prvních minut reperfuze, jsou odhady čistého uvolnění nebo příjmu po perfuzi založeny na integraci rozdílů AV pro 10-až {{3 }}minuty časové intervaly po reperfuzi (plocha mezi křivkami).

První shluk metabolitů ("nukleosidtrifosfátový katabolismus") signalizuje apřetrvávající postreperfuzemetabolická inkompetence („power shutdown“) u štěpů s pozdějším DGF (þDGF). Tento závěr je založen na zhoršené postreperfuzní obnově vysokoenergetického fosfátového pufru fosfokreatinu v þDGF štěpech (P < 0.001;="" obrázek="" 2a)="" a="" na="" přetrvávající="" post="" -reperfuzní="" katabolismus="" adenosintrifosfát/guanosintrifosfát="" (atp/gtp).="" to="" se="" odráží="" v="" pokračujícím="" uvolňování="" (av="" rozdíly)="" hypoxanthinu="" a="" xanthinu="" (obrázek="" 2b="" a="" c,="" p="">< 0,0001="" a="" 0,02),="" terminálních="" degradačních="" produktů="" atp="" a="" gtp="" z="" těchto="" štěpů.="" údaje="" pro="" prereperfuzní="" biopsie="" tkáně="" ukázaly="" odstupňované="" stupně="" akumulace="" inosinu="" a="" hypoxanthinu="" na="" konci="" období="" ischemického="" skladování,="" s="" nejnižším="" obsahem="" nalezeným="" u="" žijících="" a="" nejvyšším="" u="" štěpů="" od="" zemřelých="" dárců="" (obrázek="" 2d="" a="" e).="" po="" reperfuzi="" (t="" ¼="" 40="" min)="" byl="" obsah="" hypoxanthinu="" a="" inosinu="" v="" tkáních="" podobný="" a="" nízký="" ve="" všech="" 3="" skupinách="" dárců="" (obrázek="" 2d="" a="">

Postreperfuzní katabolismus ATP v štěpech þDGF nastal navzdory zjevné postreperfuzní obnově b-oxidace mastných kyselin (doplňkový obrázek S2), aktivované glykolýze / glutaminolýzy (obrázek 3) a autofagie (obrázek 4). Všechny 3 typy štěpů vykazovaly jednotné obnovení obsahu b-hydroxybutyrátu v tkáni (doplňkový obrázek S2A) a selektivní clearance (vychytávání) mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem (C8–C12) z cirkulace (doplňkové obrázky S1 a S2B–E), což naznačuje jednotné obnovení b-oxidace. Nicméně tkáňová akumulace acetylkarnitinu ve štěpech –DGF a þDGF od zemřelých dárců (doplňkový obrázek S2F) a vymývání (AV rozdíly) acetylkarnitinu ze štěpů þDGF (doplňkový obrázek S2G, P < 0.03)="" implikují="" odstupňované="" defekty="" v="" likvidaci="" acetylových="" skupin="" vzniklých="">

Bylina cistanche

Mapování sítí glykolýzy/glutaminolýzy (obrázek 3) ukázalo stejné hladiny glukózy v tkáních (obrázek 4a) a potvrdilo přetrvávající postreperfuzní normoxickou glykolýzu jako výlučný rys dárcovských štěpů þDGF (viz perzistentní uvolňování laktátu a pyruvátu (obrázek 3b a c, P<0.0001 and=""><0.04, respectively)="" and="" release="" of="" the="" transamination="" products="" alanine="" and="" aspartate="" (figure="" 3e="" and="" f,="" p="" <="" 0.02="" and="" <="" 0.0001,="" respectively).="" serine="" (figure="" 4b)="" and="" phosphoserine="" (supplementary="" figure="" 3d)="" released="" from="" þdgf="" grafts="" may="" (partially)="" reflflect="" transamination="" of="" the="" glycolysis="" intermediate="" phosphoglycerate.="" persistent="" post-reperfusion="" glutamate="" release="" (figure="" 3k,="" p="" <="" 0.002),="" selective="" release="" of="" the="" transamination="" products="" alanine="" and="" aspartate="" (figure="" 3e="" and="" f),="" and="" exhaustion="" of="" the="" tissue="" asparagine="" pool="" (figure="" 3j,="" p="" <="" 0.03)="" in="" þdgf="" grafts="" imply="" continued="" post-reperfusion="" glutaminolysis="" (alanine)="" and="" glutamine="" shuttling="" (asparagine="" aspartate)8="" in="" the="" post-reperfusion="" phase="" of="" these="" grafts.="" moreover,="" the="" exclusive="" release="" of="" serine,="" methionine,="" and="" tyrosine="" (figure="" 4a–c,="" all="" ps="" <="" 0.0005),="" along="" with="" disposal="" of="" butyryl="" carnitine="" and="" isovaleryl="" carnitine="" (figure="" 4d="" and="" e,="" p=""><0.006 and=""><0.003, respectively),="" deamination="" products="" of="" the="" branched-chain="" amino="" acids9,10="" from="" þdgf="" grafts,="" but="" not="" from="" the="" other="" graft="" types="" (figure="" 4a–e),="" implies="">postreperfuzeautofagie u těchto štěpů.11.

Obrázek 1|Seskupené tepelné mapy pro rozdíly v koncentraci arteriálně-venózního metabolitu oproti dárcovskému štěpu po 30 minutách a obsahy tkáňových metabolitů 40 minut po reperfuzi. (a) Seskupená tepelná mapa pro koncentrace arteriálně-venózních metabolitů v t ¼ 30 minut po reperfuzi. Sloupce představují 3 skupiny dárců (štěpy žijících dárců [referenční skupina, n ¼ 10]; štěpy od zemřelého dárce bez pozdější opožděné funkce štěpu [DGF {–DGF, n ¼ 10}] a štěpy od zemřelého dárce s pozdějším DGF [þDGF, n ¼ 16]). Sloučeniny jsou seskupeny podle 5 metabolických shluků a v rámci každého shluku jsou seřazeny na základě z-skóre skupiny žijících dárců. Zelená odráží příjem sítě štěpem a červená odráží uvolňování sítě ze štěpu. (pokračování)

Obrázek 1 (pokračování) (b) Seskupená tepelná mapa pro tkáňové metabolity identifikované v analýze HR magického úhlu nukleární magnetické rezonance biopsií štěpu odebraných 40 minut po reperfuzi. Sloupce představují 3 skupiny dárců (skupina žijících dárců [referenční skupina, n ¼ 6, štěpy od zemřelého dárce bez pozdějšího DGF [–DGF, n ¼ 6] a štěpy od zemřelého dárce s pozdějším DGF [þDGF, n ¼ 6]). Červená odráží obsah tkáně nad a zelená odráží obsah tkáně pod geometrickým průměrem 3 skupin.

Poreperfuzní akumulace acetyl-karnitinu (tkáň) v –DGF a þDGF štěpech (obrázek 2f) a počáteční (živý dárce a –DGF štěpy) a pokračující (þDGF štěpy) uvolňování acetylkarnitinu (P < 0).{10="" }}3)="" indikují="" přechodnou="" (–dgf="" štěpy)="" nebo="" přetrvávající="" (þdgf="" štěpy)="" narušenou="" likvidaci="" acetyl-koenzymu="" a="" po="" reperfuzi="" (doplňkový="" obrázek="" 2g).="" ačkoli="" tato="" akumulace="" může="" být="" důsledkem="" přehnané="" glykolýzy="" a="" b-oxidace,="" může="" také="" indikovat="" zhoršenou="" likvidaci="" acetylu="" v="" důsledku="" poruch="" krebsova="" cyklu.="" u="" štěpů="" þdgf="" je="" druhý="" mechanismus="" podporován="" selektivním="" a="" přetrvávajícím="" uvolňováním="" meziproduktu="" a-ketoglutarátu="" krebsova="" cyklu="" (obrázek="" 5c,="" p="">< 0,0005)="" jako="" výlučným="" rysem="" těchto="" štěpů="" a="" zhoršenou="" obnovou="" tkáňového="" sukcinátu="" v="" štěpech="" þdgf="" (obrázek="">

Poslední shluk diskriminačních metabolitů souvisí s probíhajícím poškozením buněk. Tento cluster zahrnujepostreperfuzeuvolnění uracilu, zavedeného markeru poškození buněk12,13 (doplňkový obrázek S3A, P < 0.0001)="" a="" derivátů="" aminokyselin,="" které="" se="" spojují="" s="" hydrolýza="" plazmalogenů="" (viz.="" fosfo-ethanolamin,="" ethanolamin="" a="" fosfoserin;="" doplňkový="" obrázek="" s3bd,="" p="">< 0.001;="" doplňkový="" obrázek="" s1).="" ačkoli="" nebyly="" přítomny="" žádné="" av="" rozdíly="" pro="" cholin="" ve="" skupině="" þdgf="" (p="" ¼="" 0,60),="" toto="" pozorování="" je="" v="" kontrastu="" s="" čistým="" vychytáváním="" cholinu="" ve="" skupině="" žijících="" dárců="" a="" –dgf="" (p="">< 0,0001="" a="" 0,02,="" v="" tomto="" pořadí).="" u="" štěpů="" þdgf="" tedy="" může="" být="" hydrolýza="" cholinových="" plazmogenů="" maskována="" absorpcí="" cholinu.="" takový="" mechanismus="" je="" podporován="" selektivním="" a="" progresivním="" uvolňováním="" betainu,="" oxidačního="" produktu="" cholinu14="" ve="" skupině="" þdgf="" (doplňkové="" obrázky="" s3g,="" p=""><>

Předchozí pozorování spojují incident IRI s přetrvávajícímpostreperfuzeKatabolismus ATP a pokračující poškození buněk v kontextu mitochondriálního selhání a aktivace glykolytických a lipolytických drah (obrázek 6). Vzhledem k zásadní úloze ATP v buněčné homeostáze a přežití bylo uvažováno, že nábor pomocných ATP-regeneračních drah (viz. nezávislých na mitochondriálním dýchání) by byl prospěšný. V této souvislosti jsme zvažovali inosin, nukleosid, který může generovat ATP netradičními cestami. Jak je znázorněno na obrázku 7, ani preventivní, ani záchranné podání inosinu (v koncentracích až 10 mmol/l) nezachránilo vyčerpání ATP po chemicky vyvolané metabolické paralýze.

Obrázek 3|Postreperfuzní glykolýza a glutaminolýza. Křivky pro arteriální žilní rozdíly (červená křivka je arteriální, modrá křivka je venózní). Tkáňové biopsie (sloupcové grafy): bílé sloupce představují pre-reperfuzní biopsie; šedé sloupce představují postreperfuzní biopsie (t ¼ 40 min po reperfuzi). *P < 0,05.="" (a)="" obsah="" glukózy="" v="" tkáni.="" (b–i)="" meziprodukty="" glykolýzy:="" laktát,="" pyruvát,="" alanin,="" aspartát="" a="" asparagin.="" (k,l).="" glutaminolýza="" meziprodukty="" glutaminu="" a="" glutamátu.="" tkáňová="" nukleární="" magnetická="" rezonance="" (nmr;="" n="" ¼="" 6="" na="" skupinu):="" (a)="" regenerace="" tkáňové="" glukózy="" u="" živého="" dárce.="" (d,="" f,="" h)="" stabilní="" obsah="" laktátu,="" alaninu="" a="" aspartátu="" v="" tkáních="" odráží="" vymývání="" těchto="" meziproduktů="">

Obrázek 3 (pokračování) z ledviny. (j) Neměřitelný tkáňový asparagin v postreperfuzních biopsiích s opožděnou funkcí štěpu (DFG). Rozdíly v arteriálně-venózních (AV) koncentracích (n ¼ 10, 10 a 16 u živých skupin, –DGF a þDGF, v tomto pořadí): (b,c) přetrvávající postreperfuzní laktát (P < 0.0001)="" a="" pyruvát="" (p="">< 0,04)="" se="" z="" těchto="" štěpů="" uvolňují.="" (e)="" alanin="" (p="">< 0,02),="" (g)="" kyselina="" asparagová="" (p="">< 0,0001)="" a="" (þk)="" uvolňování="" glutamátu="" (zpožděná="" funkce="" štěpu="" (dgf="" štěpy="" indikující="" normoxickou="" glykolýzu="" v="" p="">< 0,002)="" z="" þdgf="" štěpů="" ukazují="" pokračující="" oxidaci="" glutaminu="" v="" u="" glutaminu="" (i)="" nebyly="" pozorovány="" žádné="" významné="" av="">

cistanche účinky: zabránitonemocnění ledvin

DISKUSE

Z této studie, provedené v kontextu klinické transplantace ledvin, vyplývá obraz IRI (DGF) jako důsledek téměř okamžitého a přetrvávajícího postreperfuzního selhání oxidativní fosforylace a aktivované normoxické glykolýzy, která není schopna udržet energetickou homeostázu. Na druhé straně se zásoby vysokoenergetických fosfátů postupně vyčerpávají a buněčná integrita nemůže být zachována, což má za následek pokračující poškození tkáně.

Tato klinická studie je založena na integraci metabolických dat odvozených z tkáňových biopsií odebraných bezprostředně před a 40 minut po reperfuzi a na sekvenčním hodnocení AV rozdílů u reperfundovaného štěpu. Tyto AV rozdíly poskytují nejen indikaci pro rychlost a trvání metabolických (malých) adaptací, ale také umožňují nasměrovat trendy pozorované v párových tkáňových biopsiích a zhodnotit clearance metabolitů (např. laktátu) nebo absorpce z (např. média). -mastné kyseliny se středním řetězcem) cirkulace.15,16 Řešení AV přístupu je jasně ilustrováno údaji o acylkarnitinu, které nejen ukazují selektivní příjem mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem, ale také naznačují, že nenasycené C14 karnitinové druhy tetradecenoyl a tetradekadienylkarnitin se chovají podobně jako mastné kyseliny se středně dlouhým řetězcem (doplňková data S1) a nemusí se spoléhat na specifické přenašeče mastných kyselin.17 Ve skutečnosti bylo v procesu analýzy dat pozorováno, že pouhé spoléhání se na tkáňové biopsie by většinu závěrů v této studii zatemnilo. protože většina vytvořených metabolitů je účinně odstraněna do oběhu. Stabilní koncentrace v arteriální krvi ukazují, že je udržována krevní homeostáza, a v důsledku toho jsou uvolněné nebo absorbované metabolity účinně likvidovány nebo doplňovány jinde.15,16 Pozorovaný stabilní tkáňový obsah, ale jasné AV rozdíly zpochybňují platnost tkáňových metabolomických hodnocení. Všimněte si, že v kontextu ledvin od zemřelého dárce a časového rámce studie není clearance moči rušivým faktorem, protože všechny štěpy od zemřelého dárce byly po 40-minutový interval měření anurické.

Mapování dat identifikuje metabolickou stopu, která je pro IRI plně diskriminační. Konkrétně je reperfuzní fáze štěpů s budoucím DGF jednotně a výrazně charakterizována závažně narušenou oxidativní fosforylací (histotoxickou hypoxií)18 a kompenzační normoxickou glykolýzou, která není schopna udržet regeneraci ATP. Poslední závěr je založen na neúplné obnově vysokoenergetického fosfátového pufru fosfokreatinu19 a na přetrvávajícím postreperfuzním katabolismu ATP/GTP, který se odráží v pokračujícím uvolňování (hypo)xanthinu. Ve skutečnosti, aproximace ztrát adenosinu pro þDGF štěpy na základě uvolňování hypoxantinu (AV rozdíly) během 30 minut po reperfuzi (přibližná hodnota založená na hlášených postreperfuzních průtokových rychlostech, průměr 20ledvinová tkáňhmotnost,21 a renální obsah ATP22) naznačuje téměř vyčerpání zásob ATP štěpu za 30 minutpostreperfuze. Kritické vyčerpání zásoby ATP může vést ke katabolickému uzamčení, které učiní buňku nereagující na obnovení protonových hybných sil, které řídí tvorbu ATP, čímž buňku přestanou reagovat na záchranné strategie.

Postreperfuzní deficit ATP a histotoxická hypoxie u štěpů þDGF mohou být základem selektivního uvolňování aminokyselin spojených s hydrolýzou fosfolipidů (plazmalogenů) v štěpech þDGF. Experimentální studie identifikovaly hydrolýzu plazmalogenů a fosfolipidů jako časnou charakteristiku tkáňové hypoxie23 a hydrolýza plazmalogenů byla popsána v souvislosti s ischemickým poškozením ledvin.24 Mechanicky je tento jev spojen s translokací membrány a aktivací cytosolového kalciového nezávislá fosfolipáza A2 vyplývající z tvorby komplexu řízeného hypoxií mezi fosfolipázou a regulačním prvkem fosfofruktokinázy.25,26 Zvrat hypoxie nebo léčby ATP disociuje komplex fosfolipáza-fosfofruktokináza a ruší fosfolipázovou aktivitu. Všimněte si, že dynamika postreperfuzního zastavení uvolňování (fosfo-)ethanolaminu z živých dárců a –DGF štěpů, stejně jako trvalé uvolňování v þDGF štěpech, může odrážet různé stupně a rychlosti metabolické obnovy. Avšak zatímco dřívější zprávy naznačují roli cytosolické na vápníku nezávislé fosfolipázy A2,25,26 pozorované AV rozdíly pro betain a (fosfo-)ethanolamin znamenají komplexnější aktivaci fosfolipáz, která také zahrnuje fosfolipázy typu C (fosfo-ethanolamin) a D-fosfolipázy (ethanolamin/cholin). Podobně může deplece tkáňového asparaginu (obrázek 4j) a uvolnění aspartátu (obrázek 4g) z þDGF štěpů odrážet zhoršenou aktivitu asparaginsyntázy v důsledku deplece ATP.

Obrázek 4|Aktivovaná postreperfuzní autofagie u štěpů DGF (D delayed graft function).. Křivky pro arteriálně-žilní rozdíly (červená křivka je arteriální, modrá křivka je venózní). Tkáňové biopsie (sloupcové grafy): bílé sloupce představují pre-reperfuzní biopsie; šedé sloupce představují postreperfuzní biopsie (t ¼ 40 min po reperfuzi). *P < 0,05.="" (a–c)="" postreperfuzní="" uvolňování="" methioninu,="" serinu="" a="" tyrosinu="">

Obrázek 5|Poreperfuzní defekt Krebsova cyklu u štěpů s budoucí opožděnou funkcí štěpu (DGF). Křivky pro rozdíly arteriálně-venózní koncentrace (AV) (červená křivka je arteriální, modrá křivka je venózní). Tkáňové biopsie (sloupcové grafy): bílé sloupce představují pre-reperfuzní biopsie; šedé sloupce představují postreperfuzní biopsie (t ¼ 40 min po reperfuzi). *P < {{10}}.05.="" (a–h)="" av="" rozdíly="" pro="" meziprodukty="" krebsova="" cyklu="" (n="" ¼="" 10,="" 10="" a="" 16="" u="" živých="" skupin="" –dgf="" a="" þdgf,="" v="" tomto="" pořadí):="" trvalé="" uvolňování="" a-ketoglutarátu="" (z="" štěpů="" þdgf;="" p="">< 0,001)="" .="" (e,g)="" chybějící="" postreperfuzní="" obnova="" tkáňového="" sukcinátu="" v="" þdgf="" štěpech="" (p=""><>

Postreperfuzní katabolismus ATP v þDGF štěpech nastal navzdory komplexní aktivaci katabolických drah: glykolýza, b-oxidace mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem (stejnoměrně aktivovaná u všech typů štěpů), glutaminolýza (také přechodně aktivovaná po reperfuzi u žijících dárců a –DGF štěpů ) a aktivovala autofagii. Ve skutečnosti bylo postreperfuzní uvolňování isovaleryl- a butyrylkarnitinu, produktů deaminace větvených aminokyselin isoleucinu a leucinu11 identifikováno jako diskriminační biomarkery pro budoucí DGF.

Přetrvávající uvolňování acetylkarnitinu a pyruvátu z þDGF štěpů ukazuje, že fluxy vytvořené aktivovanými katabolickými cestami přesáhly oxidační kapacitu. Postreperfuzní uvolňování ketoglutarátu, čisté vychytávání citrátu a isocitrátu jeho prekurzoru z cirkulace a selhání obnovy tkáňového sukcinátu naznačují, že narušená oxidativní fosforylace zahrnuje defekt na úrovni komplexu oxoglutarátdehydrogenázy. Konkrétně pozorovaná metabolická stopa a časový rámec metabolických poruch nenaznačují roli pro obrácenou směrovatelnost Krebsova cyklu27,28 při přetrvávající metabolické dysregulaci, což poskytuje další důkaz, že pozorovaný mechanismus IRI u hlodavců28 se plně nepřevádí na člověka. kontext.29.

Zhoršená aktivita oxoglutarátdehydrogenázy může být způsobena poškozením komplexu souvisejícím s ischemií30, ale může také zahrnovat nebo být zvýrazněna narušenímpostreperfuzeZhoršená aktivita oxoglutarátdehydrogenázy může být způsobena poškozením komplexu souvisejícím s ischemií30, ale může také zahrnovat nebo být zvýrazněna zhoršenou postreperfuzní dostupností jeho kofaktorů acetyl-koenzymu A, FADþ a NADþ. 31 U štěpů þDGF by k takovým nedostatkům mohlo dojít v důsledku postreperfuzního vymývání acetyl-koenzymem A a zhoršeného buněčného redoxního stavu (redukční stres se zhoršenou dostupností NAD), což je názor podpořený nízkým poměrem laktátu k pyruvátu u štěpů þDGF. 32.

Tento metabolický přístup neumožňuje hodnocení postižení dýchacího řetězce. Již dříve jsme však identifikovali defekty související s ischemií a reperfuzí v obou respiračních komplexech I a II.7,29 Na základě údajů z této studie a předchozí mitochondriální práce se objevuje obraz klinického renálního IRI jako důsledek primárního (resp. vyvolání) urážky(ů) mitochondriálního Krebsova cyklu-redoxního raketoplánu, ke kterému dochází před nebo během prvních minut reperfuze. Neschopnost obnovit hladiny ATP má za následek trvalou a komplexní aktivaci katabolických drah, která udržuje energetickou krizi postupným vyčerpáváním buněčné zásoby NADþ a FADþ (reduktivní stres).33 V tomto specifickém kontextu selhávajícího mitochondriálního dýchání může být purin inosin prospěšný. . Na rozdíl od adenosinu34 je inosin v plazmě stabilní; byl identifikován jako alternativní zdroj ATP v obligatorních glykolytických buňkách (tj. v buňkách bez mitochondrií), jako jsou erytrocyty35 a v hypoxických renálních buňkách36 a je vyčerpán po reperfuzi. Bohužel suplementace inosinem nezachránila buněčnou depleci ATP po nuceném metabolickém odstavení, což ponechalo jen malý prostor pro metabolické záchranné strategie zaměřené na zhášení IRI, což zdůrazňovalo spoléhání se na preventivní strategie pro omezení IRI.

Tonifikujte ledvinovou cistanche

Tato studie má svá omezení. Vzhledem k velkému počtu srovnání je potenciál pro významná zjištění v důsledku náhodné náhody při vícenásobných srovnáních vysoký. Ačkoli jsou naše závěry podpořeny zdravými biologickými vztahy, výsledky mohou být zkresleny problémy souvisejícími s vícenásobným srovnáním.

Dalším omezením je, že studie je založena na klinických vzorcích; jako takové nebylo možné svorkové zmrazení potřebné pro přímé hodnocení ATP a redoxního stavu. Protože pozorovaný metabolom je jasně odlišný od metabolomu uváděného na zvířecích modelech a odráží selhání systému, nebyli jsme schopni provést podrobnější hodnocení na zvířecích modelech nebo ex vivo systémech, jako je systém respirometrie. Výsledky v této studii jsou proledvina; takže závěry pro jiné orgány mohou být odlišné. Relativně vysoký věk dárce v této studii je odrazem populace dárců v Nizozemsku. Důležité je, že 10-roční výsledky transplantací v Nizozemsku jsou přinejmenším stejné jako v zemích s mladšími dárci, jako jsou Spojené státy.37 Jak se očekávalo, většina případů þDGF byly štěpy DCD. Všimli jsme si podobnéhometabolické profilypro DBD a DCD štěpy; síla této explorativní studie je však zjevně příliš nízká na to, aby odhalila jemné rozdíly mezi těmito 2 typy dárců.

Obrázek 7|Jak preventivní, tak záchranná léčba inosinem nedokáže obnovit hladiny adenosintrifosfátu (ATP).. PK-1 renální buněčná linie byla stabilně transfekována fluorescenčním biosenzorem PercevalHR poměru ATP-adenosindifosfát (ADP).

Chemicky indukovaná metabolická paralýza byla indukována přidáním rotenonu/aktinomycinu/2-deoxyglukózy a byl sledován poměr ATP-ADP (relativní fluorescence). Hnědá, kontrola; černá, kontrola metabolické paralýzy; zelená, preventivní léčba inosinem (10 mmol/l); červená, inosinová záchrana v t ¼ 15 minut po indukci metabolické paralýzy.

Závěrem lze říci, že tato studie ukazuje, že klinické renální IRI předchází téměř okamžitý metabolický kolaps a doprovodná vysokoenergetická fosfátová krize. Tento hluboký a přetrvávající metabolický deficit a jeho okamžitá povaha (a následné minimální okno terapeutických příležitostí) bude interferovat s jakoukoli farmaceutickou intervencí, která závisí na dostupnosti ATP. To může vysvětlit špatnou přenositelnost preklinických nálezů do klinického prostředí.2–4 Pozorovaný metabolom klinického DGF ostře kontrastuje s hlášenými metabolickými odpověďmi u potkanů, 28 myší, 38 a prasat, 39, 40 které všechny naznačují obnovení oxidativní fosforylace v rámci minut reperfuze. To se může týkat zásadních rozdílů v mitochondriální nebo metabolické fyziologii mezi hlodavci a většími savci (např. ischemií indukovaná akumulace sukcinátu se nevyskytuje v ledvinách lidských dárců).29 V této souvislosti je důležité zdůraznit, že všechny transplantované ledviny jsou exponovány naischemická reperfuzea že pouze podskupina štěpů de velops IRI (DGF). Skupinová alokace (þDGF nebo –DGF) v této studii byla provedena retrospektivně, a proto rozlišuje mezi ischemickou reperfuzí a IRI. Nelze vyloučit, že reperfuze ischemie v experimentálních modelech28,38–40 není dostatečná ke spuštění IRI.

Navzdory vážnému poškození se všechny štěpy þDGF nakonec zotavily, což znamená pozoruhodný potenciál obnovy za předpokladu, že jsou dostupné přemosťující intervence (např. dialýza). Je třeba poznamenat, že ačkoli podobné metabolomy pro DGF ve štěpech pocházejících od dárců zemřelých po smrti mozku nebo srdeční smrti implikují jednotný mechanismus, existuje kontrastní dopad DGF na dlouhodobé přežití štěpu u 2 typů dárců.41 Ve skutečnosti, ačkoli DGF jednoznačně ovlivňuje přežití štěpů od dárců zemřelých po mozkové smrti, u takových štěpů od srdečních dárců nikoliv. Zdá se, že tento kontrast odráží vynikající regenerační potenciál štěpů od dárců se srdeční smrtí.41

METODY

Lékařský etický výbor lékařského centra Leiden University schválil protokol studie. Od každého pacienta byl získán písemný informovaný souhlas. Tato jednocentrická studie zahrnovala 53 pacientů, kteří podstoupililedvinatransplantace: 37 podstoupilo transplantaci od zemřelého dárce a 16 zákrok od žijícího dárce. Na základě klinického výsledku (DGF) byli příjemci štěpů od zemřelého dárce zařazeni do skupiny þDGF (n ¼ 16) nebo skupiny –DGF (n ¼ 10). DGF byl definován potřebou dialýzy v prvním týdnu po transplantaci.6

Studie je založena na integraci metabolomických dat získaných ze sekvenčního arteriovenózního (AV) odběru krve během první půl hodiny reperfuze a z párových tkáňových biopsií odebraných bezprostředně před a 40 minut po

reperfuze.

Sekvenční odběr AV krve přes štěp byl proveden u 36 pacientů (doplňková tabulka S1A). Vzorky krve z renální žíly byly odebírány za 3 0 s a 3, 5, 10, 20 a 30 minut a arteriální vzorky za 0, 10 a 30 minut po reperfuzi.42 Párové pre- a poreperfuzní renální biopsie byly získány bezprostředně před a 40 minut po reperfuzi ze 6 žijících a 12 zemřelých dárcovských štěpů (doplňková tabulka S1B; 1 pacient měl odebrané biopsie i AV vzorky).

Cílené metabolomické analýzy byly provedeny pomocí standardních operačních postupů s použitím zavedených platforem založených na hmotnostní spektrometrii nebo magické úhlové nukleární magnetické rezonance (tkáňové biopsie).43 Metabolity pokryté platformami jsou shrnuty v doplňkové tabulce S1.

Potenciál inosinu zachránit metabolický deficit během metabolického kolapsu byl testován na buněčné linii proximálního tubulu (LLC PK1) stabilně transfekované fluorescenčním ATP adenosindifosfátovým biosenzorem PercevalHR.44.

S ohledem na statistiky byly tepelné mapy konstruovány na základě z-skóre pro každou z nichmetabolit. Změny v obsahu tkáňových metabolitů v rámci skupiny byly testovány Mann-Whitney testem a rozdíly mezi skupinami Wilcoxonovým testem. AV rozdíly byly odhadnuty pomocí lineárního smíšeného modelu. Korekce pro vícenásobné testování nebyla provedena, protože všechna pozorování byla součástí teoretických sítí. Podrobnosti týkající se pacientů a metod jsou uvedeny v Doplňkových metodách.

extrakt z cistanche

ZVEŘEJNĚNÍ

Všichni autoři neuvedli žádné konkurenční zájmy.

PODĚKOVÁNÍ

Základní zařízení magnetické rezonance je financováno Lékařskou fakultou NTNU Trondheim v Norsku. Tato studie byla částečně financována Nizozemskou nadací pro ledviny (Metabolic Salvage Strategies to Improve Transplant Outcome, projekt17O/11).

DOPLŇKOVÝ MATERIÁL

Doplňkový soubor (PDF)

Doplňující pacienti a metody.

Tabulka S1. Charakteristiky pacienta a transplantace postupů, při kterých byly odebírány párové tkáňové biopsie (A) a při kterých byl prováděn AV odběr (B).

Tabulka S2. Pro AV vzorky se používají platformy a jejich metabolity.

Obrázek S1. Úplná metabolomická data.

Obrázek S2. Obnovení b-oxidace (mastné kyseliny se středně dlouhým řetězcem) po reperfuzi.

Obrázek S3. Selektivní a přetrvávající postreperfuzní vymývání uracilu a aminokyselin asociovaných s fosfolipidem (plazmalogenem) ze štěpů s budoucím DGF.

Dodatek k datům 1. Nezpracovaná AV data pro acetylkarnitin, organické kyseliny a aminokyselinové platformy.

Dodatek k datům 2. Nezpracovaná AV data pro purinovou a pyrimidinovou platformu.

REFERENCE

1. Gutteridge JMC, Halliwell B. Reaktivní druhy v nemoci: přátelé nebo nepřátelé? In: Halliwell B, Gutteridge JMC, eds. Volné radikály v biologii a medicíně. Oxford, UK: Oxford University Press; 2015: 511–638.

2. Davidson SM, Ferdinandy P, Andreou I a kol. Vícecílové strategie ke snížení ischemie/reperfuzního poškození myokardu: téma týdne přehledu JACC. J Am Coll Cardiol. 2019;73:89–99.

3. Lefer DJ, Bolli R. Vývoj konsorcia NIH pro preklinické hodnocení kardioprotektivních terapií (CAESAR): změna paradigmatu ve studiích omezení velikosti infarktu. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2011;16:332–339.

4. Cavaillé-Coll M, Bala S, Velidedeoglu E, et al. Shrnutí workshopu FDA o ischemickém reperfuzním poškození při transplantaci ledviny. Am J Transplant. 2013;13:1134–1148.

5. Schröppel B, Legendre C. Zpožděná funkce ledvinového štěpu: od mechanismu k translaci. Kidney Int. 2014;86:251–258.

6. Mallon DH, Summers DM, Bradley JA a kol. Definice opožděné funkce štěpu po transplantaci ledviny: nejjednodušší je nejlepší. Transplantace. 2013;96:885–889.

7. Wijermars LG, Schaapherder AF, de Vries DK a kol. Defektní postreperfuzní metabolická obnova přímo souvisí s opožděnou funkcí štěpu. Kidney Int. 2016;90:181–191.

8. Zhang J, Fan J, Venneti S, a kol. Asparagin hraje klíčovou roli v regulaci buněčné adaptace na depleci glutaminu. Mol Cell. 2014;56: 205–218.

9. Holeček M. Vztah mezi glutaminem, větvenými aminokyselinami a metabolismem bílkovin. Výživa. 2002;18:130–133.

10. Newgard CB, An J, Bain JR a kol. Metabolický podpis s rozvětveným řetězcem aminokyselin, který odlišuje obézní a štíhlé lidi a přispívá k inzulínové rezistenci. Cell Metab. 2009;9:311–326.

11. Drake KJ, Sidorov VY, McGuinness OP a kol. Aminokyseliny jako metabolické substráty při srdeční ischemii. Exp Biol Med (Maywood). 2012;237: 1369–1378.

12. De Jong JW, Huizer T, Janssen M a kol. Vysokoenergetické fosfáty a jejich katabolity. In: Piper HM, Preusse CJ, eds. Ischemia-reperfuze v kardiochirurgii. Dordrecht, Nizozemsko: Springer; 1993:295–315.

13. van Os S, de Abreu R, Hopman J, a kol. Metabolismus purinů a pyrimidinů a elektrokortikální mozková aktivita při hypoxémii u jehňat. Pediatr Res. 2004;55:1018–1025.

14. Blom HJ, De Vriese AS. Proč se při selhání ledvin zvyšuje hladina homocysteinu? Metabolický přístup. J Lab Clin Med. 2002;139:262–268.

15. Ivanisevic J, Elias D, Deguchi H a kol. Metabolomika arteriovenózní krve: odečet intratkáňové metabostázy. Sci Rep. 2015;5:12757.

16. Jang C, Hui S, Zeng X a kol. Výměna metabolitů mezi orgány savců kvantifikovaná u prasat. Cell Metab. 2019;30:594–606.

17. Bremer J. Metabolismus a funkce karnitinu. Physiol Rev. 1983;63: 1420–1466.

18. Siggaard-Andersen O, Fogh-Andersen N, Gøthgen IH, Larsen VH. Stav kyslíku arteriální a smíšené venózní krve. Crit Care Med. 1995;23:1284–1293.

19. Stoica SC. Vysokoenergetické fosfáty a lidské dárcovské srdce. J Transplantace srdce a plic. 2004;23:S244–S246.

20. Lisik W, Gontarczyk G, Kosieradzki M, et al. Intraoperační měření průtoku krve v orgánových aloštěpech může předpovědět pooperační funkci. Transplant Proc. 2007;39:371–372.

21. Molina DK, DiMaio VJ. Normální hmotnosti orgánů u mužů: část II – mozek, plíce, játra, slezina a ledviny. Am J Forensic Med Pathol. 2012;33:368–372.

22. Hems DA, Brosnan JT. Účinky ischemie na obsah metabolitů v játrech a ledvinách potkana in vivo. Biochem J. 1970;120:105-111.

23. De Medio GE, Goracci G, Horrocks LA a kol. Vliv přechodné ischemie na metabolismus mastných kyselin a lipidů v mozku pískomila. Ital J Biochem. 1980;29:412–432.

24. Rao S, Walters KB, Wilson L a kol. Časné změny lipidů u akutního poškození ledvin pomocí lipidomiky SWATH ve spojení se zobrazením tkáně MALDI. Am J Physiol Renální Physiol. 2016;310:F1136–F1147.

25. Portilla D, Shah SV, Lehman PA a kol. Role cytosolické na vápníku nezávislé plazmalogen-selektivní fosfolipázy A2 při hypoxickém poškození králičích proximálních tubulů. J Clin Invest. 1994;93:1609–1615.

26. Hazen SL, Wolf MJ, Ford DA, Gross RW. Rychlé a reverzibilní spojení fosfofruktokinázy s membránami myokardu během ischemie myokardu. FEBS Lett. 1994;339:213–216.

27. Chinopoulos C. Jakým směrem se otáčí cyklus kyseliny citronové při hypoxii? Kritická úloha komplexu a-ketoglutarátdehydrogenázy. J Neurosci Res. 2013;91:1030–1043.

28. Chouchani ET, Pell VR, Gaude E, a kol. Ischemická akumulace sukcinátu řídí reperfuzní poškození prostřednictvím mitochondriálních ROS. Příroda. 2014;515:431–435.

29. Wijermars LG, Schaapherder AF, Kostidis S a kol. Akumulace sukcinátu a ischemicko-reperfuzní poškození: u myší, ale ne u mužů, studie renální ischemie-reperfuze. Am J Transplant. 2016;16:2741–2746.

30. Tretter L, Adam-Vizi V. Alfa-ketoglutarát dehydrogenáza: cíl a generátor oxidačního stresu. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2005;360: 2335–2345.

31. Heikal AA. Intracelulární koenzymy jako přirozené biomarkery pro metabolické aktivity a mitochondriální anomálie. Biomark Med. 2010;4:241–263.

32. Sun F, Dai C, Xie J a kol. Biochemické problémy při odhadu poměru NAD/NADH volných cytosolů. PLoS One. 2012;7:e34525.

    ---