Chrysogenamid A z endofytické houby spojené s Cistanche Deserticola a její neuroprotektivní účinek na buňky SH-SY5Y

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Úvod

Cistanche deserticola(YC Ma) je parazitická rostlina původem ze severozápadu Číny. Nať této rostliny je důležitou tradiční čínskou medicínou a používá se k léčbě nedostatku ledvin a neurastenie ("The Chinese Medicine Dictionary", 1977). Fenylthanoidové glykosidy zCistanchedeserticolabyly hlášeny aktivity v prevenci a léčbě onemocnění hlavových nervů a zachycování volných radikálů [1, 2]. Vzhledem k tomu, že endofytické houby mohou produkovat nové léčivé složky a stejné/podobné jako ty z hostitelských rostlin, ukazuje hledání nových účinných látek z endofytických hub významných léčivých rostlin hodnotu pro vývoj nových léčivých zdrojů. V průběhu našeho hledání nových neuroprotektivních sloučenin z endofytických hub zCistanchedeserticolashromážděné z Vnitřního Mongolska v severozápadní Číně byly tři aktivní kmeny testovány pomocí buněk SH-SY5Y. Mezi nimi kultivační bujón houby č. 005, ověřený jako Penicillium chrysogenum, vykazoval významný ochranný účinek neurocytů proti buněčné smrti indukované oxidačním stresem v buňkách SH-SY5Y. Studie na aktivních složkách tohoto kmene vedly k izolaci chrysogenamidu A (1) (obr. 1) pomocí izolačního postupu řízeného biotestem. Kromě toho byly izolovány čtyři známé sloučeniny a identifikovány jako circumdat v G (2) [3], 2-[(2-hydroxypropionyl) amino]benzamid (3) [4], 2- ,3-dihydrosorbicilin (4) [5] a (9Z,12Z)-2,3-dihydroxypropyloktadeka-9,12-dienoát (5) [6] , porovnáním jejich spektroskopických dat s literárními údaji. Zde referujeme o izolaci, identifikaci a neuroprotektivním účinku chrysogenamidu A.

Cistanche deserticola

Materiály a metody

Plísňový materiál Vzorek Penicillium chrysogenum č. 005 byl izolován z kořene C. deserticola odebraného z Vnitřního Mongolska v severozápadní Číně. Na agaru s bramborovou dextrózou byl makroskopický vzhled rozprostřených, hladkých, sametových, modrozelených kolonií někdy porostlých světlými hyfami; povrch kolonií často vykazoval četné světle žluté kapičky; reverzní žlutá. Bylo provedeno vyhledávání GenBank s genovou sekvencí 18S ribozomální DNA č. 005 (1676 nukleotidů; přírůstkové číslo Gen-Bank EU203859). Výsledky naznačují, že druh Penicillium chrysogenum se nejvíce shoduje. Na základě svého makroskopického vzhledu a sekvence genu 18S rDNA je No.005 kmenem Penicillium chrysogenum.

Fermentace a extrakce

Houba byla pěstována za statických podmínek při 24 stupních po dobu 3{{10}} dnů v 35 1000-ml kuželových baňkách obsahujících kapalné médium (30{{2{{22} }}} ml/lahev) složený z glukózy (10 g/litr), maltózy (20 g/litr), mannitolu (20 g/litr), glutamátu sodného (10 g/litr), KH2PO4 (0,5 g/litr), MgS04.7H2O (0,3 g/litr), kukuřičný výluh (1,0 g/litr) a kvasnicový extrakt (3,0 g/litr) a mořská voda po úpravě jejího pH na 7,0. Fermentovaný celý bujón (10,5 litrů) byl třikrát extrahován EtOAc za vzniku EtOAc roztoku, který byl zahuštěn za sníženého tlaku, čímž byl získán surový extrakt (9,5 g).

Očista

Surový extrakt (9,5 g) byl rozdělen do 15 frakcí na silikagelové koloně za použití krokové gradientové eluce petrolether/Me2CO. Frakce 2, eluovaná 8 : 2 petrolether/Me2CO, byla rekrystalizována z MeOH, čímž byla získána sloučenina 3 ve formě bezbarvých jehlic (8.{{10}} mg). Frakce 3 (19.{{30}}} mg), eluovaná 7 : 3 petrolether/Me2CO, byla dále separována na koloně s reverzní fází (RP18, 40 6{{38 }} mm, Merck;MeOH-H20 3:2—>4:1——MeOH) za vzniku fr. 3 7 (8.{41}} mg), který byl purifikován extenzivním PHPLC (60 procent MeOH obsahující {{70}},1 procenta TFA, 4.{{77} } ml/minutu), čímž se získá 4 (2.{{80}} mg). Frakce 4 (26,0 mg), eluovaná 6 : 4 petrolether/Me2CO, byla dále separována na koloně s reverzní fází (RP18, 40 60 mm, Merck; MeOH - H20 3:2 -> 4:1 -> MeOH). fr. 4-3 (5,4 mg) a fr. 4-9 (7,6 mg). Potom fr. 4-3 byl oddělen extenzivním PHPLC [YMC-pack ODS (A), 10 250 mm, 5 mm, 4,0 ml/minutu] (60 procent MeOH, 4,0 ml/min), čímž se získal 2 (1,0 mg) a fr. 4-9 byl oddělen extenzivním PHPLC (80 procent MeOH, 4,0 ml/minutu) za získání 1 (4,0 mg) a 5 (2,6 mg). 1: získaný jako světle žlutá pevná látka; [a]D25 24,5 stupně (c 0,155, MeOH); UV (MeOH) 1 max 208, 251 nm; CD (MeOH) (viz obr. 4); IR (KBr) nmax 3433, 3200, 3076, 2928, 2862, 1677, 1440, 1370, 1324, 1188, 1029 cm1; 'H- a 13C-NMR (viz tabulka 1); HRESI-MS m/z 448,2951 [MH] (vypočteno pro C28H38N3O2, 448,2964)

DPPH Radical Scavenging Effect

MeOH roztok (160 ml) o různých koncentracích vzorku (1,{3}} mg/ml 0,0001 mg/ml) byl přidán do 40 ml DPPH (1,1- difenyl{{8 }}pikrylhydrazyl;Sigma) roztok MeOH (1,5 x 104 M). Po mírném promíchání a ponechání po dobu 30 minut při teplotě místnosti byla změřena optická hustota při 520 nm pomocí spektrofotometru. Antioxidační aktivita každého vzorku byla vyjádřena jako IC50 (mg/ml nebo mM požadovaných k inhibici tvorby radikálů DPPH o 50 procent) a vypočtena z logaritmické inhibiční křivky dávky.

neuroprotective of cistanche deserticola

neuroprotektivum cistanche deserticola

Buněčná kultura a léčba léky

Buňky lidského neuroblastomu SH-SY5Y byly kultivovány v médiu DMEM a udržovány při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře s 5 0 procenty CO2. Tyto buněčné suspenze (180 ml) o hustotě 5*104ml buněk-1 byly umístěny na 96- jamkové mikrotitrační destičky a inkubovány po dobu 24 hodin při výše uvedenou podmínku. Do každé jamky s výjimkou kontrolní a modelové skupiny byl přidán roztok chrysogenamidu A (2,0 ml v DMSO) v různých koncentracích a dále inkubován po dobu 1 hodiny za stejných podmínek. H202 (Sigma Chemical Co., MO, USA) byla přidána k indukci apoptózy v buňkách SH-SY5Y v konečné koncentraci 200 mM po dobu 24 hodin. Životaschopnost buněk byla stanovena pomocí MTT testu. MTT rozpuštěný ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem byl přidán na konci inkubace na konečnou koncentraci 5,0 mg/ml (PBS) a poté inkubován při 37 stupních po dobu 4 hodin. Po odstranění supernatantu byl výsledný formazanový produkt rozpuštěn.

Výsledky a diskuse

1 byla získána jako světle žlutá pevná látka. Molekulární vzorec byl stanoven jako C28H37N3O2 pomocí HRESI-MS (pozorováno [MH] při m/z 448,2951, nazváno [MH] C28H38N3O2, 448,2964). IR spektrum naznačovalo přítomnost NH (3433 a 3200 cm1) a karbonylové skupiny (skupin) (1677 cm-1). 'H-NMR (tabulka 1) spektrum zaznamenané v DMSO-d6 odhalilo tři methylové skupiny (dH 0,62, 0,87, 0,98) a dva signály vyměnitelných protonů (dH 10,36 a 8,29). Kromě toho tři ortos spojené aromatické signály (dH 6,90 dd, J 7,3, 7,3 Hz, 6,94 d, J 7,3 Hz a 7,18 J 7,3 Hz) indikovaly 1,2,3-trisubstituovaný benzenový kruh. Methylenové protony (d H 3,23) spojené s olefinickým protonem (d H 5,27) spolu se dvěma vinylovými methyly (d H 1,67 a 1,70) indikovaly přítomnost 3-methyl-2-butenylové skupiny v 1. Jednovazebné konektivity těchto protonů a dalších 14 methinových a/nebo methylenových protonů byly stanoveny experimentem HMQC. 13C-NMR a DEPT spektra (tabulka 1), která odhalila 28 signálů, také potvrdila přítomnost těchto dvou fragmentů [trisubstituovaný benzenový kruh (dC 123,6 CH, 120,8 CH, 127,7 CH, 122,1 QC a 140,4 QC) a { {79}}methyl-2-butenyl (dC28CH2, 121,9 CH, 132,3 QC, 25,5 CH3 a 17,7 CH3)]; kromě toho dva karbonyly (dC 183,1 a 172,3), čtyři sp3 kvartérní uhlíky (dC 46,5, 58,7, 60,4 a 62,3), dva sp3 methiny (dC 46,1 a 58,7) a šest sp3 methylenů (dC 31,8,7, dC 20,8,7 35,2, 39,9 a 64,9). Protože bylo zohledněno 6 z 12 nenasycení, bylo usouzeno, že 1 obsahuje šest kruhů. Další vyhodnocení těchto spektrálních dat spolu s výsledky 1H-1H COSY a HMBC odhalilo, že 1 úzce souvisí s marcfortinovou skupinou metabolitů hub [7]. Interpretace HMBC korelací (obr. 2) naznačila přítomnost dílčí struktury A (HMBC korelace 1-NH až C-8 a C-9; H-6 až C{{ 136}}; H-5 na C-7 a C-9; H-26 na C-28 a C-8 a H{143 }} až C-29 a C-30) a B (HMBC korelace H-10 až C-3, C-22, C-21, C-11, C{151}}; H-20 až C-13, C-18, C-22, C-11 a { {157}}NH až C-13, C-10) a C, šestičlenný kruh G [8] s methylovaným uhlíkem na C-17 (HMBC korelace H{{ 163}} až C-17, C-16). Konektivita substruktury A až B až C-3 byla podpořena klíčovými korelacemi HMBC z H-4 a 1-NH do C-3; H-10 až C-2 a C{172}}. Spojení mezi strukturou B a C s atomem dusíku bylo odvozeno klíčovými korelacemi HMBC z H-12 do C-17 a C-13 a porovnáním jejich odpovídajících chemických posunů C{{176 }} a C-17 (dC 64,9 a 58,7). Výše uvedená analýza ukázala, že 1 má podobnou strukturu jako marcfortin A s výjimkou rozdílů v postranním řetězci na benzenovém kruhu a methylu na C-17 šestičlenného kruhu G. Takže hrubá struktura 1 byla přiřazena, jak je znázorněno na obr. 1

Relativní stereochemie 1 byla objasněna na základě dat NOESY (obr. 3). Předchozí studie odhalily, že sloučeniny typu 2-oxindolových alkaloidů přijaly konformaci, ve které je centrální pětičlenný kruh ortogonální k rovině oxindolové podjednotky [9].

NOESY korelace mezi H{{0}} a H-10a, H-25 a mezi 19-NH a H-10a naznačovaly, že obě byly na přední straně cyklopentanonového kruhu, který je orientuje směrem k H-4, fixující relativní stereochemii na C-3, jak je znázorněno. Interakce NOESY mezi H-21, H-12a, H-10b, H-23 a H-24 umístily odpovídající substituenty společně na přední stranu cyklopentanonový kruh. Relativní stereochemie navržená pro 1 je v souladu s relevantními rysy relativní stereochemie marcfortinu A [7]. Cottonův efekt při 200-250 nm vzniká np* přechodem diketopiperazinových amidových vazeb, který je diagnostický pro bicyklo-[2.2.2]diazaoktan diketopiperazinové jádro [10, 11]. CD spektrum 1 (obr. 4) korelovalo s relevantními oblastmi spektra -brvianamidu A [11]. Takže absolutní stereochemie 1 by měla být 3S, 11S, 13S, 17S, 21R a dostala název chrysogenamid A. Předběžné hodnocení ochranného účinku chrysogenamidu A na neurocyty bylo hodnoceno pomocí buněčné smrti indukované oxidačním stresem u SH-SY5Y buněk pomocí MTT testu. Aktivita chrysogenamidu A zachycující volné radikály byla poprvé zkoumána pomocí DPPH jako dárce volných radikálů. Na rozdíl od vitaminu C (IC50: 29,0 mM) chrysogenamid A nevykazoval žádnou schopnost (IC50 větší nebo rovno 100 mM) vychytávat volné radikály DPPH v koncentraci až 100 mM. Mezitím jsme testovali, zda chrysogenamid A chrání buňky před buněčnou smrtí vyvolanou oxidačním stresem u lidského neuroblastomu SH-SY5Y

buňky. Oxidační stres peroxidem vodíku vedl ke snížení životaschopnosti buněk o 43 procent ve srovnání s kontrolní skupinou. Chrysogenamid A inhiboval buněčnou smrt vyvolanou peroxidem vodíku zlepšením životaschopnosti buněk o 59,6 procent při koncentraci 1*10-4 mM. Tato data naznačují, že chrysogenamid A vykazoval ochranný účinek neurocytů proti buněčné smrti vyvolané oxidačním stresem, nikoli prostřednictvím své antioxidační aktivity. Indolové alkaloidy mající neobvyklý bicyklo [2.2.2] diazaoktanový kruhový systém byly izolovány z různých rodů hub, jako je Aspergillus [12, 9, 13], Penicillium [14 16] a Malbranchea [17]. 1 byl novým členem této skupiny sloučenin, měl kostru, o níž se očekávalo, že bude meziproduktem v biosyntéze citrinových adminů A a B, které byly popsány jako nová třída pentacyklických spiroin dolinonových alkaloidů v roce 2005 [18]. Ze strukturálního hlediska je důležité zdůraznit, že 1 je unikátní struktura s methylací v pozici C-17 a 2- oxindolovou skupinou mající isoprenovou jednotku v C-7. Některé z těchto dosud izolovaných indolových alkaloidů vykazují silnou antiparazitární aktivitu [19], inhibici lidských nádorových buněk [13] a cytotoxicitu [10]. Podle našich nejlepších znalostí je to první zpráva o neuroprotekci tímto typem alkaloidů.

PotvrzeníTato práce byla finančně podpořena Čínským národním přírodním vědeckým fondem (č. 30472136).

Prevent Alzheimer's disease

neuroprotektivum cistanche deserticola: anti-Alzheimerova choroba

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte sem a dozvíte se více

Reference

Li LL, Wang XW, Wang XF. Antilipidová peroxidace a antiradiační působení glykosidů vherba Cistanches. China J Chin Mater Med 22: 364–367 (1997)
Xie JH, Wu CF. Účinek ethanolového extraktu zCistanche deserticolana obsah monoaminových neurotransmiterů v mozku krys. Chin Trad Herb Drugs 24: 417–419 (1993)
Dai JR, Carte BK, Sidebottom PJ, Yew ALS, Ng SB, Huang Y, Butler MS. Circumdatin G, nový alkaloid z houby Aspergillus ochraceus. J Nat Prod 64: 125–126 84 Obr. 2 Klíč HMBC a 1 H-1 H COZY korelace 1. Obr. 3 NOESYs 1. Obr. 4 CD spektrum 1.(2001)
Kettering M, Sterner O, Anke T. Antibiotika v chemické komunikaci hub. Zeitschrift fuer Naturforschung, C: Journal of Biosciences 59: 816–823 (2004)
Trifonov LS, Bieri JH, Prewo R, Dreiding AS, Hoesch L, Rast DM. Izolace a objasnění struktury tří metabolitů z Verticillium intertextum: sorbicilin, dihydrosorbicilin a bisvertinochinol. Tetrahedron 39: 4243–4256 (1983)
Zhang GL, Xing QY, Zhang MZ. Glykolipidy z Mirabilis Himalaya. Phytochemistry 45: 1213-1215 (1997)
Polonsky J, Merrien MA, Prange T, Pascard C, Moreau S. Izolace a struktura (rentgenová analýza) marcfortinu A, nového alkaloidu z Penicillium roqueforti. JCS Chem Comm 13: 601–602 (1980)
Lee BH, Kornis GI, Cialdella JI, Clothier MF, Marshall VP, Martin DG, McNally PL, Mizsak SA, Whaley HA, Wiley VH. Mikrobiologická hydroxylace na šesti jednotlivých atomech uhlíku marcfortinu A. J Nat Prod 60: 1139–1142 (1997)
Whyte AC, Gloer JB, Wicklow DT, Dowd PF. Sklerotiamid: Nový člen třídy paraherquamidů se silnou antiinsektanovou aktivitou ze sklerocií Aspergillus sclerotiorum. J Nat Prod 59: 1093–1095 (1996)
Kato H, Yoshida T, Tokue T, Nojiri Y, Hirota H, Ohta T, Williams RM, Tsukamoto S. Notoamidy AD: prenylované indolové alkaloidy izolované z houby pocházející z moře, Aspergillus sp. Angew Chem Int Ed 46: 2254–2256 (2007)
Williams RM, Kwast E, Coffman H, Glinka T. Pozoruhodná, enantio-divergentní biogeneze brevianamidu A a B. J Am Chem Soc 111: 3064–3065 (1989)
Banks RM, Blanchflflower SE, Everett JR, Manger BR, Reading C. Nové anthelmintické metabolity z druhu Aspergillus: aspergilimidy. J Antibiot 50: 840–846 (1997)
Qian-Cutrone J, Haung S, Shu YZ, Vyas D, Fairchild C, Menendez A, Krampitz K, Dalterio R, Klohr SE, Gao Q. J Am Chem Soc 124: 14556–14557 (2002)
Wilson BJ, Yang DTC, Harris TM. Produkce, izolace a předběžné studie toxicity brevianamidu A z kultur Penicillium Viridicatum. Appl Microbiol 26: 633–635 (1973)
Birch AJ, Russell RA. Studie ve vztahu k biosyntéze XLIV. Strukturní objasnění brevianamidů B, C, D a F. Tetrahedron 28: 2999–3008 (1972)
Liesch JM, Wichmann CF. Nová antinematodální a antiparazitická činidla z Penicillium Charles. II. Stanovení struktury paraherquamidů B, C, D, E, F a G. J Antibiot 43: 1380–1386 (1990) 17. Martinez-Luis S, Rodriguez R, Acevedo L, Gonzalez MC, Lira-Rocha A, Mata R Malbrancheamid, nový inhibitor kalmodulinu z houby Malbranchea aurantiaca. Tetrahedron 62: 1817–1822 (2006)
Mishima T, Tsuda M, Kasa Y, Ishiyama H, Fukushi E, Kawabata J, Watanabe M, Akao K, Kobayashi J. Absolutní stereochemie citrinadinů A a B z mořské houby. J Org Chem 70: 9430–9435 (2005)
Lopez-Greta MP, Gonzalez MC, Ciavatta L, Ayala I, Moya P, Primo J. Insekticidní aktivita paraherquamidů, paraherquamidů, včetně paraherquamidu H a paraherquamidu I, dva nové alkaloidy izolované z Penicillium cluniae. J Agric Food Chem 54: 2921–2925 (2006)