czJazyk
Domů / Znalost / Obsah

Znalost

Chimérické částice viru podobné lidskému papilomaviru-16 prezentující peptidy P18I10 a T20 z HIV-1 Obálka indukující HPV16 a HIV-1-Specifická humorální a T buňkami zprostředkovaná imunita u myší BALB/c

Dec 07, 2023

Abstraktní:

V této studii byly HIV-1 P18I10 CTL peptid odvozený z V3 smyčky HIV-1 gp120 a T20 antifúzní peptid HIV-1 gp41 vloženy do kapsidového proteinu HPV16 L1 pro konstrukci chimérických HPV: HIV (L1:P18I10 a L1:T20) VLP s použitím expresního systému savčích buněk. HPV: HIV VLP byly purifikovány chromatografií. Prokázali jsme, že inzerce peptidů P18I10 nebo T20 do DE smyčky kapsidových proteinů HPV16 L1 neovlivnila in vitro stabilitu, samouspořádání a morfologii chimérických HPV: HIV VLP. Důležité je, že neinterferovala ani s reaktivitou protilátek HIV{23}} zaměřených na sekvenční a konformační peptidy P18I10 a T20 prezentované na chimérických HPV:HIV VLP, ani s indukcí protilátek specifických pro HPV16 L1- in vivo. Zjistili jsme, že chimérické vakcíny L1:P18I10/L1:T20 VLPs mohly vyvolat HPV16-, ale slabé HIV-1-specifické protilátkové odpovědi a vyvolaly HPV16- a HIV-1-specifické T- buněčné odpovědi u BALB/c myší. Navíc by mohl být potenciálním boosterem pro zvýšení HIV-specifických buněčných odpovědí při heterologní imunizaci po primování vakcínou BCG.HIVA. Tato výzkumná práce by přispěla k vývoji nové chimérické vakcíny HPV: HIV VLP na bázi vakcíny pro kontrolu infekce HPV16 a HIV-1, která je naléhavě potřebná v rozvojových a průmyslových zemích.

Desert ginseng-Improve immunity (12)

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

klíčová slova:

HIV-1; HPV16; vakcína; viru podobné částice; P18I10; T20 enfuvirtid; BCG.HIVA; humorální imunita; Imunita zprostředkovaná T buňkami

1. Úvod

Virus lidské imunodeficience-1 (HIV-1), který způsobuje syndrom získané imunodeficience (AIDS), byl objeven na počátku 80. let a od té doby se stal celosvětovou epidemií [1]. Ačkoli vysoce aktivní antiretrovirová léčba (HAART) může mít spolu s preexpoziční profylaxií (PrEP) skutečný dopad na kontrolu infekce HIV-1, očkování je stále základním přístupem pro veřejný prospěch a zavedení konec celosvětové epidemie HIV-1 [2]. Navzdory více než třem desetiletím důkladného výzkumu HIV-1 a četným klinickým studiím vakcín je dosud licencovaná vakcína proti HIV{10}} stále nedosažitelná. Studie RV144 provedená v Thajsku byla prvním případem, který odhalil skromnou 31,2% účinnost proti získání infekce HIV-1 [3]. Většina dalších kandidátů na vakcínu proti HIV{16}}, které prošly klinickými studiemi, byla založena hlavně na modelech DNA, rekombinantních virových vektorů nebo podjednotkových proteinů [4,5]. V ideálním případě je účinná vakcína proti HIV-1 schopná vyvolat vrozené imunitní odpovědi, neutralizovat protilátky, aby se zabránilo virové infekci [6], a také odpovědi cytotoxických T lymfocytů (CTL) k odstranění infikovaných buněk [7]. Vyvolání každé odpovědi však může vyžadovat různé očkovací strategie, což vyžaduje samostatné, ale paralelní vývojové úsilí. Výběr imunogenů a transportních vektorů bude mít významný dopad na funkci a specificitu HIV-1 vakcín [8,9]. Opakované neúspěchy při použití standardních přístupů pro vývoj vakcíny proti HIV-1 vedly k uznání důležitosti výběru transportního vektoru, režimů prime-boost a imunogenní specificity v humorálních i buněčných odpovědích. Je již známo více než 100 typů lidského papilomaviru (HPV) a HPV genotypy 16 a 18 jsou považovány za zodpovědné za přibližně 70 % karcinomů děložního čípku na celém světě [10]. Částice podobné viru HPV L1 (VLP), klasifikované jako typ podjednotkových vakcín, by mohly převážně indukovat srovnatelné L1- specifické humorální odpovědi na virion divokého typu a také odpovědi zprostředkované T buňkami [11–13]. V současné době jsou na trhu licencovány tři preventivní vakcíny proti HPV a všechny jsou založeny na VLP kapsidového proteinu HPV L1. Dva z nich, Gardasil (Merck, Rahway, NJ, USA) a Gardasil{40}} (Merck), jsou produkovány kvasinkovým expresním systémem (Saccharomyces cerevisiae), zatímco druhý, Cervarix (GSK, Brentford, UK), je produkován systémem bakulovirový expresní vektor/hmyzí buňka (BEVS/IC) [14]. Až dosud nebyly optimální podmínky produkce proteinů HPV16 L1 v savčím expresním systému dobře stanoveny. Vývoj kombinované vakcíny, která by chránila před infekcemi HPV a HIV, je tedy logickým úsilím v boji proti těmto dvěma hlavním globálním patogenům.

V naší předchozí přehledové publikaci týkající se návrhových konceptů vakcín proti HIV-1 na bázi virových částic (VLP) jsme zmínili, že neobalené VLP, jako jsou papilomavirové VLP, by mohly hrát funkční roli jako transportní vektory. HIV-1 CTL nebo epitopy neutralizujících protilátek [15,16]. Tato hypotéza byla potvrzena u několika chimérických bovinních papilomavirů (BPV) L1 VLP prezentujících P18I10 CTL epitop z V3 smyčky gp120 HIV-1 obalového proteinu (Env) a 2F5 epitop nebo MPER oblast gp41 HIV-1 Env [17–22]. Strukturní rys kapsidových proteinů L1 lidského papilomaviru typu-16 (HPV16) je podobný jako u BPV a mohl by se samosestavit do jednovrstvých L1 VLP [23]. Pět z HPV16 L1 proteinů tvoří pentamer a 72 z pentamerů se samosestaví do HPV16 VLP [24]. Stále však neexistuje jasný důkaz, že by chimérické kapsidové proteiny HPV16:HIV mohly být stabilní in vitro a mohly by se samosestavit do morfologicky integrálních VLP. Na druhé straně bylo prokázáno, že HPV16 L1 VLP jsou vysoce imunogenní a jsou schopné indukovat antigenně specifické imunitní reakce T a B buněk [11–13]. Stále se uvidí, zda prezentace epitopů HIV{40}} prostřednictvím HPV: HIV VLPs by mohla být imunogenní. V této studii jsme se zaměřili na vývoj chimérické VLP na bázi HPV: HIV vakcíny s použitím lidských 293F buněk, dobře zavedeného savčího buněčného expresního systému. Protein HPV 16 L1 fungoval jako strukturní skelet vakcíny a peptidy P18I10 a T20 byly vybrány jako HIV-1 imunogeny a vloženy do DE smyčky proteinu HPV 16 L1. Imunodominantní P18I10 CTL epitop obsahující 10 aminokyselin (zbytky 311–320: RGP GRAFVTI) je odvozen od třetí variabilní domény (V3) obalového glykoproteinu HIV-1 gp120. Peptid P18I10 byl identifikován jako molekula MHC I. třídy omezená na H-2Dd, která indukuje odpovědi cytotoxických T lymfocytů (CTL) [25,26]. Peptid T20, známý jako Enfuvirtid a navržený jako antiretrovirový multimerní fúzní peptid, se skládá z 36 aminokyselinové sekvence (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF) napodobující C-koncovou sekvenci heptad helix blízko membrány0 s proximální vnější oblast (MPER) obalového glykoproteinu 41 (gp41) HIV-1 [27]. Tyto dva epitopy na bázi HIV-1 T (P18I10) a B (T20) buněk byly vybrány jako výchozí bod a důkaz koncepčního experimentu pro chimérickou VLP na bázi HPV: platformu pro vývoj vakcíny proti HIV.

Během poslední dekády bylo testováno mnoho různých formátů primární dávky vakcíny proti HIV-1 založené na VLP [15]. Ačkoli většina předchozích HIV-1 VLP [28] nebo chimérických BPV: HIV VLP [17–22] vakcinačních strategií byla zaměřena na vyvolání imunitních odpovědí pomocí homologního režimu prime-boost, dvě dřívější studie naznačovaly, že heterologní imunizace skládající se z rekombinantníchMycobacterium bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG) exprimující HIV-1 Gag prime a HIV-1 Gag VLP boost může přispět ke zvýšení imunity T-buněk [29,30]. V naší výzkumné skupině jsme prokázali priming imunogenem HIV exprimujícím rBCG a booster rekombinantním virovým vektorem MVA. HIVA byl bezpečný a vyvolal HIV-1-specifické imunitní reakce T-buněk u BALB/c myší [31–33]. Imunogen HIV, navržený Dr. Tomasem Hankem, se skládá z kompletního HIV-1 Gag proteinu kombinovaného s více CTL epitopy včetně P18I10 epitopů na C-konci [34]. Proto jsme se zaměřili na vyhodnocení, zda BCG.HIVA může posílit imunitní reakce T-buněk indukované HIV: HPV (L1:P18I10) VLP u BALB/c myší.

V této studii byly navrženy a produkovány chimérické imunogeny HPV: HIV (L1:P18I10 a L1:T20) pomocí expresního systému 293F. Exprese chimérického proteinu L1:P18I10 a L1:T20 byla potvrzena imunobarvením. HPV:HIV VLP byly následně purifikovány 3-krokovou chromatografickou metodou, včetně kationtové (CEC), velikostně vylučovací (SEC) a heparinové afinitní (H-AC) chromatografie. Poté byla in vitro stabilita, in vitro samouspořádání a morfologie purifikovaných HPV: HIV VLP potvrzena neredukující SDS-PAGE, testem molekulové hmotnosti a transmisní elektronovou mikroskopií (TEM). Sekvenční a konformační peptidy P18I10 a T20 prezentované na chimérických HPV: HIV VLP byly dále charakterizovány anti-HIV-1 gp120 V3 a 2F5 monoklonálními protilátkami in vitro za použití Western blotu a nepřímého testu ELISA. Nakonec byla imunogenicita HPV:HIV VLP hodnocena na myším modelu BALB/c. Prokázali jsme, že chimérické vakcíny na bázi VLP L1:P18I10 a L1:T20 mohou indukovat HPV16- a HIV-1-specifické protilátkové reakce a chimérické L1:P18I10 VLP mohou indukovat HPV16- a HIV{ {37}}specifické reakce T-buněk u BALB/c myší. Vzhledem k tomu, že vývoj a výroba imunogenní vakcíny proti HPV: HIV je stále nedosažitelná, tato studie poskytla základní strategii, která by mohla stát za to, aby podpořila celosvětové úsilí o vývoj nových chimérických vakcín na bázi VLP pro kontrolu infekcí HPV a HIV{40}}.

2. Materiály a metody

2.1. Konstrukce vakcinačního kmene BCG.HIVA2auxo.int

Rekombinantní BCG exprimující HIVA imunogen byl dříve zkonstruován pomocí E. coli-mykobakteriálního integračního kyvadlového vektoru p2auxo.int. Konstrukce E. coli/mykobakteriálního vektoru exprimujícího HIVA antigen byla popsána již dříve [31–33]. BCG.HIVA2auxo.int byl zředěn v PBS-Tween20 na 2 x 107 cfu/ml, sonikován, aby se rozrušily bakteriální shluky, a naočkován do zadní potravní podložky nebo BALB/c myší (50 ul, 106 cfu/myš).

Desert ginseng-Improve immunity (23)

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

2.2. Bakteriální kultury a transformace

Buňky glycinového auxotrofního kmene E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, USA), poskytnuté Dr. Pau Ferrerem, byly kultivovány v minimálním M9-derivačním médiu (M9-D: Na2HPO4, 6,78 g/L; KH2PO4, 3 g/L; NaCl, {{10}},5 g/L; NH4Cl, 1 g/L, glukóza, 1{{20 }} g/l; MgS04, 2 mmol/l; CaCl2, 0,1 mmol/l; thiamin, 0,1 g/l; FeCl3, 0.{{56 }} 25 g/l; AlCl3·6H2O, 0,13 mg/l; ZnSO4·7H2O, 2,6 mg/l; CoCl2·6H2O, 0,47 mg/l; CuSO4·H2O, 4,6 mg/l; H3BO3, 0.{101}}3 mg/l; MnCl2·4H2O, 4,2 mg/l; NiCl2·6H2O, 0,02 mg/l; Na2MoO4·2H2O, 0,06 mg/l) doplněný glycinem (70 ug/ml). Buňky E. coli M151Gly byly transformovány plasmidy p2auxo.HIVA elektroporací. Za tímto účelem byly kultury E. coli pěstovány na optickou hustotu 0,9 při 600 nm a transformovány pomocí Bio-Rad genového pulzního elektroporátoru při 2,5 kV, 25 uF a 200 Ω. Transformované buňky byly následně kultivovány na M9-D agarových plotnách (komponenty, jak bylo popsáno dříve, s 1,5% přidaným baktoagarem) bez suplementace glycinem pro selekci nebo se suplementací glycinu jako kontrola. Lysinový auxotrofní kmen BCG, BCG∆lys, laskavě poskytnutý WR Jacobs Jr., BR Bloom a T. Hsu, byl transformován plasmidovou DNA p2auxo.HIVAint elektroporací. Mykobakterie byly kultivovány v médiu Middlebrook 7H9 nebo na médiu Middlebrook agar 7H10 doplněném albumin-dextróza-katalázou (ADC; Difco) obsahující 0,05 % Tween 80. L-lysin monohydrochlorid (Sigma, Kawasaki, Japonsko) byl rozpuštěn v destilované vodě a používá se jako doplněk v konečné koncentraci 40 ug/ml. Pro transformaci byl BCG kultivován na optickou hustotu 1,5 při 600 nm a transformován pomocí Bio-Rad genového pulzního elektroporátoru při 2,5 kV, 25 uF a 1000 Ω. Transformanty byly poté kultivovány na médiu Middlebrook agar 7H10 doplněném ADC obsahujícím 0,05 % Tween 80 bez doplnění lysinu.

2.3. Buněčné linie a buněčné kultury

Buňky 293F (Tibco), odvozené z buněk lidské embryonální ledviny (HEK) 293, byly kultivovány v expresním médiu FreeStyle 293 (Tibco) doplněném 5 ml/l penicilin-streptomycinu (Tibco) a inkubovány v inkubátoru při 37 ◦C obsahujícím zvlhčená atmosféra 5% CO2 na orbitální třepačce rotující rychlostí 125 ot./min.

2.4. Produkce proteinů L1:P18I10 a L1:T20 pomocí expresního systému 293F

Konstrukt pCDNA3.1 obsahoval L1:P18I10 nebo L1:T20 DNA kódující sekvence odpovídající chimérickým L1:P18I10 a L1:T20 proteinům, v daném pořadí. HIV-1 P18I10 CTL peptid (RGPGRAFVTI) nebo T20 peptid (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) byly vloženy do DE smyčky kapsidového proteinu HPV16 L1. Sekvence smyčky DE HPV16 L1 kódující 130–136 aminokyselin byla nahrazena buď peptidem P18I10I10 nebo T20. Kódující sekvence DNA L1:P18I10 nebo L1:T20 byly modifikovány Kozakovou sekvencí, optimalizovány lidským kodonem, ohraničeny místy pro restrikční enzymy HindIII a Xbal a klonovány do vektoru pcDNA3.1(+) pomocí služeb genové syntézy GeneArt ( Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Rekombinantní plazmidová DNA (pDNA) byla transformována do E. coli DH5 kompetentních buněk (Invitrogen) pro amplifikaci a extrahována pomocí plazmidových Maxi kitů (QIAGEN, Hilden, Německo). Buňky 293F byly kultivovány s 30 ml expresního média FreeStyle 293 ve 125 ml Erlenmeyerově baňce (Corning, New York, NY, USA) na hustotu 1,0 x 106/ml a přechodně transfekovány L1:P18I10 nebo L1:T20 pomocí rozvětveného pD polyethylenimin s molekulovou hmotností 25 kDa (PEI-25}K) (Polysciences) při optimalizovaném poměru DNA k PEI 1:3 (w/w) a DNA ke kultivačnímu médiu 1:1 (w/v), podle podle pokynů výrobce [35]. Buňky 293F byly sklizeny 96 hodin po transfekci. Buňky 293F mohou dosáhnout hustoty konfluentu 3,6 x 106 buněk/ml s přibližně 50% životaschopností.

2.5. Imunofluorescenční barvení

Buňky byly permeabilizovány na podložním sklíčku 100% studeným acetonem. Následně byly fixované buňky sondovány anti-HPV16 L1 protilátkou CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, UK) a zachyceny anti-myším IgG-FITC (Sigma). Imunitně obarvené buněčné monovrstvy byly důkladně promyty PBS a pokryty montážním médiem s DAPI (Abcam). Imunofluorescenční snímky byly kontrolovány pod inverzním mikroskopem při 40násobném zvětšení. Účinnost transfekce byla stanovena poměrem FITC (zeleně)-pozitivních buněk k DAPI (modře)-obarveným buňkám.

2.6. Purifikace HPV: HIV (L1:P18I10 a L1:T20) VLP

Celkem 108 transfekovaných buněk 293F ve 125ml Erlenmeyerově baňce (30 ml kultivačního média/baňka) bylo shromážděno centrifugací při 1500 otáčkách za minutu po dobu 5 minut a dvakrát promyto PBS. Buněčné pelety byly resuspendovány v lyzačním pufru formulovaném s 1% Tritonem X-100, inhibitorem proteázy (1:100) (Millipore) a Benzonase (25 U/ml) (Millipore). Buněčné lyzáty byly vyčeřeny 0,45 um PVDF injekčním filtrem (Millipore). Vzorky HPV: HIV (L1:P18I10 a L1:T20) VLP byly sériově purifikovány pomocí výměny kationtů (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, USA), vylučování podle velikosti (Capto Core 700, GE) a afinity (HiTrap Heparin HP , GE) chromatografie. Chromatografické protokoly byly popsány v našich předchozích studiích [36,37] a řídily se protokolem výrobce [38]. L1 proteinový signál v každém purifikačním kroku byl charakterizován analýzou Western blot a sondován anti-HPV16 L1 protilátkou CAMVIR-1 [39].

2.7. Neredukující SDS-PAGE

VLP HPV16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 byly smíchány s 2× Laemmliho vzorkovým pufrem (BIO-RAD) v nepřítomnosti nebo přítomnosti 5 % (v/v) 2-merkaptoethanolu ({{11} }ME) a ​​reagovaly při teplotě místnosti (RT) po dobu 24 hodin. Vzorky byly odděleny 8–16% TGX proteinovými gely bez skvrn (BIO-RAD). Poté byly gely přeneseny na PVDF membrány. Membrány byly sondovány s anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb v ředění 1:4000. Poté byly membrány inkubovány s anti-myším IgG peroxidázovým konjugátem (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) při ředění 1:4000. Signál byl vyvinut a vizualizován chemiluminiscencí za použití substrátové sady Western Blot ECL (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Snímky blotu byly získány pomocí zobrazovacího systému Odyssey Fc.

2.8. Analýza molekulové hmotnosti

HPV16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 VLP bez ošetření 2-ME byly odfiltrovány přes ultrafiltrační zařízení s mezní hodnotou molekulové hmotnosti (MWCO) 1000 kDa (SARTORIUS). HPV16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 VLP s úpravou 2-ME prošly ultrafiltračním zařízením MWCO 100 kDa (Amicon). Retentáty byly rekonstituovány na původní objem a shromážděny ze zásobníku vzorku filtračního zařízení, zatímco filtráty byly shromážděny na dně centrifugační zkumavky. Signál LI byl měřen pomocí dot blot sondované s anti-HPV16 LI mAb a detekován konjugátem anti-myší IgG-peroxidáza (Sigma-Aldrich). Snímky byly získány pomocí systému Odyssey Fc Imaging System na chemiluminiscenčním kanálu.

Desert ginseng-Improve immunity

Výhody cistanche tubulosa- posílení imunitního systému

2.9. Negativní barvení a transmisní elektronová mikroskopie

Po nabití uhlíkem potažených měděných mřížek (Sigma-Aldrich) pod ultrafialovým světlem po dobu 5 minut, komerční HPV16 L1 (Abcam), purifikované L1:P18I10 a L1:T20 VLPs ekvilibrované 20 mM Tris-HCl (pH 7,4, 137 mM NaCl ) byly absorbovány na mřížkách po dobu 1 minuty a třikrát opláchnuty vodou miliQ. HPV: HIV VLP byly negativně obarveny 2% uranylacetátem při pH 4,5 (Sigma-Aldrich) po dobu 1 minuty. Přebytek barvících činidel byl odstraněn kvalitativním filtračním papírem Whatman (Sigma-Aldrich). Mřížky byly umístěny do komory odvlhčovače alespoň 2 hodiny před pozorováním. Snímky byly pořízeny pomocí transmisního elektronového mikroskopu (Tecnai Spirit 120 kV) při zvětšení SA135K (100 nm), respektive SA59000 (200 nm).

2.10. Elektroforéza v gelu dodecylsulfát sodný – polyakrylamid a analýza Western blotting

Stejná množství (500 ng) HPV16 L1 proteinu (Abcam), purifikovaných L1:P18I10 a L1:T20 VLPs byla smíchána s 2× Laemmli vzorkovým pufrem obsahujícím 5 % 2-ME a vařena při 95 ◦C po dobu 5 minut . Vzorky byly separovány 8–16% TGX proteinovými gely bez skvrn a poté přeneseny na PVDF membránu (Millipore, Burlington, MA, USA) pomocí Semi-Dry transfer device (Bio-Rad). Membrána byla blokována 5% odstředěným mlékem v TBST. Poté byly membrány sondovány pomocí anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb v ředění 1:4000, anti-HIV-1 gp120 V3 smyčkové mAb (NIBSC, EVA3012) v ředění 1: 40 a HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) v ředění 1:4000, v daném pořadí. Poté byly membrány inkubovány s anti-myším IgG peroxidázovým konjugátem (Sigma-Aldrich) při ředění 1:4000. Pro vývoj signálu byl použit Western ECL substrát kit (BIO-RAD). Snímky blotu byly získány pomocí zobrazovacího systému Odyssey Fc na chemiluminiscenčním kanálu.

2.11. Imunizace myší, odběr sér a izolace splenocytů

Toto je předběžná studie proof-of-concept, která má prokázat imunogenicitu HPV: HIV VLP (L1:P18I10 a L1:T20 VLPs). Dávka, způsob podání a interval primární posilovací dávky našich HPV: HIV VLP odkazovaly na předchozí studie, které imunizovaly myši bovinním papilomavirem (BPV): HIV VLP pro indukci protilátkové odpovědi [20,21]. Purifikovaný HPV: HIV VLP byly emulgovány se stejným objemem (225 µg na každou 0,5 ml dávku) hydroxyfosfát síranu hlinitého (Thermo Fisher), aby se zajistila podobná formulace jako u licencované vakcíny Gardasil-9 HPV [40]. Všechny skupiny myší měly stejné rozdělení pohlaví (muži n=4 a ženy n=4 na skupinu). Ve skupinách A a B byly myši BALB/c imunizovány intramuskulárně (im) 10 ug L1:P18I10 nebo L1:T20 VLP, v daném pořadí, podle homologního režimu prime-boost. Ve skupině C byly myši naočkovány 106 cfu BCG.HIVA2auxo.int intradermálně (id, na podložce) a posíleny 10 ug L1:P18I10 VLP intramuskulárně. Ve skupině D byly pozitivní kontrolní myši inokulovány přípravkem Gardasil- 9 prime následovaným posilovačem Gardasil-9 intramuskulárně s 10 ug HPV16 L1 VLPs. Ve skupině E byly negativní kontrolní myši imunizovány dvakrát pufrem PBS. Interval prime-boost byl 2 týdny. Myši byly usmrceny v den 28. Vzorky krve byly odebrány ze srdcí myší. Séra byla získána centrifugací a skladována při -20 °C pro test ELISA. Myší sleziny byly odstraněny a jednotlivě protlačeny přes buněčné síto (Falcon) s 5ml pryžovým pístem injekční stříkačky. Po odstranění červených krvinek pomocí ACK lyzačního pufru (Lonza) byly splenocyty promyty a resuspendovány v lymfocytovém médiu R10 (RPMI 1640 doplněné 10% fetálním telecím sérem (FCS), penicilin-streptomycin, 20 mM HEPES a 15 mM {{ 46}}ME) v koncentraci 2 x 107 buněk/ml.

2.12. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

K testování specifických protilátek HPV16 L1- a HIV{2}} vázajících se na chimérický HPV: HIV VLP konstrukty in vitro, 50 µl stejné koncentrace (200 ng/ml) rekombinantního proteinu HPV16 L1 (Abcam, ab119880 ), purifikované L1:P18I10 a L1:T20 VLP v 50mM uhličitanovém hydrogenuhličitanovém pufru (pH=9,6) (Sigma) byly 2-krát sériově zředěny a potaženy na destičky Maxisorb (Nunc). Destičky byly inkubovány při 4 °C přes noc. Destičky byly blokovány blokovacím pufrem (5% odstředěné mléko v TBST) při 37 °C po dobu alespoň 2 hodin. Po dvojnásobném promytí TBST byly destičky potažené VLP inkubovány s anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb při ředění 1:8000, 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) při ředění 1:8000 a anti- HIV-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) v ředění 1:40 v blokovacím pufru, v daném pořadí, při 37 ◦C po dobu 2 hodin. Po trojnásobném promytí TBST byly destičky inkubovány s rekombinantním proteinem G peroxidázovým konjugátem (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) v ředění 1:4000 v blokovacím pufru při 37 °C po dobu 1 hodiny. TMB byl použit k vyvinutí signálu ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) a zastaven 50 ul 2M H2SO4. Optická hustota (OD) každé jamky byla měřena a zaznamenána při vlnové délce 450 nm pomocí EL x 800 absorbance mikrodestičkové čtečky.

Pro měření VLP-indukovaných protilátek u BALB/c myší byly mikrotitrační destičky potaženy 50 ul 2 ug/ml rekombinantního proteinu HPV16 L1 (Abcam, ab119880), HIV-1 P18I10 peptid (NIBSC, ARP734), T20 peptid (NIBSC, ARP984), v tomto pořadí, s 50 mM uhličitan-bikarbonátovým pufrem (pH=9,6). Destičky byly inkubovány při 4 °C přes noc. Destičky byly blokovány blokovacím pufrem (5% odstředěné mléko v TBST) při 37 °C po dobu alespoň 2 hodin. Ve stejnou dobu byla séra odebraná ze skupiny AE imunizovaných myší zředěna 5% odstředěným mlékem v TBST v poměru 1:50. Po dvojnásobném promytí TBST byly destičky inkubovány se zředěným sérem při 37 °C po dobu 2 hodin. Po trojnásobném promytí TBST byly destičky přidány s konjugátem rekombinantního proteinu G HRP v ředění 1:4000 v blokovacím pufru a inkubovány při 37 °C po dobu 1 hodiny. TMB byl použit k vyvinutí signálu ELISA a zastaven 50 ul 2M H2SO4. OD každé jamky byla měřena při vlnové délce 450 nm pomocí EL x 800 absorbance mikrodestičkové čtečky (Biotek).

2.13. IFN-ELISpot Assay

Test s enzymem vázaným imunitním absorpčním bodem (ELISpot) byl proveden za použití komerčního myšího IFN-ELISpot kitu (Mabtech, Nacka Strand, Švédsko), podle pokynů výrobce. Destičky ELISpot (MSISP4510, 96-jamkové destičky s polyvinylidendifluoridovými membránami, Millipore, Middlesex County, MA, USA) byly ošetřeny 70% EtOH a potaženy purifikovanou monoklonální protilátkou zachycující myší interferon (IFN-) zředěnou v fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) na konečnou koncentraci 5 ug/ml při 4 °C přes noc. Poté bylo do každé jamky přidáno 2,5 x 105 čerstvých splenocytů. Následně byly buňky ze skupin A a B stimulovány 2 ug/ml HPV16 L1 VLP a HIV-1 P18I10 peptidů, v daném pořadí. Všechny vzorky a kontroly byly umístěny v duplikátních jamkách. Testy ELISpot byly inkubovány po dobu 16 hodin při 37 °C, 5 % CO2. Destičky byly následně promyty 5x PBS, inkubovány po dobu 2 hodin s biotinylovanou anti-IFN-monoklonální protilátkou (mAb) zředěnou v PBS 2% fetálním telecím sérem (FCS) na konečnou koncentraci 2 ug/ml, promyty 5x v PBS a inkubovány s konjugátem streptavidin-alkalická fosfatáza v PBS 2% FCS. Poté byly destičky 5krát promyty PBS před inkubací se 100 ul roztoku substrátu 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfátu (BCIP)/nitrotetrazoliová modř (NBT) (Sigma-Aldrich) Louis, MO, USA). Po 5–10 minutách byly destičky promyty vodou z vodovodu, vysušeny a výsledné skvrny byly spočítány pomocí čtečky ELISPOT (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Německo). Pro každé zvíře byl průměr odezvy pozadí odečten individuálně ze všech jamek, aby bylo možné srovnání IFN-spot forming cells (SFC)/106 mezi skupinami. Pro definování pozitivních odpovědí byl práh definován jako alespoň pět skvrn na jamku a reakce přesahující průměrný počet skvrn v negativních kontrolních jamkách plus tři standardní odchylky negativních kontrolních jamek.

2.14. Statistická analýza

Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru Prism 6 GraphPad (CA, USA). Použili jsme data z experimentů prováděných s 5 různými koncentracemi potahování destiček ELISA (0, 50, 100, 150, 200 ng/ml) rekombinantního proteinu HPV16 L1 (Abcam, ab119880) a HPV: HIV VLP. Shromáždili jsme data od 2 skupin (HPV16 L1 a HPV: HIV VLP) a shromáždili tři replikáty pro každou koncentraci povlaku. Graf v Prism ukázal data jako bodový graf ukazující koncentraci povlaku (ng/ml) na ose X a OD450 na ose Y. Protože jsme předpokládali, že naše data ELISA in vitro souvisí lineárně, provedli jsme lineární regresní analýzu a porovnali sklony dvou čar, abychom potvrdili, že soubor dat-1 a soubor dat-2 (protilátka reaktivita mezi HPV16 L1 a HPV: HIV VLP) se liší ve svém působení. Vybrali jsme 95% intervaly spolehlivosti spolu s nejvhodnější linií. Prism automaticky překryl lineární regresní čáru na obou našich souborech dat a vynesl tečkovanou čáru představující 95% intervaly spolehlivosti. Během lineární regresní analýzy software vypočítal pouze střední hodnotu Y našeho souboru dat, která indikovala dobrou shodu. Prism nám navíc poskytl komentář, takže můžeme usoudit, že rozdíly mezi oběma sjezdovkami jsou extrémně výrazné.

Měli jsme 5 sad (ELISA) a 4 sady (ELISPOT) dat shromážděných z pokusů imunizace myší. Tyto soubory dat měly stejný počet (muži n=4 a ženy n=4) v každé skupině. Myši imunizované Gardasil{4}} jsme použili jako pozitivní kontrolní skupinu a myši imunizované PBS jako negativní kontrolní skupinu. Data námi navržených experimentů se neshodovala ani nepárovala. Provedli jsme jednosměrnou analýzu rozptylu (ANOVA), abychom zjistili, zda se tyto průměry liší. Nejprve jsme zkontrolovali, zda naše data odpovídají Gaussovu normálnímu rozdělení. Zjistili jsme, že některé skupiny dat v testu ELISA neprošly testem Gaussova normálního rozdělení. Proto jsme provedli neparametrickou statistickou analýzu těchto dat. Naproti tomu všechny skupiny dat v testu ELISPOT prošly testem Gaussovy normální distribuce. Proto jsme provedli parametrickou statistickou analýzu těchto dat. Práh významnosti a hladina spolehlivosti byly nastaveny na 0,05 (ekvivalent 95% intervalu spolehlivosti). p hodnota vyjadřující obecně pravděpodobnost, že mezi skupinami existují rozdíly. Protože naším hlavním zájmem pro tento experiment je, jaké jsou rozdíly mezi našimi skupinami, vícenásobná srovnání v Prism nám poskytla výsledek srovnání ve všech skupinách s každou další skupinou.

2.15. Etická prohlášení

Šest až osm týdnů staré myši BALB/c byly zakoupeny od společnosti Envigo (společnost Inotiv, Chicago, IL, USA) a schváleny místními úřady (Generalitat de Catalunya, číslo projektu 11157) a Etickým výborem Universitat Autònoma de Barcelona. Pokusy na zvířatech byly přísně v souladu s právními předpisy o dobrých životních podmínkách zvířat Generalitat de Catalunya. Všechny experimenty byly schváleny místní etickou komisí pro výzkum (Postup 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).

3. Výsledky

3.1. Návrh imunogenů L1:P18I10 a L1:T20 a hodnocení HPV: exprese proteinu HIV pomocí expresního systému 293F

Peptid P18I10 ze smyčky třetí variabilní domény (V3) HIV-1 Env a peptid T20 z proximální vnější oblasti membrány HIV-1 (MPER) byly vloženy do HPV16 L1 DE smyčkového proteinu za účelem vytvoření chimérické L1 imunogeny:P18I10 a L1:T20. Chimérické sekvence kódující DNA L1:P18I10 a L1:T20 byly klonovány do expresního vektoru plazmidové DNA pcDNA3.1 (+) pro přechodnou transfekci v buňkách 293F (obrázek 1A). Monomerní struktury HPV16 LI, chimérických L1:P18I10 a L1:T20 kapsidových proteinů byly předběžně predikovány pomocí SWISS-model serveru (obrázek 1B). Hlavní kapsidový protein L1 HPV16 (7cn2.1.R) byl vybrán jako strukturní templát pro vytvoření modelování homologie kapsidového proteinu HPV16 LI, L1:P18I10 a L1:T20. Ve srovnání s konformací navázaného peptidu P18I10 v předchozí studii [41], směr hlavního řetězce N až C konce peptidu P18I10 na našem chimérickém proteinu L1:P18I10 probíhá zprava doleva (obrázek 1B, střední a horní panel), a exponující postranní řetězce P18I10 by mohly potenciálně interagovat s receptory T buněk (obrázek 1B, střední a spodní panel). Ve srovnání se strukturou peptidu inhibitoru fúze HIV{56}} v předchozím přehledovém článku [42] je vložený peptid T20 na kapsidovém proteinu HPV16 L1 prezentován jako útvar podobný šroubovici (obrázek 1B, pravý a horní panel ) a exponující postranní řetězce T20 by mohly být potenciálně rozpoznány receptory B buněk (obrázek 1B, pravý a spodní panel). Vzhledem k tomu, že kapsidové proteiny HPV16 L1 by se mohly homogenně sestavit do ikosaedrické částice T=7 se 72 pentamerními kapsomery [43], je zobrazení peptidů P18I10 nebo T20 s vysokou hustotou na vnějším povrchu chimérických HPV: HIV VLP potenciálně vysoce imunostimulační k indukci epitopově specifické imunitní odpovědi.

Figure 1. L1:P18I10 and L1:T20 immunogen design and construction of chimeric HPV: HIV VLPs by using 293F expression system. (A) The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 DNA coding sequences were cloned into pcDNA3.1+ expression vectors, respectively, for transient transfection in 293F cells. (B) Prediction of monomer structures of HPV16 L1 and chimeric HPV: HIV capsid proteins by using the SWISS-model server. HPV16 major capsid protein L1 (7cn2.1.R) was selected as the structural template to build the HPV16 L1 (left panel), L1:P18I10 (middle panel), and L1:T20 (right panel) capsid protein homology modeling. Secondary structural elements of HPV16 L1 capsid protein are labeled, with letters h1–h5 for the 5 α-helices. Loops of HPV16 L1 capsid protein between strands are labeled BC, CD, DE, EF, FG, and HI. Secondary structural elements of HIV-1 P18I10 and T20 peptides L1 are labeled by the arrows (top panel). The part of the P18I10 and T20 peptide that protrudes above the surface of the HPV16 L1 capsid protein is indicated by the arrows (bottom panel). (C) Immunofluorescence staining of L1 protein in 293F cells. The following pDNA.L1:P18I10 (left), pDNA.L1:T20 (middle), and pDNA.without insertion (right) were transfected in 293F cells. The transfected cells were probed with anti-HPV16 L1 mAb and detected with anti-mouse IgG-FITC (green channel). Cell nuclei were stained with DAPI (blue channel). Immunofluorescence images were merged by using Adobe Photoshop


Obrázek 1. Návrh imunogenu L1:P18I10 a L1:T20 a konstrukce chimérických HPV:HIV VLP s použitím expresního systému 293F. (A) Chimérické sekvence kódující DNA L1:P18I10 a L1:T20 byly klonovány do expresních vektorů pcDNA3.{13}} pro přechodnou transfekci v buňkách 293F. (B) Predikce monomerních struktur HPV16 L1 a chimérických HPV: kapsidových proteinů HIV pomocí serveru SWISS-model. Hlavní kapsidový protein L1 HPV16 (7cn2.1.R) byl vybrán jako strukturní templát pro vytvoření modelování homologie kapsidového proteinu HPV16 L1 (levý panel), L1:P18I10 (střední panel) a L1:T20 (pravý panel). Sekundární strukturní prvky kapsidového proteinu HPV16 L1 jsou označeny písmeny h1–h5 pro 5 -šroubovice. Smyčky kapsidového proteinu HPV16 L1 mezi řetězci jsou označeny BC, CD, DE, EF, FG a HI. Sekundární strukturní prvky HIV-1 P18I10 a T20 peptidů L1 jsou označeny šipkami (horní panel). Část peptidu P18I10 a T20, která vyčnívá nad povrch kapsidového proteinu HPV16 L1, je označena šipkami (spodní panel). (C) Imunofluorescenční barvení proteinu L1 v buňkách 293F. Následující pDNA.L1:P18I10 (vlevo), pDNA.L1:T20 (uprostřed) a pDNA.bez inzerce (vpravo) byly transfekovány do buněk 293F. Transfekované buňky byly sondovány anti-HPV16 LI mAb a detekovány anti-myším IgG-FITC (zelený kanál). Buněčná jádra byla obarvena pomocí DAPI (modrý kanál). Imunofluorescenční snímky byly sloučeny pomocí Adobe Photoshopu

Vzhledem k tomu, že C terminální sekvence proteinu HPV16 L1 zprostředkovává buněčný jaderný importní mechanismus během infekce [44], byly v předchozích studiích identifikovány signály jaderné lokalizace (NLS) proteinu HPV16 L1 [45]. Monoklonální protilátka CAMVIR-1 byla vybrána k rozpoznání epitopu HPV16 L1 (GFGAMDF, 230–236 aa) [39] a barvivo na bázi fluoresceinu FITC bylo použito jako reportér pro sledování exprese L1:P18I10 a L1: proteiny T20. Imunofluo rprezentační snímky jasně ukázaly, že HPV16 L1 (zeleně) byl lokalizován hlavně v jádrech (modře) buněk 293F. V buňkách 293F transekovaných kontrolním plazmidem (plazmid pcDNA3.1 bez inzertu) nebyl pozorován žádný signál L1 (obrázek 1C). Výsledky naznačují, že oba chimérické kapsidové proteiny L1:P18I10 a L1:T20 by mohly být exprimovány pomocí transfekce zprostředkované polyethyleniminem (PEI) a rozpoznány monoklonální protilátkou HPV16 L1 CAMVIR-1.

3.2. Purifikace L1:P18I10 a L1:T20 VLP pomocí chromatografických metod

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa a heterologní spodní pás<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

Figure 2. Purification and characterization of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Schematic process flowchart of L1:P18I10 and L1:T20 VLP purification by chromatography. (B, C) Western blot analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLP samples from each purification step. The signal of L1 in each purification step was characterized by Western blot analysis probed with anti-HPV16 L1 mAb. The arrow indicates the molecular weight of ~56 kDa of L1:P18I10 and ~58 kDa of L1:T20 proteins. Lane 1: clarified cell lysate (CCL); Lane 2: flow-through (FT) from cation exchange chromatography (CEC) sample loading; Lane 3: CEC eluate; Lane 4: FT from CEC 2M NaCl regeneration step; Lane 5: size exclusion chromatography (SEC) FT-1; Lane 6: SEC FT-2; Lane 7: FT from heparin affinity chromatography (H-AC) sample loading; Lane 8: H-AC eluate; Lane 9: FT from H-AC 2M NaCl regeneration step; Lane 10: 10-fold diafiltration.


Obrázek 2. Purifikace a charakterizace L1:P18I10 a L1:T20 VLP. (A) Schématický postupový diagram čištění L1:P18I10 a L1:T20 VLP chromatografií. (B, C) Western blot analýza vzorků L1:P18I10 a L1:T20 VLP z každého kroku čištění. Signál LI v každém kroku čištění byl charakterizován analýzou Western blot sondovanou s anti-HPV16 LI mAb. Šipka ukazuje molekulovou hmotnost -56 kDa proteinů L1:P18I10 a -58 kDa proteinů L1:T20. Dráha 1: vyčeřený buněčný lyzát (CCL); Dráha 2: průtok (FT) z nanášení vzorku chromatografií na katexu (CEC); Dráha 3: CEC eluát; Dráha 4: FT z regeneračního kroku CEC 2M NaCl; Dráha 5: vylučovací chromatografie (SEC) FT-1; Dráha 6: SEC FT-2; Dráha 7: FT z heparinové afinitní chromatografie (H-AC) nanesení vzorku; Dráha 8: H-AC eluát; Dráha 9: FT z regeneračního kroku H-AC 2M NaCl; Dráha 10: 10-násobná diafiltrace.

3.3. Stabilita in vitro a samosestavení L1:P18I10 a L1:T20 VLP

Abychom potvrdili, že purifikované HPV:HIV VLP vykazovaly podobnou stabilitu in vitro jako HPV16 L1 VLP, provedli jsme neredukující SDS-PAGE, abychom vyhodnotili disulfidové zesítění kapsidových proteinů HPV:HIV (obrázek 3A). Je známo, že pH, iontová síla, teplota [52] a redoxní prostředí korelují s disulfidovými vazbami kapsidových proteinů HPV16 L1 [53]. HPV L1 VLP mají tendenci se samosestavovat při nízkém pH a vysoké iontové síle. Maximální demontáž VLP obvykle vyžaduje vystavení vysoké koncentraci redukčního činidla, jako je 5% 2-merkaptoetanol (2-ME) po relativně dlouhou dobu [54]. V nepřítomnosti redukčních činidel 2-ME migrovala pouze malá část proteinu HPV-16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 na monomery se zdánlivou molekulovou hmotností (MW) 55 kDa . Přibližně 70 % L1 proteinů bylo disulfidicky navázáno na větší dimery nebo pentamery s předpokládanou MW 110 kDa a 280 kDa (obrázek 3A, dráhy 2, 4 a 6). Naproti tomu téměř všechny proteiny HPV-16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 v rozkládacím pufru se v neredukující SDS-PAGE objevily jako monomerní struktury (obrázek 3A, dráha 3, 5 a 7). Tyto výsledky ukázaly, že in vitro stabilita purifikovaných L1:P18I10 a L1:T20 VLP vykazovala podobné vzory disulfidového zesítění jako HPV16 L1 VLP za stejných pH, ​​iontové síly a tepelných podmínek. Zdá se, že purifikované VLP jsou rozloženy na úroveň pentamerů, trimerů a dimerů po dlouhodobé expozici vysokým koncentracím redukčních činidel. Tyto údaje jsou ve shodě s předchozími studiemi [53,54] Demontáž VLP HPV: HIV však ještě zdaleka nebyla dokončena (monomery).

Figure 3. In vitro stability of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Disulfide cross-linking of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in non-reducing SDS-PAGE. The HPV16 L1 VLPs, purified L1:P18I10, and L1:T20 VLPs were mixed with Laemmli sample buffer in the absence or presence of 2-mercaptoethanol (2-ME), respectively, and analyzed by non-reducing SDS-PAGE. The position of the L1 monomer (55 kDa), L1 dimer (110 kDa), and L1 pentamer (280 kDa) are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 VLP; Lane 3: HPV16 L1 VLP treated with 2-ME; Lane 4: L1:P18I10 VLP; Lane 5: L1:P18I10 VLP treated with 2-ME; Lane 6: L1:T20 VLP; Lane 7: L1:T20 VLP treated with 2-ME. (B) Molecular mass analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. Assembled VLPs untreated with 2-ME (lanes 2, 4, and 6) were filtered out through 1000kDa molecular weight cutoff (MWCO) diafiltration devices (upper panel). Disassembled VLPs treated with 2-ME (lanes 3, 5, and 7) were filtered out through 100kDa MWCO centrifugal filter devices (lower panel). Retentates (R) were collected from filter device sample reservoirs, while the filtrates (F) were collected at the bottom of centrifuge tubes. The L1 protein signal was detected by using a dot blot probed with anti-HPV16 L1 mAb.


Obrázek 3. In vitro stabilita L1:P18I10 a L1:T20 VLP. (A) Disulfidové zesítění L1:P18I10 a L1:T20 VLP v neredukující SDS-PAGE. HPV16 L1 VLP, purifikované L1:P18I10 a L1:T20 VLP byly smíchány se vzorkovým pufrem Laemmli v nepřítomnosti nebo přítomnosti 2-merkaptoethanolu (2-ME), v daném pořadí, a analyzovány neredukujícími SDS-PAGE. Poloha monomeru L1 (55 kDa), dimeru L1 (110 kDa) a pentameru L1 (280 kDa) je označena šipkou. Dráha 1: marker molekulové hmotnosti proteinu; Dráha 2: HPV16 LI VLP; Dráha 3: HPV16 L1 VLP ošetřená 2-ME; Dráha 4: L1:P18I10 VLP; Dráha 5: L1:P18I10 VLP ošetřená 2-ME; Dráha 6: L1:T20 VLP; Dráha 7: L1:T20 VLP ošetřená 2-ME. (B) Analýza molekulové hmotnosti L1:P18I10 a L1:T20 VLP. Sestavené VLP neošetřené 2-ME (dráhy 2, 4 a 6) byly odfiltrovány přes diafiltrační zařízení s mezní hodnotou molekulové hmotnosti (MWCO) 1000 kDa (horní panel). Rozložené VLP ošetřené 2-ME (dráhy 3, 5 a 7) byly odfiltrovány přes 100kDa MWCO odstředivá filtrační zařízení (spodní panel). Retentáty (R) byly shromažďovány ze zásobníků vzorků filtračního zařízení, zatímco filtráty (F) byly shromažďovány na dně centrifugačních zkumavek. Signál proteinu LI byl detekován pomocí dot blotu sondované s anti-HPV16 LI mAb.

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) a byly uchovány v retentátech. Vzor byl v souladu s daty, která byla pozorována v neredukující SDS-PAGE. Ačkoli všechny skupiny VLP ošetřené 2-ME byly ukázány v monomerním pásu (~55 kDa) v neredukující SDS-PAGE (obrázek 3A, dráha 3, 5 a 7). Odpovídající redukované VLP však nebyly odfiltrovány přes 100kDa ultrafiltrační membrány (obrázek 3B, spodní panel). Tyto výsledky naznačují, že chimérické proteiny HPV:HIV byly schopny samosestavení na větší částice, ale maximální rozklad VLP na monomery vyžadoval nejen redukci disulfidových vazeb, ale také další denaturační faktory, jako je pH nebo iontová síla.

3.4. Morfologická charakterizace L1:P18I10 a L1:T20 VLP

Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) byla použita ke zkoumání morfologické konformace HPV16 LI a HPV: HIV VLP. HIV-1 P18I10 a T20 peptidy byly vloženy do DE smyček proteinu HPV16 L1. Tyto komerční HPV16 L1 a chimérické HPV: HIV kapsidové proteiny se mohou in vitro spontánně samosestavit do integrálních VLP o průměru přibližně 50–60 nm (obrázek 4A–C, pravý panel). Ve srovnání s elektronovými mikrofotografiemi HPV16 L1 VLP publikovanými v předchozích studiích [55,56] byla ikosaedrická struktura HPV16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 VLP zde méně kontrastní a vágní. Dalo by se to přičíst negativnímu barvícímu činidlu, které jsme použili v této studii. V naší nedávné studii publikované v předchozí studii [37] a v dalším probíhajícím článku, který je předmětem vzájemného hodnocení (data nejsou uvedena), jsme získali dobrou kvalitu a rozlišení elektronových mikrosnímků, když VLPs L1:P18I10 pocházející z kvasinek a bakuloviru (stejné chimérické konstrukt) byly ekvilibrovány v PBS a negativně obarveny kyselinou fosfowolframovou (PTA). Protože jsme v této studii použili různé systémy produkce a purifikace VLP, L1:P18I10 a L1:T20 VLP pocházející ze savčích buněk byly ekvilibrovány Tris-HCl a negativně obarveny uranylacetátem. Přestože elektronové mikrofotografie by mohly být vylepšeny, stále jsme mohli pozorovat jasný vzorec, že ​​většina kapsidového proteinu HPV16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 se může sama sestavit do morfologických VLP pod TEM screen (obrázek 4A–C, levý panel ). HPV VLP jsou v zásadě chráněny proti agregaci v podmínkách s vysokým obsahem soli [57]. Některé detekovatelné agregace HPV16 L1 a HPV: HIV VLP v pufru Tris-HCl s nízkým obsahem soli bylo možné vidět pod menším zvětšením (obrázek 4A–C, levý panel). Z těchto výsledků jsme usoudili, že modifikace částečné sekvence L1 DE smyčky inzercí HIV-1 P18I10 nebo T20 peptidů významně neovlivnila morfologii HPV: HIV VLPs.

Figure 4. Electron micrographs of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Morphology of HPV16 VLPs. (B) Morphology of L1:P18I10 VLPs. (C) Morphology of L1:T20 VLPs. Purified VLPs were absorbed on UV-charged carbon-coated copper grids, and negatively stained with 2% uranyl acetate. Images were acquired under transmission electron microscopy. The bar represents 200 nm at magnification 59,000 (left panel) and 100 nm at magnification 135K (right panels), respectively


Obrázek 4. Elektronové mikrofotografie L1:P18I10 a L1:T20 VLP. (A) Morfologie HPV16 VLP. (B) Morfologie L1:P18I10 VLP. (C) Morfologie L1:T20 VLP. Purifikované VLP byly absorbovány na UV nabité uhlíkem potažené měděné mřížky a negativně obarveny 2% uranylacetátem. Snímky byly pořízeny transmisní elektronovou mikroskopií. Pruh představuje 200 nm při zvětšení 59, 000 (levý panel) a 100 nm při zvětšení 135K (pravé panely), v tomto pořadí

3.5. Prezentace a reaktivita epitopů HPV-16 a HIV-1 

Aby se potvrdilo, že sekvenční epitopy HIV{0}} P18I10 nebo 2F5 byly prezentovány v chromatograficky purifikovaných L1:P18I10 nebo L1:T20 VLP, byla provedena analýza Western blot a nepřímá ELISA s použitím epitopově specifických mAb. Vybrali jsme dobře známou monoklonální protilátku (mAb), označenou jako CAMVIR-1, k rozpoznání vysoce konzervovaného epitopu (GFGAMDF, aa 230–236) proteinu HPV16 L1 [39,58]. K detekci sekvenčních epitopů P18I10 (RGPGRAFVTI, aa311–320) byla vybrána dříve publikovaná mAb zacílená na epitop smyčky HIV{20}} gp120 V3 (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322) [59]. Na druhou stranu byla pro charakterizaci peptidu T20 vybrána široká neutralizační protilátka (bnAb) rozpoznávající epitop HIV-1 gp41 2F5 (ELDKWA) proti široké škále laboratorních kmenů HIV-1 [ 60,61]. Western blot test testovaný s HPV16 LI mAb ukázal pásy 55, 56 a 58 kDa odpovídající proteinu HPV16 LI, L1:P18I10 a L1:T20, v daném pořadí (obrázek 5A, B, vlevo). Molekulová hmotnost (MW) proteinu L1:P18I10 byla podobná proteinu HPV16 L1 (obrázek 5A, vlevo). Pás odpovídající proteinu L1:T20 byl pozorován mírně vyšší než protein L1 HPV16, jak bylo předpovězeno z další aminokyselinové sekvence (obrázek 5B, vlevo). Pásy o přibližně 56 a 58 kDa, odpovídající proteinu L1:P18I10 a L1:T20, byly detekovány v testu Western blot sondovaném s anti-HIV-1gp120 V3 a 2F5 mAb, v tomto pořadí (obrázek 5A, B, vpravo ). Mysleli jsme si, že molekulová hmotnost (MW) anti-2F5- obarveného proteinu L1:T20 byla správná a odpovídala očekávaným 58 kDa (obrázek 5B, vpravo). MW proteinu L1:P18I10 obarveného anti-HIV-1 gp120 V3- je však o něco nižší (obrázek 5A vpravo). To lze přičíst heterogenní struktuře chimérických proteinů L1:P18I10. Protože konformace sekvenčního epitopu může být ztracena za denaturačních podmínek v SDS-PAGE. Proto jsme dále provedli nepřímou ELISA, abychom demonstrovali konformační peptid P18I10 správně prezentovaný na našich chimérických L1:P18I10 VLP (obrázek 5E). Na druhou stranu protilátka proti HIV{100} gp120 V3 smyčky, kterou jsme použili, rozpoznávala celou smyčku HIV{103} V3 spíše než epitop P18I10. V důsledku toho byl celkový signál anti-V3 nižší (obrázek 5A, B, pravé panely). I tak tyto výsledky ukázaly, že sekvenční HIV{110}} P18I10 a T20 peptidy jsou přítomny ve VLP HPV: HIV.

Figure 5. Presentation of HPV-16 and HIV-1 epitopes. (A, B) Sequential epitope detection of chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were analyzed by Western blot, using anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 and 2F5 mAb. The HPV16 L1 VLPs were used as a control. The molecular weight of the L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa), and L1:T20 (58 kDa) proteins are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 protein; Lane 3: L1:P18I10 protein; Lane 4: L1:T20 protein. (C, D) Binding of HPV16 L1 mAb to chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (E) Binding of anti-HIV-1 gp120 V3 mAb to chimeric L1:P18I10 VLPs. (F) Binding of HIV-1 2F5 mAb to chimeric L1:T20 VLPs. The line graph of indirect ELISAs was performed to detect the conformational epitopes of recombinant HPV16 L1, L1:P18I10, and L1:T20 VLPs bound to anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 or 2F5 mAbs, respectively. Data are representative of three independent experiments. A simple linear regression test was done to compare the line difference of purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs with the standard curve of commercial L1 VLPs; ns: not significant; ** p < 0.01.


Obrázek 5. Prezentace epitopů HPV-16 a HIV-1. (A, B) Sekvenční epitopová detekce chimérických L1:P18I10 a L1:T20 VLP. Purifikované L1:P18I10 a L1:T20 VLP byly analyzovány Western blotem s použitím anti-HPV16 LI, anti-HIV-1 gp120 V3 a 2F5 mAb. HPV16 L1 VLP byly použity jako kontrola. Molekulová hmotnost L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) a L1:T20 (58 kDa) proteinů je označena šipkou. Dráha 1: marker molekulové hmotnosti proteinu; Dráha 2: HPV16 L1 protein; Dráha 3: L1:P18I10 protein; Dráha 4: L1:T20 protein. (C, D) Vazba HPV16 L1 mAb na chimérické L1:P18I10 a L1:T20 VLP. (E) Vazba anti-HIV-1 gp120 V3 mAb na chimérické L1:P18I10 VLP. (F) Vazba HIV-1 2F5 mAb na chimérické L1:T20 VLP. Spojnicový graf nepřímých testů ELISA byl proveden pro detekci konformačních epitopů rekombinantních HPV16 LI, L1:P18I10 a L1:T20 VLP navázaných na anti-L1, anti-HIV-1gp120 V3 nebo 2F5 mAb, v daném pořadí. Data jsou reprezentativní ze tří nezávislých experimentů. Byl proveden jednoduchý lineární regresní test pro porovnání rozdílu linií purifikovaných L1:P18I10 a L1:T20 VLP se standardní křivkou komerčních L1 VLP; ns: nevýznamné; ** p < 0,01.

Kromě toho, abychom zjistili, zda lze konformační epitopy HIV {{{{5{59}}}}}} prezentované na HPV: HIV VLP identifikovat pomocí gp120 V3 a 2F5 neutralizačních protilátek in vitro, provedli jsme nepřímý test ELISA pro kontrolu specificitu a reaktivitu vazby na epitop. Jak je znázorněno na obrázku 5C, D, HPV16 LI, L1:P18I10 a L1:T20 VLP byly rozpoznány anti-L1 mAb. Provedli jsme lineární regresní analýzu, abychom porovnali sklon každé linie ředění. Výsledky odhalily, že specifita vázání epitopu L1 buď L1:P18I10 nebo L1:T20 VLP se nelišila od HPV16 L1 VLP. Navíc anti-HIV-1 gp120 V3 mAb byla schopna vázat L1:P18I10 VLP, ale ne HPV16 L1 VLP (obrázek 5E). Navíc 2F5 mAb mohla rozpoznat L1:T20 VLP, ale ne HPV16 L1 VLP (obrázek 5F). Po lineární regresní analýze byl rozdíl ve vazebné specificitě gp120 V3 epitopu mezi L1:P18I10 a HPV16 LI extrémně významný (p < 0,01 %). Vazebná specificita 2F5 epitopu L1:T20 VLP byla významně odlišná od HPV16 L1 VLP (p < 0,01 %). Tento vzorec odhalil, že hydrofobní buněčné lipidy nebyly nutné pro vazbu 2F5-neutralizačních protilátek na HPV: HIV VLPs in vitro. Ačkoli je reaktivita anti-HIV-1 gp120 V3 a 2F5 neutralizačních protilátek na HPV: HIV VLP relativně mírná, vazba anti-HIV-1 gp120 V3 a 2F5 mAb na HPV: HIV VLP byla významně epitopově specifické.

3.6. Imunogenicita L1:P18I10 a L1:T20 VLP po imunizaci myší BALB/c

Hodnotili jsme HPV{0}} a HIV{1}}specifické imunitní reakce po imunizaci myší BALB/c pomocí L1:P18I10 a L1:T20 VLP. Schéma imunizace je ukázáno na obrázku 6A. Protože imunogenicita indukovaná VLP po podání na sliznici byla obecně slabší než po systémovém podání, byly myši imunizovány intramuskulárně jednou šestinou dávky Gardasil{10}} HPV16 L1 [22,62]. Adjuvans hydroxyfosfát sulfát hlinitý pro dávku (10 ug/100 ul) chimérických HPV: HIV VLPs bylo upraveno na stejnou koncentraci (1 mg/1 ml) jako Gardasil-9. Za účelem posouzení rozdílu mezi pohlavími ve výsledcích vakcinace bylo hodnoceno srovnání protilátkových odpovědí mezi samci (n=4) a samicemi (n=4) myší. Ve skupině L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP a Gardasil-9 byly odpovědi protilátek proti HPV16 L1 u samic myší v průměru vyšší než u samců myší (obrázek 6B). 2 ze 4 (50 %) samic imunizovaných L1:P18I10 VLP, 3 ze 4 (75 %) samic L1:T20 imunizovaných VLP a všechny (100 %) samice myší imunizované Gardasilem vyvolaly vyšší titr protilátek anti-L1 než samci myší. Anti-L1 reakce vyvolané samičkami myší ve skupině Gardasil{51}} byly významně vyšší než u myších samců (p=0,0041) (obrázek 6B). Velmi nízká hladina anti-L1 protilátkových odpovědí byla detekována ve skupině BCG.HIVA priming a L1:P18I10 VLP boosting. Tento vzorec koresponduje s předchozími zjištěními popisujícími, že BCG převážně indukuje odpovědi T-buněk spíše než produkci IgG [63].

Figure 6. Induction of humoral immune responses by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A) All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Groups A and B: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 or L1:T20 VLPs intramuscularly (i.m.); Group C: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group D: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group E: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Sera were collected and diluted at a titer of 1:50 for ELISA assay. (B) HPV L1-specific IgG in male and female mice. (C–E) Epitope-specific IgG induced by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. ELISA was performed to analyze anti-L1, anti-P18I10, and anti-T20 IgG induced by BALB/c mice following different prime-boost combinations as described above. Data are shown as mean ± S.D. One-way ANOVA (nonparametric) test was done to compare differences between groups. OD: opticaldensity. Ns not significant; ** p < 0.01


Obrázek 6. Indukce humorálních imunitních odpovědí prostřednictvím L1:P18I10 a L1:T20 VLP u BALB/c myší. Schéma imunizace je znázorněno v (A) Všechny skupiny myší měly stejné rozdělení pohlaví (samci n=4 a samice n=4). Skupiny A a B: homologní prime-boost imunizace s 10 ug L1:P18I10 nebo L1:T20 VLP intramuskulárně (im); Skupina C: primární aktivace 106 cfu rBCG.HIVA intradermálně (id) a booster 10 ug L1:P18I10 VLPs im; Skupina D: homologní prime-boost vakcinace Gardasil-9 obsahující 10 ug HPV16 L1 VLPs im; Skupina E: imunizace dvakrát PBS pufrem. Interval prime-boost byl 2 týdny. Koncový bod této studie byl 28. den. Séra byla odebrána a naředěna na titr 1:50 pro test ELISA. (B) HPV L1-specifický IgG u samců a samic myší. (C–E) Epitop-specifický IgG indukovaný L1:P18I10 a L1:T20 VLP. ELISA byla provedena pro analýzu anti-L1, anti-P18I10 a anti-T20 IgG indukovaných BALB/c myšmi po různých kombinacích prime-boost, jak je popsáno výše. Data jsou uvedena jako průměr ± SD Pro porovnání rozdílů mezi skupinami byl proveden jednocestný test ANOVA (neparametrický). OD: optická hustota. Ns nevýznamné; ** p < 0,01

Hodnotili jsme, zda myši imunizované VLP L1: P18110 a L1: T20 mohou indukovat HPV-16 L1-specifické a HIV-1 epitop-specifické protilátky u BALB/c myší. VLP-indukované IgG protilátky v myších sérech byly měřeny testem ELISA potaženým rekombinantním HPV16 L1 proteinem, P18I10, respektive T20 peptidy. Statistický rozdíl v L1-specifickém IgG při sérovém titru 1:50 byl detekován ve skupině Gardasil{17}} ve srovnání s kontrolní skupinou PBS (p=0,0039). Anti-L1 reakce u myší imunizovaných VLP Gardasil-9, L1:P18I10 a L1:T20 byly podobné a významně se nelišily (obrázek 6C). BCG.HIVA2auxo.int primární a L1:P18I10 VLP boost myši vyvolaly velmi nízkou hladinu anti-L1 IgG. Tyto výsledky naznačují, že myši imunizované HPV: HIV VLP produkovaly stejnou hladinu IgG anti-L1 jako myši imunizované Gardasil-9- (obrázek 6C). Ačkoli se zdá, že skupina L1:P18I10 VLP numericky má tendenci k vyšší hladině IgG specifického pro epitop P18I10 než jiné imunizované skupiny, tyto rozdíly nebyly statisticky významné (obrázek 6D). U některých myší imunizovaných L1:P18I10 VLP (4 z 8, 50 %) byly pozorovány vyšší anti-P18I10 vazebné protilátky ve srovnání s myšmi imunizovanými Gardasil{58}}. Alternativně analýza T-testu odhalila, že rozdíl mezi skupinou L1:P18I10 VLP a Gardasil-9 byl významný (p=0,005) (data nejsou uvedena). Ve skupině L1:T20 VLP byla detekována významně vyšší protilátková odpověď proti peptidu T20 ve srovnání se skupinou Gardasil-9 (p=0,0083). Jak se očekávalo, titry anti-T20 byly nedetekovatelné ve skupinách Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP a BCG.HIVA v kombinaci s L1:P18I10 VLP boostovacími skupinami (obrázek 6E). Titr protilátky specifické pro peptid T20 byl relativně nízký. To je pravděpodobně způsobeno: (1) T20 je subdominantní peptid; (2) vyvolání MPER nebo 2F5 neutralizačních protilátek vyžaduje konjugáty peptid-lipid (obrázek 6E). Celkově naše výsledky ukázaly, že L1:P18I10 a L1:T20 VLPs mohly u myší indukovat HPV16-, ale slabé HIV-1-specifické protilátkové odpovědi.

Desert ginseng-Improve immunity (2)

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Pro vyhodnocení HPV a HIV-specifických T-buněčných imunitních odpovědí u myší jsme dodržovali imunizační plán ukázaný na obrázku 7A. Kromě toho bylo heterologní BCG.HIVA2auxo.int priming a L1:P18I10 VLPs boosting porovnáno s homologní L1:P18I10 VLP priming and boost imunizací, aby se vyhodnotila frekvence specifických-HPV16 a HIV{12}} T-buněčných imunitních odpovědí. Mezi skupinami Gardasil-9 a PBS nebyly žádné rozdíly, pokud jde o sekreci IFN- po stimulaci splenocytů pomocí HPV16 L1 VLP. Rozdíly v L1- specifické sekreci IFN- nebyly také významné mezi L1:P18I10 VLP a Gardasil-9 skupinami. Usoudili jsme, že slabá L1-specifická sekrece IFN- může být přisuzována nízké koncentraci (2 µg/ml) HPV16 L1 VLP používaných jako stimuly. Skupina BCG.HIVA2auxo.int prime a L1:P18I10 VLP boost indukovala vyšší frekvenci splenocytů sekretujících IFN a byly pozorovány významné rozdíly v sekreci IFN- ve srovnání se skupinou myší očkovaných Gardasil-9 (p {{36} }}.0103). 3 z 8 myší (~38 %) vyvolaly nejvyšší L1- specifické IFN- odpovědi (obrázek 7B). To lze přičíst nespecifické adjuvancii BCG podle našich předchozích studií [64–66]. Zjevný primární účinek, dokonce i u BCG divokého typu, je v souladu se schopností derivátů rBCG působit jako účinná adjuvans pro následné posilovací vakcíny [64,65]. Pokud jde o HIV-1-specifické odpovědi T-buněk, nejvyšší celková velikost IFN-spot-forming cells (SFC)/106 splenocytů byla pozorována u myší s primovaným BCG.HIVA2auxo.int ve srovnání s myšmi, které dostávaly Gardasil{{54} } vakcíny nebo L1:P18I10 VLP. Myši primované BCG.HIVA a posílené L1:P18I10 VLP vyvolaly významně vyšší sekreci IFN- ve srovnání s myšmi vakcinovanými L1:P18I10 VLP homologní prime-boost (p=0.0268). Kromě toho byla pozorována významně vyšší sekrece IFN- u myší očkovaných L1:P18I10 VLP ve srovnání s myšmi, které dostávaly vakcíny Gardasil-9 (p=0.0157) (obrázek 7C). Jak se očekávalo, sekrece IFN- byla nedetekovatelná ve skupinách Gardasil{77}} a PBS. Tyto výsledky ukázaly, že (1) L1:P18I10 VLP vyvolaly HIV-1-specifické imunitní reakce T-buněk; (2) L1:P18I10 VLP vyvolaly HPV-specifické T-buněčné imunitní reakce a (3) BCG.HIVA2auxo.int mohl posílit HIV-1-specifické T-buněčné imunitní reakce vyvolané L1:P18I10 VLP.

Figure 7. Induction of HPV16 and HIV-1 specific T cell responses by chimeric L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A). All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Group A: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 VLPs intramuscularly (i.m.); Group B: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group C: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group D: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Splenocytes were isolated for IFN-γ ELISpot assay. T-cell immune responses to HPV16 and HIV-1 were assessed ex vivo by IFN-γ ELISpot after splenocyte stimulation with HPV16 L1 VLP and P18I10 peptide. (B, C) HPV16 L1- and HIV-1 P8I10-specific T-cell responses elicited by L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA prime combined with L1:P18I10 VLP boost. Data are shown as median ± S.D. A one-way ANOVA test was done to compare differences between groups. Ns not significant; * p < 0.05.


Obrázek 7. Indukce HPV16 a HIV-1 specifických T buněčných odpovědí chimérickými L1:P8I10 VLP a BCG.HIVA u BALB/c myší. Schéma imunizace je znázorněno v (A). Všechny skupiny myší měly stejné rozdělení pohlaví (muži n=4 a samice n=4). Skupina A: homologní prime-boost imunizace s 10 ug L1:P18I10 VLP intramuskulárně (im); Skupina B: primární aktivace 106 cfu rBCG.HIVA intradermálně (id) a booster 10 ug L1:P18I10 VLPs im; Skupina C: homologní prime-boost vakcinace Gardasil-9 obsahující 10 ug HPV16 L1 VLPs im; Skupina D: imunizace dvakrát PBS pufrem. Interval prime-boost byl 2 týdny. Koncový bod této studie byl 28. den. Splenocyty byly izolovány pro IFN-ELISpot test. Imunitní reakce T-buněk na HPV16 a HIV-1 byly hodnoceny ex vivo pomocí IFN-ELISpot po stimulaci splenocytů pomocí HPV16 L1 VLP a peptidu P18I10. (B, C) HPV16 L1- a HIV-1 P8I10-specifické T-buněčné odpovědi vyvolané L1:P8I10 VLPs a BCG.HIVA prime v kombinaci s L1:P18I10 VLP boost. Data jsou uvedena jako medián ± SD Pro porovnání rozdílů mezi skupinami byl proveden jednocestný test ANOVA. Ns nevýznamné; * p < 0,05.

4. Discussion

Jak HPV16, tak HIV-1 jsou pohlavně přenosné choroby a v současnosti jsou předmětem mnoha studií vakcín. Přestože byly profylaktické vakcíny proti HPV komerčně dostupné a přenos HIV-1 byl do značné míry kontrolován antiretrovirovou léčbou (ART) a PrEP, je naléhavě potřeba účinná, bezpečná a cenově dostupná chimérická vakcína proti oběma virům HPV: HIV. V této studii (1) jsme ukázali, že expresní systém 293F a metoda chromatografické purifikace by mohly být proveditelnými přístupy k produkci a purifikaci chimérických L1:P18I10 a L1:T20 VLP; (2) potvrdili jsme, že inzerce peptidů P18I10 nebo T20 do DE smyčky kapsidových proteinů HPV16 L1 neovlivnila in vitro stabilitu, samouspořádání a morfologii chimérických HPV: HIV VLP; (3) Sekvenční a konformační peptidy P18I10 nebo T20 vystavené DE smyčkám chimérického HPV: HIV VLPs mohly být detekovány anti-HIV-1 gp120 V3 a 2F5 neutralizačními protilátkami in vitro; (4) Chimérické L1:P18I10 a L1:T20 VLP by mohly vyvolat HPV, ale slabé HIV-1-specifické vazebné protilátky u BALB/c myší. Kromě toho inzerce HIV-1 P18I10 nebo T20 peptidů do HPV16 L1 proteinu neovlivnila HPV16 L1-specifickou protilátkovou indukci in vivo; (5) L1:P18I10 VLPs by mohly indukovat jak HPV16, tak HIV-1-specifické T-buněčné reakce; (6) BCG.HIVA prime a L1:P18I10 VLP boost vyvolaly nejvyšší velikost splenocytů produkujících IFN ve srovnání s L1:P18I10 VLPs homologními primárními boostery u BALB/c myší. Tato zjištění podpořila další vývoj HIV{59}} vakcín založených na rBCG a chimérických HPV: HIV VLP. Celkově tato studie poskytuje základní strategii, která může být hodná podpory globálního úsilí o vývoj nových chimérických vakcín na bázi VLP pro kontrolu infekcí HPV a HIV.

V této studii by L1:P18I10 a L1:T20 VLP mohly indukovat stejnou hladinu anti-HPV16 L1 vazebných protilátek jako vakcína HPV Gardasil-9. Avšak L1:P18I10 a L1:T20 VLP vyvolávají pouze nízké hladiny P18I10 a T20 epitop-specifických HIV-vazebných protilátkových odpovědí. Předpokládali jsme, že by to mohlo být způsobeno tím, že testovací destičky ELISA byly potaženy rekombinantním proteinem HPV16 L1, peptidem HIV-1 P18I10, respektive peptidem HIV-1 T20. Myší anti-L1 protilátky indukované našimi L1:P18I10 a L1:T20 VLP mohou cílit na více vazebných epitopů L1 proteinu. Naproti tomu myší anti-HIV-1 protilátky vyvolané našimi L1:P18I10 a L1:T20 VLP se zaměřují pouze na jediný HIV peptid (P18I10 nebo T20) na HPV:HIV VLP. V důsledku toho byly celkové maximální hodnoty OD450 anti-HIV-1 vazebných protilátek mnohem nižší než anti-HPV16 L1 protilátky.

Důvod, proč jsme vybrali HPV16 L1 kapsidový protein DE smyčku jako předběžnou inzerční oblast HIV-1 imunogenu, odkazoval na předchozí studii, která imunizovala myši bovinním papilomavirem (BPV): HIV VLPs pro indukci protilátkových odpovědí [20]. Je známo, že epitopy umístěné v povrchově exponovaných DE a FG smyčkách hlavních kapsidových proteinů HPV L1 dominantně přispívají ke zkříženě neutralizujícím protilátkám indukovaným vakcínou [67]. Kromě toho předchozí studie prokázaly, že inzerce HIV-1 MPER do smyčky BPV L1 DE by mohla indukovat částečně neutralizující protilátky, které specificky rozpoznávají nativní konformaci MPER v HIV-1 Env [20]. Žádná data však neukázala, zda rekombinantní BPV L1:MPER VLP ovlivňuje imunogenicitu a neutralizaci proti BPV po vložení HIV-1 MPER do proteinu BPV L1. V naší studii s použitím VLP HPV16 L1 jako vektoru pro přenos antigenu HIV jsme pozorovali, že inzerce peptidu HIV-1 nezměnila strukturu HPV L1 a že chimérické proteiny HPV:HIV si stále udržují schopnost tvořit VLP. Kromě toho jsme provedli koncept imunomůstku, abychom prokázali srovnatelné imunitní reakce mezi kandidátem HPV: HIV VLP (naším) a schválenou HPV vakcínou na bázi VLP (licencovaná Gardasil-9). Naše data odhalila, že inzerce HIV-1 P18I10 nebo T20 peptidu do chimérických HPV: HIV VLPs by mohla vyvolat podobný titr HPV16 L1-specifických vazebných protilátek ve srovnání s HPV Gardasil-9 vakcína. Typově specifické anti-HPV16 L1 vazebné protilátky pozorované u licencované vakcíny HPV Gardasil-9 VLP ve srovnání s chimérickými verzemi vakcíny HPV Gardasil-9 VLP byly v souladu s našimi údaji.

Před imunizací myší by měla být ověřena délka a místo optimálního cizího antigenu HIV{0}} začleněného do HPV16 L1 VLP a in vitro stabilita výsledných chimérických HPV:HIV VLP. Naše současná studie ukázala, že inzerce peptidů P18I10 nebo T20 do proteinu HPV16 L1 neovlivnila in vitro stabilitu, samouspořádání a morfologii chimérických HPV: HIV VLP. Tyto výsledky byly v souladu s předchozími studiemi, které naznačovaly, že inzerce domény HIV-1 MPER do sekvence smyčky BPV L1 DE neovlivnila schopnost kapsidového proteinu BPV L1 samosestavit se na VLP [20]. Epitopy umístěné v povrchově exponovaných DE a FG smyčkách kapsidových proteinů HPV L1 dominantně přispívají k indukci L1-specifických zkříženě neutralizujících protilátek [67]. Zde jsme prokázali, že inzerce HIV-1 P18I10 nebo T20 peptidů do HPV16 L1 DE smyčky neovlivnila indukci L1-specifických protilátek chimérickými HPV: HIV VLP po imunizaci myší. Kromě toho byly HIV-1 P18I10 nebo T20 epitopy na HPV16 DE smyčkách chimérického HPV: HIV VLP detekovány in vitro a byly imunogenní in vivo. HPV16 L1 VLP tvoří potenciální lešení pro povrchové zobrazení požadovaného epitopu HIV-1. V této studii jsme provedli nepřímou ELISA, abychom prokázali konformační peptid P18I10 a T20 přítomný na povrchu našich chimérických HPV: HIV VLP. V budoucnu by imunoelektronová mikroskopie mohla být také dalším přístupem k prokázání strukturní lokalizace a organizace antigenu P18I10 nebo T20 v HPV: HIV VLP.

Samosestavení je reprezentativní index stability in vitro HPV16 L1 VLP. Je známo, že pH, iontová síla, teplota [52] a redoxní prostředí korelují s disulfidovými vazbami kapsidových proteinů HPV16 L1 [53]. Dřívější práce o papilomavirových VLP naznačovaly důležitost disulfidových vazeb pro samouspořádání hlavní kapsidy L1 [68,69]. Tvorba disulfidu indikovala vyšší cystein kapsidového proteinu L1 ve vhodné geometrii [53]. Tyto disulfidové křížové vazby spojují zbytky 175 a 428 (pro HPV16), které stabilizují HPV viriony a VLP [70]. V této studii jsme analyzovali vzorce intermolekulárního disulfidového zesíťování jako nepřímý důkaz, abychom prokázali, že naše kapsidové proteiny L1:P18I10 a L1:T20 mají tendenci se samosestavovat in vitro. Na obrázku 3A jsme prokázali, že purifikované L1:P18I10 a L1:T20 VLP vykazovaly podobné vzorce intermolekulárního disulfidového zesíťování jako HPV16 L1 VLP za stejného pH, iontové síly a tepelných podmínek. Na obrázku 3B jsme dále prokázali, že purifikované proteiny L1:P18I10 a L1:T20 byly schopné samosestavení na větší částice (větší než pentamer L1 s MW 280 kDa) in vitro. Proto jsme společně s morfologickým vzorem VLP s vlastním uspořádáním (ačkoli ikosaedrická struktura nebyla docela dobrá) pozorovaným na obrázku 4, dospěli k závěru, že naše purifikované chimérické HPV: HIV VLP jsou stabilní in vitro. Kromě stability VLP je třeba vzít v úvahu mnoho dalších kritických faktorů, které by mohly ovlivnit imunogenicitu chimérického HPV: HIV VLP, jako je místo inzerce imunogenu mezi různé smyčky VLP [71], dávka, intervaly prime-boost a způsob podání [22]. , atd.

Peptidy P18I10 odvozené z HIV-1 gp120 V3 smyčky jsou prezentovány v buňkách infikovaných HIV molekulami hlavního histokompatibilního komplexu (MHC-I) třídy I [26]. CD8+, cytotoxické T lymfocyty (CTL), by mohly rozpoznat antigeny P18I10 omezené na MHC-I a vylučovat různé cytokiny, jako je IFN-, aby eliminovaly buňky infikované HIV [72–75]. Rekombinantní virová nebo plazmidová DNA jsou dobrými vakcínovými nosiči pro expresi peptidů P18I10 v hostitelských buňkách a indukci P18I10-specifických buněčných odpovědí prostřednictvím dráhy MHC-I [76–79]. Například kombinovaný režim primární aktivace DNA a zesílení modifikovaného viru vakcínie Ankara (MVA) byl dostatečný pro indukci IFN- a CTL odpovědí proti epitopu P18I10 [79]. Naopak exogenní peptidy P18I10 nejsou účinně prezentovány CD8+ T-buňkám cestou MHC-I [80,81] a vyžadují účast vhodných adjuvans [82–85] nebo nosičů antigenů, jako je např. VLP. Například imunogenicita syntetických peptidů P18I10 doplněných adjuvans byla marginální kvůli absenci T-helper determinant [82–85]. Již dříve bylo hlášeno, že HIV-1 Gag VLP [86], VLP povrchového antigenu hepatitidy B (HBsAg) [87], parvovirové VP2 VLP [88] a papilomavirové L1 VLP [17–19] by mohly působit jako dodávací vektory pro prezentaci CTL epitopu omezeného na MHC-I in vivo. Ačkoli mechanismus VLP-indukovaných MHC-I-omezených T-buněčných odpovědí je stále nejasný, partikulární struktura VLPs může prospět endocytickému vychytávání makrofágů nebo dendritických buněk, čímž se dostane do cytosolu a následně vstoupí do typické MHC-I dráhy [89, 90]. Kromě toho bylo pozorováno, že determinant P18I10 omezený na MHC-I indukuje odpovědi pomocných T-buněk CD4+ prostřednictvím dráhy MHC-II [91,92]. Hybridní BPV1 L1 VLP mohou být použity jako nosiče antigenních epitopů k vyvolání terapeutických virově specifických CTL reakcí prostřednictvím MHC-I a MHC-II drah [17,19], což poskytuje slibnou strategii pro návrh vakcíny pro kontrolu virové infekce. Některé rané studie také ukázaly, že BPV L1 VLPs exprimující HPV16 E7 epitop nebo P18I10 epitop HIV-1 gp120 V3 smyčkou indukovaných povrchů sliznic a také systémovou VLP epitop-specifickou humorální a T buněčnou imunitu [18]. V souladu s předchozími studiemi jsme předběžně prokázali, že naše chimérické HPV: HIV (L1:P18I10) VLPs by mohly indukovat HIV-specifické T-buněčné imunitní reakce u BALB/c myší po stimulaci splenocytů peptidem P18I10. Kromě toho primární aktivace BCG.HIVA zvýšila HIV-1-specifickou imunitní odpověď T-buněk u myší. Avšak multifunkční imunitní reakce T-buněk indukované L1:P18I10 VLP by vyžadovaly další imunologické studie.

Širší odpovědi CD8+ T-buněk proti četným konzervovaným epitopům CTL jsou prospěšné k překonání genetické diverzity HIV-1 a úniku [7,93–100]. Racionální design HIV-1 T-buněčných imunogenů, jako je HIVA, by měl mít potenciál reagovat na více CTL epitopů [34]. Imunogen HIV-1 HIVA, navržený Dr. Tomasem Hankem, se skládá z kompletního proteinu HIV-1 Gag kombinovaného s více epitopy CTL včetně epitopů P18I10 na C-konci [34]. DNA, MVA a rBCG byly vybrány jako vehikula pro přenos imunogenu HIV a indukovaly vysokou velikost a šířku buněčných odpovědí specifických pro CTL epitop použitím heterologních režimů prime-boost u myších a nehumánních primátů (NHP) [34,101]. Naše předchozí studie ukázaly, že BCG.HIVA prime v kombinaci s MVA.HIVA boost vyvolalo HIV-1-specifické IFN-produkující CD8+ T-buňky u BALB/c myší [31–33,102]. Je zajímavé, že VLP by mohly být potenciálním boosterem ke zvýšení HIV-specifických buněčných odpovědí při heterologní imunizaci rBCG [29,30] nebo DNA vakcínami [103,104]. Například rBCG exprimující HIV-1 Gag protein by mohl účinně připravit imunitní systém T-buněk pro posílení pomocí Gag VLPs v modelech NHP [29,30]. V současné studii jsme prokázali, že aktivace BCG.HIVA by mohla posílit imunitní reakce T-buněk indukované HPV: HIV (L1:P18I10) VLP. Dále budeme zkoumat rozsah polyfunkčních CD4+, CD8+ a paměťových T-buněk generovaných tímto režimem rBCG prime a VLP boost.

Cistanche deserticola-improve immunity -

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

V současné době se naše výzkumná skupina zaměřuje na vývoj slibných rBCG: HIV vakcín exprimujících nové HIV-1 T-buněčné imunogeny, jako je tHIVconsvX a HIVACAT (HTI) T-buněčný imunogen, ke zlepšení HIV-1 shoda variant a šířka odezvy T-buněk. Imunogeny 2. generace HIVconsvX byly navrženy předefinováním konzervovaných oblastí skupiny M a využitím bivalentního mozaikového designu, aby se maximalizovala shoda potenciálních 9-merních T-buněčných epitopů ve vakcíně s globálními variantami [64]. Imunogen HTI byl navržen tak, aby pokrýval cíle T-buněk, proti nimž jsou reakce T-buněk pozorovány převážně u jedinců infikovaných HIV -1-s nízkou virovou zátěží HIV-1 [65,66]. Protože bylo prokázáno, že papilomové VLP jsou vícenásobnými CTL epitopovými nosiči [17], zaměřili jsme se na konstrukci chimérických HPV16 L1 VLP nesoucích více konzervovaných HIV-1 CTL epitopů v kombinaci s rBCG exprimujícím ThivconsvX nebo HTI T-buněčné imunogeny, abychom indukovali širší CTL imunitní reakce proti HIV-1. Vysoká hustota a mnohočetné kopie HIV-1 CTL epitopu prezentované na chimérických HPV: HIV VLPs mohou zlepšit dodání antigenu do imunitního systému a vyvolat vyšší frekvenci CTL odpovědí. Naproti tomu rekombinantní BCG pravděpodobněji generuje nižší frekvenci CTL odpovědí v důsledku pomalé replikace in vivo. Protože BCG má zřetelný vliv na diferenciaci T buněk, což znamená, že BCG může indukovat paměť CD8+ T buněk prostřednictvím účasti CD4+ T-pomocných buněk [105], tato imunogenní vlastnost může učinit BCG vhodným jako primární aktivační činidlo v heterologních režimech prime-boost. Očekávali jsme tedy, že naše HPV: HIV VLP se mohou jevit jako slibný booster pro zvýšení velikosti a šíře HIV-1 CTL odpovědí při aktivaci rekombinantním BCG exprimujícím nový HIV-1 T-buněčný imunogen .

Peptid T20 obsahuje vysoce konzervovaný lineární epitop 2F5 (ELDKWA). Uvádí se, že protilátka 2F5 odebraná pacientům dlouhodobě infikovaným HIV má širokou neutralizační účinnost [106,107]. MPER gp41 je považován za málo imunogenní, možná souvisí s jeho umístěním v blízkosti buněčné a virové fosfolipidové dvojvrstvy [108]. Použití DNA vektorů prezentujících MPER v lipidovém prostředí je výhodné pro indukci gp41-specifických nAb [109–111]. Bylo například prokázáno, že DNA vakcíny kódující HIV-1 T20-, navržené Dr. Brittou Wahrenovou, vyvolávají reakce neutralizačních protilátek (nAb) zkřížených kladů [109]. Naproti tomu mnoho časných pokusů o indukci nAb zacílených na gp41 pomocí strategií peptidové nebo podjednotkové vakcíny selhalo [112–116]. Některé studie nedávno ukázaly, že BPV L1 VLP exprimující epitop 2F5 nebo MPER protilátek specifických proti HIV-1 gp41 indukované 2F5- u myší vedly ke křížové neutralizaci [20,21]. Podobný vzorec imunogenicity byl nalezen, když byl povrchový antigen hepatitidy B (HBsAg) fúzován s epitopem HIV-1 2F5 nebo MPER [59,117–119]. Zde jsme prokázali, že prezentace HIV-1 T20 a P18I10 peptidu v naší chimérické HPV16 L1 VLP by mohla indukovat protilátkové reakce proti HIV{42}} a HPV16. Neutralizační epitopy stabilizované na konformačním skafoldu, jako jsou funkční hroty HIV{44}} nebo VLP, by mohly být hlavním proudem návrhu imunogenu B-buněk pro dosažení širokých neutralizačních protilátek (bnAbs) [93]. Většina nových epitopů bnAb (přibližně 90 %) jsou však nespojité a konstituované oblasti spojené v 3-dimenzionálních konfiguracích [120]. Přestože prezentace nespojitých epitopů na proteinovém lešení by mohla být předvídána pomocí výpočetního modelování [121], tyto epitopy bnAb by mohly být vystaveny začlenění do neobaleného proteinového skeletu HPV16 L1. Naproti tomu menšina HIV-1 B-buněčných imunogenů, jako je MPER (2F5) HIV-1 gp41 nebo smyčka V3 (P18IIB) gp120, obsahuje lineární neutralizační epitopy a může být vhodná pro HPV: HIV proteinová páteř. Proto jsme vybrali lineární 2F5 neutralizační epitop, který je součástí rozšířeného T20 peptidu HIV-1 MPER z hlediska struktury příznivé pro tvorbu -helixu [122]. T20 peptidy by mohly být fúzovány a stabilizovány na L1 kapsidových skafoldech pro vyvolání neutralizačních protilátkových odpovědí, pokud by mohla být prezentována nativní konfigurace 2F5 epitopu. V této studii jsme zjistili, že 2F5 nAb byly navázány na chimérické HPV: HIV (L1:T20) VLP in vitro. Kromě toho mohou L1:T20 VLP také indukovat T20-specifické vazebné protilátky u BALB/c myší. Přibývalo důkazů, že protilátky inhibující fúzi HIV{81}} (T20) indukované peptidem mají podobné vlastnosti jako anti-HIV{85}} fúzní peptid Enfuvirtid vázat hydrofobní transmembránový zbytek T20 umístěný v MPER gp41 během HIV-1 fúze a přispívají k virové kontrole [109,123,124]. Podle našich předchozích přehledů by racionální návrh chimérických vakcín založených na VLP pro indukci HPV a HIV-specifických neutralizačních protilátek a CTL odpovědí bylo vždy nutné zvážit z hlediska imunogenové selekce, vektorů pro dodávání antigenu a režimů prime-boost. Závěrem lze říci, že tato studie ukázala alternativní expresní platformu založenou na savčích buňkách a škálovatelnou chromatografickou purifikační metodu pro inženýrství chimérických HPV: HIV VLP. Domníváme se, že naše nové purifikační metody pomohou při získávání antigenních HPV: HIV VLP ze savčích buněk s cílem snížit čas, náklady a práci a zároveň zvýšit kapacitu pro průmyslovou výrobu. Kromě toho jsme ukázali, že HPV16 L1 VLP mohou fungovat jako platforma pro přenos HIV-1 peptidového antigenu, protože inzerce peptidů P18I10 nebo T20 do DE smyčky kapsidových proteinů HPV16 L1 neovlivnila in vitro stabilitu, samouspořádání a morfologii chimérických HPV: HIV VLPs a ano neinterferují s indukcí HPV16 L1-specifických protilátek in vivo. Na druhé straně chimérické HPV: HIV VLPs by mohly vyvolat HPV16 a HIV-specifické B a T-buněčné imunitní reakce proti oběma virům. Tato zpráva zkoumala možnost vývoje HIV{111}} vakcín založených na rekombinantních BCG exprimujících HIV{112}} imunogenech a HPV: HIV VLPs, které lze použít pro dětskou HIV{113}} imunizaci. Protože vývoj účinné chimérické vakcíny proti HPV16 a HIV{115}} je stále výzvou, tato práce přispívá k vývoji nové chimérické vakcíny HPV: HIV VLP pro kontrolu HPV16 a HIV{118 }} infekce, která je naléhavě potřebná v rozvojových a průmyslových zemích.

Reference

1. Globální statistika HIV a AIDS UNAIDS-2018. 2019. Dostupné online: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (přístup 15. června 2020).

2. Baeten, JM PrEP pro HIV: Stupeň A pro důkazy, ale čeká se na dopad. Nat. Rev. Urol. 2019, 16, 570–571. [CrossRef]

3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Chiu, J.; Paris, R.; Premsri, N.; Namwat, C.; De Souza, M.; Adams, E.; a kol. Očkování pomocí ALVAC a AIDSVAX k prevenci infekce HIV-1 v Thajsku. N. Engl. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [CrossRef]

4. Ng'uni, T.; Chasara, C.; Ndhlovu, ZM Hlavní vědecké překážky ve vývoji vakcíny proti HIV: Historická perspektiva a budoucí směry. Přední. Immunol. 2020, 11, 590780. [CrossRef]

5. Robinson, HL vakcíny proti HIV/AIDS: 2018. Clin. Pharmacol. Ther. 2018, 104, 1062–1073. [CrossRef]

6. Wang, Q.; Zhang, L. Široce neutralizující protilátky a návrh vakcíny proti infekci HIV-1. Přední. Med. 2020, 14, 30–42. [CrossRef]

7. Collins, DR; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ T buňky v kontrole, léčbě a prevenci HIV. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]

8. Pollard, AJ; Bijker, EM Průvodce vakcinologií: Od základních principů k novému vývoji. Nat. Rev. Immunol. 2021, 21, 83–100. [CrossRef]

9. Shapiro, SZ Lekce pro obecný výzkum vakcinologie z pokusů vyvinout vakcínu proti HIV. Vakcína 2019, 37, 3400–3408. [CrossRef]

10. Ahmed, HG; Bensumaidea, SH; Alshammari, FD; Alenazi, FSH; ALmutlaq, BA; Alturkstani, MZ; Aladani, IA Prevalence lidského papilomaviru podtypu 16 a 18 mezi jemenskými pacientkami s rakovinou děložního čípku. Asian Pacific J. Cancer Předchozí. 2017, 18, 1543–1548. [CrossRef]

11. Olcese, VA; Chen, Y.; Schlegel, R.; Yuan, H. Charakterizace domén smyčky HPV16 L1 při tvorbě typově specifického, konformačního epitopu. BMC Microbiol. 2004, 4, 29. [CrossRef]

12. Dupuy, C.; Buzoni-Gate, D.; Touze, A.; Le Cann, P.; Bout, D.; Coursaget, P. Imunita zprostředkovaná buňkami indukovaná u myší částicemi podobnými viru HPV 16 L1. Microb. Patog. 1997, 22, 219–225. [CrossRef] [PubMed]

13. Schiller, J.; Lowy, D. Vysvětlení vysoké účinnosti profylaktických vakcín proti HPV. Vakcína 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]

14. Markowitz, LE; Schiller, JT Human Papillomavirus Vaccines. J. Infect. Dis. 2021, 224, S367–S378. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, CW; Saubi, N.; Joseph-Munné, J. Návrhové koncepce vakcín proti HIV na bázi viru podobných částic-1. Přední. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]

16. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph, J. Navrhování chimérických virových částicových vakcín pro lidský papilomavirus a HIV: Poučení. AIDS Rev. 2019, 21, 218–232. [CrossRef]

17. Liu, WJ; Liu, XS; Zhao, KN; Leggatt, GR; Frazer, IH částice podobné viru papilomaviru pro dodání více cytotoxických T buněčných epitopů. Virologie 2000, 273, 374–382. [CrossRef]

18. Liu, XS; Abdul-Jabbar, I.; Qi, YM; Frazer, IH; Zhou, J. Slizniční imunizace částicemi podobnými viru papilomaviru vyvolává systémovou a slizniční imunitu u myší. Virologie 1998, 252, 39–45. [CrossRef]

19. Peng, S.; Frazer, IH; Fernando, GJ; Zhou, J. Částice podobné viru papillomaviru mohou dodávat definované CTL epitopy do dráhy MHC I. třídy. Virologie 1998, 240, 147–157. [CrossRef]

20. Zhai, Y.; Zhong, Z.; Zariffard, M.; Kopí, GT; Qiao, L. Částice podobné bovinnímu papilomaviru představující konzervované epitopy z membránově proximální vnější oblasti mukózních a systémových protilátek indukovaných HIV-1 gp41. Vaccine 2013, 31, 5422–5429. [CrossRef]

21. Zhang, H.; Huang, Y.; Fayad, R.; Kopí, GT; Qiao, L. Indukce slizničních a systémových neutralizačních protilátek proti viru lidské imunodeficience typu 1 (HIV-1) orální imunizací bovinním papilomavirem-HIV-1 částicemi podobnými chimérickému viru gp41. J. Virol. 2004, 78, 8342–8348. [CrossRef]

22. Xiao, SL; Wen, JL; Kong, NZ; Yue, HL; Leggatt, G.; Frazer, IH Způsob podání chimérického BPV1 VLP určuje charakter indukovaných imunitních odpovědí. Immunol. Cell Biol. 2002, 80, 21–29. [CrossRef]

23. Kirnbauer, R.; Taub, JANET; Greenstone, HEATHER; Roden, RICHARD; Dürst, M.; Gissmann, L.; Lowy, DR; Schiller, JT Efficient Self-Assembly of Human Papillomavirus Type 16 LI a L1-L2 to Virus-like Particles. J. Virol. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]

24. Zhao, Q.; Potter, CS; Carragher, B.; Lander, G.; Sworen, J.; Towne, V.; Abraham, D.; Duncan, P.; Washabaugh, MW; Sitrin, RD Charakterizace viru podobných částic v GARDASIL® pomocí kryotransmisní elektronové mikroskopie. Hučení. Vakcíny Immunother. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]

25. Achour, A.; Lemhammedi, S.; Picard, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrím, Z.; Willer, A.; Beix, F.; Burny, A.; Zagury, D. Cytotoxické T lymfocyty specifické pro HIV-1 antigen gp160 a syntetický peptid P18IIIB u jedince imunizovaného HLA-A11-. AIDS Res. Hučení. Retroviry 1994, 10, 19–25. [CrossRef]

26. Nakagawa, Y.; Kikuchi, H.; Takahashi, H. Molekulární analýza TCR a interakce peptid/MHC pomocí P18-I10-odvozených peptidů s jednou substitucí D-aminokyseliny. Biophys. J. 2007, 92, 2570–2582. [CrossRef]

27. Qiu, Z.; Chong, H.; Yao, X.; Su, Y.; Cui, S.; He, Y. Identifikace a charakterizace podkapsy na N-trimeru HIV-1 Gp41: Důsledky pro vstup viru a cíl léčiva. Pomůcky 2015, 29, 1015–1024. [CrossRef]

28. Peters, BS; Cheingsong-Popov, R.; Callow, D.; Foxall, R.; Patou, G.; Hodgkin, K.; Weber, JN Pilotní studie fáze II bezpečnosti a imunogenicity HIV p17/p24:VLP (p24-VLP) u asymptomatických HIV séropozitivních subjektů. J. Infect. 1997, 35, 231–235. [CrossRef]

29. Chege, GK; Burgers, WA; Stutz, H.; Meyers, AE; Chapman, R.; Kiravu, A.; Bunjun, R.; Shephard, EG; Jacobs, WR; Rybicki, EP; a kol. Robustní imunita vůči auxotrofnímu kandidátovi na vakcínu proti HIV Mycobacterium bovis BCG-VLP Prime-Boost v modelu primátů kromě člověka. J. Virol. 2013, 87, 5151–5160. [CrossRef]

30. Chege, GK; Thomas, R.; Shephard, EG; Meyers, A.; Bourn, W.; Williamson, C.; Maclean, J.; Šedá, CM; Rybicki, EP; Williamson, AL Primární imunizační režim s použitím rekombinantních BCG a Pr55gag viru podobných částicových vakcín založených na HIV typu 1 subtypu C úspěšně vyvolává Gag-specifické reakce u paviánů. Vaccine 2009, 27, 4857–4866. [CrossRef]

31. Josef, J.; Saubi, N.; Im, EJ; Fernández-Lloris, R.; Gil, O.; Cardona, PJ; Gatell, JM; Hanke, T. Vakcinace novorozených myší pomocí BCG.HIVA222 + MVA.HIVA zvyšuje HIV-1-specifické imunitní reakce: Vliv věku a imunizačních cest. Clin. Dev. Immunol. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]

32. Saubi, N.; Gea-Mallorquí, E.; Ferrer, P.; Hurtado, C.; Sánchez-Úbeda, S.; Eto, Y.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Navrhování nového designu mykobakteriální vakcíny pro dětskou vakcínu HIV-TB vektorovanou lysinovým auxotrofem BCG. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2014, 1, 14017. [CrossRef]

33. Mahant, A.; Saubi, N.; Eto, Y.; Guitart, N.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Preklinický vývoj BCG.HIVA2auxo.int, obsahující integrační expresní vektor, pro dětskou vakcínu proti HIV-TB. Posílení stability a specifické HIV-1 T-buněčné imunity. Hučení. Vakcíny Immunother. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]

34. Hanke, T.; McMichael, AJ Návrh a konstrukce experimentální HIV-1 vakcíny pro roční-2000 klinickou studii v Keni. Nat. Med. 2000, 6, 951-955. [CrossRef] [PubMed]

35. Durocher, Y.; Perret, S.; Kamen, A. Vysokoúrovňová a vysoce výkonná produkce rekombinantního proteinu přechodnou transfekcí lidských 293-EBNA1 buněk rostoucích v suspenzi. Nucleic Acids Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]

36. Kim, HJ; Kim, SY; Lim, SJ; Kim, JY; Lee, SJ; Kim, HJ Jednokrokové chromatografické čištění proteinu L1 lidského papilomaviru typu 16 ze Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr. Purif. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]

37. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph-Munné, J. Exprese chimérického HPV-HIV proteinu L1P18 v pichia pastoris; purifikace a charakterizace viru podobných částic. Pharmaceutics 2021, 13, 1967. [CrossRef]

38. GE. Použití CaptoTM Core 700 a Capto Q ImpRes při čištění částic podobných lidskému papilomaviru. J. Asia's Pharm. Biopharm. Ind. 2014, 1.–4.

39. McLean, CS; Churcher, MJ; Meinke, J.; Smith, GL; Higgins, G.; Stanley, M.; Minson, AC Výroba a charakterizace monoklonální protilátky proti lidskému papilomaviru typu 16 pomocí rekombinantního viru vakcínie. J. Clin. Pathol. 1990, 43, 488–492. [CrossRef]

40. Merck Canada Inc. Produktová monografie Gardasil®. Prod. Monogr. Monopril Prod. Monogr. 2015, 1–71.

41. Achour, A.; Persson, K.; Harris, RA; Sundbäck, J.; Sentman, CL; Lindqvist, Y.; Schneides, G.; Kärre, K. Krystalová struktura H-2D(d) MHC třídy I v komplexu s HIV-1- odvozeným peptidem P18-110 při rozlišení 2,4 Å: Důsledky pro T buňky a NK buňky uznání. Imunita 1998, 9, 199–208. [CrossRef]

42. Pang, W.; Tom, SC; Zheng, YT Současné inhibitory fúze HIV typu-1. Antivir. Chem. Chemother. 2009, 20. [CrossRef]

43. Chen, XS; Garcea, RL; Goldberg, I.; Casini, G.; Harrison, SC Struktura malých částic podobných viru sestavených z L1 proteinu lidského papilomaviru 16. Mol. Cell 2000, 5, 557–567. [CrossRef] [PubMed]

44. den, PM; Weisberg, AS; Thompson, CD; Hughes, MM; Pang, YY; Lowy, DR; Schiller, JT Lidský papilomavirus 16 kapsid zprostředkovává jaderný vstup během infekce. J. Virol. 2019, 93, e00454-19. [CrossRef]

45. Zhou, J.; Dveře, J.; Slunce, XY; Crawford, LV; McLean, CS; Frazer, IH Identifikace jaderného lokalizačního signálu proteinu L1 lidského papilomaviru typu 16. Virologie 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Vlps, A.; Middelberg, APJ; Lua, LHL Biologické zpracování částic podobných viru: Výzvy a příležitosti. Pharm. Bioprocess. 2013, 1, 407–409.

47. Bousarghin, L.; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Pozitivně nabité sekvence kapsidových proteinů lidského papilomaviru typu 16 jsou dostatečné pro zprostředkování přenosu genu do cílových buněk prostřednictvím receptoru heparansulfátu. J. Gen. Virol. 2003, 84, 157–164. [CrossRef]

48. Sasagawa, T.; Pushko, P.; Steers, G.; Gschmeissner, SE; Nasser Hajibagheri, MA; Finch, J.; Crawford, L.; Tommasino, M. Syntéza a sestavení viru podobných částic lidských papilomavirů typu 6 a typu 16 u štěpné kvasinky Schizosaccharomyces pombe. Virologie 1995, 206, 126–135. [CrossRef]

49. Biemelt, S.; Sonnewald, U.; Galmbacher, P.; Willmitzer, L.; Müller, M. Produkce částic podobných lidskému papilomaviru typu 16 viru v transgenních rostlinách. J. Virol. 2003, 77, 9211–9220. [CrossRef]

50. Zahin, M.; Joh, J.; Khanal, S.; Husk, A.; Mason, H.; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Miller, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Škálovatelná produkce proteinu HPV16 L1 a VLP z listů tabáku. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [CrossRef]

51. Aires, KA; Cianciarullo, AM; Carneiro, SM; Villa, LL; Boccardo, E.; Pérez-Martinez, C.; Perez-Arellano, I.; Oliveira, MLS; Ho, PL Produkce částic podobných viru L1 lidského papilomaviru typu 16 rekombinantními buňkami Lactobacillus casei. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72, 745–752. [CrossRef]

52. Shank-Retzlaff, ML; Zhao, Q.; Anderson, C.; Hamm, M.; Vysoká, K.; Nguyen, M.; Wang, F.; Wang, N.; Wang, B.; Wang, Y.; a kol. Hodnocení tepelné stability Gardasil®. Hučení. Vakcína. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

53. Mukherjee, S.; Thorsteinsson, MV; Johnston, LB; DePhillips, PA; Zlotnick, A. Kvantitativní popis in vitro shromáždění viru podobných částic lidského papilomaviru 16. J. Mol. Biol. 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]

54. McCarthy, MP; Bílá, WI; Palmer-Hill, F.; Koenig, S.; Suzich, JA. Kvantitativní demontáž a opětovné sestavení částic viru typu 11 lidského papilomaviru in vitro. J. Virol. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]

55. Kirnbauer, R.; Booy, F.; Cheng, N.; Lowy, DR; Schiller, JT Hlavní kapsidový protein papillomaviru L1 se sám sestavuje do viru podobných částic, které jsou vysoce imunogenní. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 1992, 88, 12180–12184. [CrossRef]

56. Patel, MC; Patkar, KK; Basu, A.; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Produkce viru podobných částic odvozených od hlavního kapsidového proteinu imunogenního lidského papilomaviru-16. Indian J. Med. Res. 2009, 130, 213–218.

57. Shi, L.; Sanyal, G.; Ni, A.; Luo, Z.; Doshna, S.; Wang, B.; Graham, TL; Wang, N.; Volkin, DB Stabilizace částic podobných viru lidského papilomaviru neiontovými povrchově aktivními látkami. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538–1551. [CrossRef]

58. Carter, JJ; Wipf, GC; Benki, SF; Christensen, ND; Galloway, DA Identifikace lidského papilomaviru typu 16-specifického epitopu na C-terminálním rameni hlavního kapsidového proteinu L1. J. Virol. 2003, 77, 11625–11632. [CrossRef]

59. Von Brunn, A.; Brand, M.; Reichhuber, C.; Morys-Wortmann, C.; Deinhardt, F.; Schdelt, F. Hlavní neutralizační doména HIV-I je vysoce imunogenní, když je exprimována na povrchu částic jádra hepatitidy B. Vaccine 1993, 11, 817-824. [CrossRef]

60. Dennison, SM; Anasti, K.; Scarce, RM; Sutherland, L.; Parks, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Gorny, MK; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; a kol. Neneutralizující lidské monoklonální protilátky HIV-1 gp41 Envelope Cluster II vykazují polyreaktivitu při vazbě na fosfolipidy a proteinové autoantigeny. J. Virol. 2011, 85, 1340–1347. [CrossRef]

61. Trkola, A.; Kuster, H.; Rusert, P.; Joos, B.; Fischer, M.; Leemann, C.; Manrique, A.; Huber, M.; Rehr, M.; Oxenius, A.; a kol. Zpoždění návratu HIV-1 po ukončení antiretrovirové terapie pasivním přenosem lidských neutralizačních protilátek. Nat. Med. 2005, 11, 615–622. [CrossRef]

62. Shank-Retzlaff, M.; Wang, F.; Morley, T.; Anderson, C.; Hamm, M.; Brown, M.; Rowland, K.; Pancari, G.; Zorman, J.; Dolní.; a kol. Korelace mezi myší účinností a in vitro relativní účinností pro částice podobné viru typu 16 lidského papilomaviru a vzorky vakcíny Gardasil. Hučení. Vakcína. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]

63. Kilpeläinen, A.; Maya-Hoyos, M.; Saubí, N.; Soto, CY; Joseph Munne, J. Pokroky a výzvy ve vývoji rekombinantní vakcíny proti HIV založené na BCG: Poučení. Expert Rev. Vaccines 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]




Mohlo by se Vám také líbit