Kapitola 2: Renální tubulární peroxizomy jsou postradatelné pro normální funkci ledvin

Pro více informací. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Diskuse

Vysoký výskyt peroxizomů v proximálním tubulu spolu s přítomností renálních abnormalit u pacientů se ZSD silně naznačují důležitou roli peroxizomů vledvina. Exprese několika peroxisomálních enzymů specifická pro ledviny navíc podpořila myšlenku, že renální peroxizomy mohou mít biologické funkce částečně odlišné od funkcí v jiných tkáních(15). Abychom tyto hypotézy otestovali, zkoumali jsmefunkce ledvinu myší bez peroxizomů specificky urenální tubule. Mezi různými myšími modely používanými ke studiu role peroxizomů jsme vybrali myši umožňující podmíněnou genetickou inaktivaci Pex5 kódujícího faktor biogeneze peroxizomu PEX5 nezbytný pro tvorbu peroxizomu. Tento model byl zvolen proto, že (i)Pex5-null myši vykazují mnoho biochemických a funkčních abnormalit připomínajících ty, které byly pozorovány u pacientů se ZSD(11) a (i) bylo analyzováno velké spektrum myších modelů s tkáňově specifickou ablací Pex5(16), což nám umožňuje porovnat funkční důsledky peroxisomálního deficitu v renálním tubulu s těmi, které byly pozorovány v jiných tkáních. Jak ukázali Baes et al., myši Pex5-null vykazovaly intrauterinní retardaci růstu, malformaci mozku a těžkou hypotonii a zemřely během prvních 72 hodin života (11). Biochemické analýzy odhalily několik charakteristických znaků ZSD, včetně vyčerpání plazmalogenů v játrech a mozku a silného zvýšení plazmatických hladin VLCFA. V ledvinách myší Pex5-null při P0,5 nebyly nalezeny žádné kortikální renální cysty, ale byla pozorována retardace intrauterinního zrání glomerulů. Přítomnost usazenin šťavelanu vápenatého nebyla zkoumána.

Klikněte zde pro získání informací o výhodách bylin cistanche

U myší cKOm nezpůsobila ablace peroxizomální biogeneze v renálním tubulu žádný významný fenotyp, s výjimkou snížení KW a BW u kojenců cKOm myší a snížení poměru KW/BW u dospělých myší cKOm. U myší cKOf neúplná excize floxované alely Pex5 spolu s mnohem mírnějším účinkem delece Pex5 na renální transkriptom a metabolom naznačily, že některé zbytkové peroxizomy mohou zůstat v renálním tubulu. NicméněSexnelze vyloučit ani specificitu peroxizomálních funkcí v ledvinách. Nenašli jsme žádný významný morfologický rozdíl v ledvinách myší cKOm, který by mohl vysvětlit nižší poměr KW nebo KW/BW. Tendence ke snížení šířky proximálních buněk však může být možnou příčinou tohoto rozdílu. Důležité je, že renální homeostatická funkce byla u myší cKOm zachována navzdory výrazným změnám v hladinách exprese transkriptů kódujících proteiny podílející se na transepiteliálním transportu iontů, vody, aminokyselin, organických aniontů a kationtů, fosfátů, urátu a megalinem zprostředkované multili-gand endocytární dráhy. Za zmínku stojí, že většina downregulovaných transkriptů kódovala transportéry vyjádřené v proximálním tubulu, zatímco většina upregulovaných transkriptů kódovala transportéry vyjádřené v distálnějších částech nefronu. Například zvýšená exprese transkriptů Nkcc2, Clc-Kb, Ncc a βENaC naznačovala kompenzační upregulaci v postproximální reabsorpci sodíku. Integrovaná analýza renálního transkriptomu a metabolomu odhalila hluboké změny v různých buněčných drahách souvisejících s buněčným metabolismem, složením lipidové membrány a redox homeostázou. V ledvinách myší cKOm vykazovalo asi 8% transkriptomu a asi 24% detekovaných metabolitů různé hladiny ve srovnání s myší Ctrl. Jak se očekávalo, mnoho z těchto transkriptů a metabolitů souviselo s peroxisomální funkcí. Bylo pozorováno dramatické snížení množství etherfosfolipidových plazmalogenů, které jsou syntetizovány v peroxizomech (~ 67% u myší cKOm a ~ 50% u myší cKOf, nevážený součet všech detekovaných druhů plazmalogů). Plasmalogeny jsou hlavní fosfolipidy buněčné membrány s rostoucím počtem přiřazených funkcí, včetně integrity membrány, buněčné signalizace a antioxidační obrany. V ledvinách představují plazmalogeny přibližně 20 % celkových fosfolipidů(17), což naznačuje, že nejméně 10 % složení fosfolipidů se lišilo v ledvinách myší cKOm a cKOf od příslušných kontrol. Deplece plazmalogenů byla potenciálně kompenzována zvýšeným množstvím strukturně podobných fosfatidylethanolaminů (PE) a fosfatidylcholinů (PC), které vykazovaly podstatné obohacení ledvin jak u cKOm, tak u cKOf myší. Za zmínku stojí, že podobný kompenzační nárůst PE a PC byl pozorován v ledvinách pacientů se ZSD (17).

Metabolismus proximálního tubulu závisí hlavně na oxidaci mastných kyselin, která se vyznačuje vysokou generací ROS produkované jak v mitochondriích, tak v peroxisomech. U myší cKO byly cesty související s degradací/biosyntézou mastných kyselin podstatně upregulovány, což potenciálně naznačuje kompenzační zvýšení produkce mitochondriální energie z těchto substrátů. Vzhledem k tomu, že jednou z hlavních funkcí peroxizomů je detoxikace ROS, předpokládali jsme, že ablace biogeneze peroxizomu by indukovalaoxidační stresv ledvinách myší cKO. Molekulární analýzy však neodhalily změny v antioxidační kapacitě a biomarkerech oxidačního stresu. Výzva k léčbě HFD nevyvolala změny funkčního fenotypu, s výjimkou mírného zvýšení objemu moči a vylučování vápníku a urátu močí u myší cKOm. Integrovaná analýza transkriptomu a metabolomu umožnila identifikaci glutathionové dráhy jako možného kompenzačního mechanismu pro udržení celkové antioxidační kapacity v buňkách renálních proximálních tubulů bez peroxisomů.

Podmíněná delece Pex5 v játrech plodu(12), v pankreatických β buňkách(18) a v různých typech buněk centrálního nervového systému (přezkoumáno v ref.16) způsobuje různá, ale většinou závažná orgánově specifická funkční zhoršení. To nebyl případ ledvin. V této studii jsme identifikovali několik vnitřních renálních mechanismů, které potenciálně umožňují vyrovnat se s nedostatkem peroxizomů. Vzhledem k tomu, že ledviny jsou orgánem, který vykazuje vysokou míru perfuze krve, další možnost spočívá v extrarenálním původu alespoň části metabolitů, které ledviny neprodukují v nepřítomnosti peroxizomů, ale které jsou potřebné pro normální funkci ledvin. Souhrnně naše údaje naznačují, že renální tubulární peroxizomy jsou postradatelné pro normální funkci ledvin a že patofyziologické změny v ledvinách pacientů se ZSD jsou extrarenálního původu.

Metody

Zvěř. Postupy používané ke generování myší Pex5a/la/Pax8-ntTA/LC-1 Cre byly popsány již dříve (13). 3 linie myší použité v této studii jsou inbrední kmeny, chované na genetickém pozadí myši C57BL / 6J (Jacksonova laboratoř). Před všemi experimenty byly myši přizpůsobeny 12hodinovému cyklu světla / 12 hodin tmy. Všechny experimenty byly provedeny v cirkadiánním čase ZT3 (ZT0je doba, kdy je světlo zapnuto, a ZT12 je čas, kdy je světlo vypnuto).

Byly použity trojité transgenní samce nebo samice myší Pex5bxlo/Pax8-rtTA/LC1 (označované jako cKOm a cKOf) a myši Pex5l/a (označované jako Ctrl nebo Ctrl). Rekombinace Pex5 u novorozenců byla provedena přidáním 0,2% DOXu a 2% sacharózy do pitné vody březích samic myší po dobu 2 týdnů, počínaje jejich 14. březostním dnem. Pro rekombinaci Pex5 u dospělých myší byly DOX a sacharóza přidány do pitné vody 8týdenních myší. Struktura a funkce ledvin byly hodnoceny 4 týdny po ukončení léčby DOXem u 4týdenních kojenců myší nebo 14týdenních dospělých myší. Po odstavení po 3 týdnech byly myši krmeny standardní kontrolní dietou obsahující 4,2% tuku (nízkotučná kontrolní dieta Sniff) nebo, pokud je to zmíněno, po dobu 4 týdnů s odpovídajícím HFD obsahujícím 20,7% tuku (většinou LCFA).

Metabolické klece a chemie krve a moči. Myši byly umístěny v jednotlivých metabolických klecích (Tecniplast). Sběr moči byl proveden po 3denním adaptačním období. Chemie moči a krve byla analyzována tak, jak bylo popsáno výše (19). Složení plazmy a moči bylo měřeno v Laboratoire Central de Chimie Clinique, Centre Hospitalier Universitaire Vaudoise University Hospital (Lausanne, Švýcarsko).

Elektronová mikroskopie. Vzorky ledvin byly nakrájeny na kousky kolem 1 mm³ a fixovány v roztoku glutaraldehydu (EMS)2,5% ve fosfátovém pufru (PB,0,1 M pH7,4) (MilliporeSigma) po dobu 2 hodin při pokojové teplotě (RT). Poté byly 3x opláchnuty, po 5 minutách, v PB pufru a poté postfixovány čerstvou směsí oxidu osmnatého 1% (EMS) s 1,5% hexakyanoželeznatanu draselného (MilliporeSigma) v PB po dobu 2 hodin při RT. Vzorky byly poté 3x promyty v destilované vodě a dehydratovány v roztoku acetonu (MilliporeSigma) ve odstupňovaných koncentracích (30 % 90 minut; 70 % 90 minut; 100 % 120 minut; 100 % 240 minut). Následovala infiltrace pryskyřice Epon(MilliporeSigma) ve odstupňovaných koncentracích (Epon/aceton [1/3; V/V] 4 hodiny; Epon/aceton [3/1;v/v] 4 hodiny, Epon/aceton [1/1;v/v] 8 hodin; Epon/aceton [1/1; V/V] 24 hodin) a nakonec polymerace po dobu 48 hodin při teplotě 60 °C v sušárně. Ultratenké průřezy 50 nm byly vyříznuty na Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH) a zachyceny na měděné štěrbinové mřížce 2×1 mm (EMS), potažené polystyrenovou fólií (MilliporeSigma). Řezy byly postinovány uranylacetátem (MilliporeSigma)2% v H, O po dobu 10 minut, několikrát opláchnuty H, O následované Reynoldsovým citrátem olovnatým po dobu 10 minut a několikrát opláchnuty H, O.

Stereologie. Pro stereologickou analýzu byly analyzovány 3 kousky kůry ledvin na myš, 15 mikrografů na vzorek o velikosti pixelů 4,08 nm za použití systematického rovnoměrného náhodného odběru vzorků transmisním elektronovým mikroskopem (Philips CM100, Thermo Fisher Scientific) při akceleračním napětí 80 kV s digitální kamerou TVIPS TemCam-F416 (TVIPS GmbH).

Transkriptomická analýza. Všechna sekvenční data jsou veřejně dostupná prostřednictvím NIH Gene Expression Omnibus (přístupové číslo GSE179202). Knihovny RNA-Seq byly připraveny s použitím 200 ng celkové ledvinové RNA, jak je popsáno v Nikolaeva et al. (19). Byla použita činidla Illumina TruSeq SR Cluster Kit v4. Sekvenční data byla zpracována pomocí Mus musculus. Anotace genu GRCm38.86, Statistická analýza byla provedena v R (verze 3.4.0). Přepisy s nízkým počtem byly odfiltrovány podle pravidla 1 počet na milion (CPM) v nejméně 1 vzorku. Velikosti knihoven byly škálovány pomocí normalizace TMM a log-transformovány do CPM pomocí voom (20). Analýza hlavních komponent ukázala malou variabilitu mezi replikovanými vzorky. Diferenciální exprese mezi cKO a Ctrl myší byla vypočtena do testu 1 F pomocí limmy (21). Hodnoty P byly upraveny tak, jak je popsáno (22), na hodnoty FDR, aby se vzalo v úvahu pro vícenásobné srovnání, s použitím výsledků všech transkriptů u mužů a žen nebo výsledků vybraných transportérů nebo peroxisomálně souvisejících transkriptů pouze u mužů. Přepisy s FDR<5% were="" considered="" significant.="" comparisons="" of="" expression="" levels="" were="" done="" using="" the="" mean="" fc="" of="" cpm="" in="" cko="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" individual="" values="" were="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" a="" weighted="" gsea="" was="" performed="" using="" the="" unfiltered="" transcript="" list="" ranked="" by="" signed="" p-value="" (product="" of="" p-value="" and="" sign="" of="" the="" fc).="" the="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" gsekegg="" function="" from="" the="" r="" package="" cluster="" profile(version="" 3.16.1)(23).="" kegg="" pathway="" collections="" were="" restricted="" to="" gene="" sets="" with="" minimum="" and="" maximum="" sizes="" of="" 10="" and="" 500,="" respectively.="" the="" enrichment="" scores="" were="" normalized="" by="" gene="" set="" size,="" and="" their="" statistical="" significance="" was="" assessed="" by="" permutation="" tests="" (n="">

Metabolomická analýza. Metabolity ze zmrazených vzorků ledvin byly identifikovány ultravysokou kapalinovou chromatografií a tandemovou hmotnostní spektroskopií a kvantifikovány pomocí AUC (Metabolon Inc). Nezpracované hodnoty byly logaritmálně transformovány a normalizovány z hlediska počtu surových ploch. Obousměrné kontrastní testy ANOVA byly použity k identifikaci biochemikálií, které se významně lišily mezi cKO a Ctrl myší obou pohlaví. Hodnoty P byly upraveny popsaným způsobem (22) na hodnoty FDR, aby se vzaly v úvahu pro vícenásobné srovnání, a metabolity s FDR<5% were="" considered="" significantly="" modulated.="" for="" log2fc="" calculation,="" missing="" values,="" if="" any,="" were="" replaced="" with="" the="" minimum="" observed="" value="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="" compound.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" normalized="" values="" were="" divided="" by="" the="" median="" value="" obtained="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="">

Společná analýza transkriptomu a metabolomu. Integrovaná analýza metabolických drah kombinující výsledky získané ze studií genové exprese a metabolomiky byla provedena pomocí modulu Joint Pathway Analysis na webových stránkách MetaboAnalyst 5.0 (24). Složený název metabolitů a oficiální genový symbol transkriptů významně více či méně hojných (FDR<0.05), along="" with="" their="" respective="" fcs="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice,="" were="" inputs.="" the="" integration="" was="" performed="" using="" kegg="" metabolic="" pathways="" with="" default="" settings(hypergeometric="" test="" for="" overrepresentation="" analysis,="" degree="" centrality="" for="" pathway="" topology="" analysis,="" and="" tight="" integration="" by="" combining="" queries).="" pathways="" with=""><0.1 were="" considered="" significantly="" affected="" in="" ckom="">

Barvení. Barvení globální struktury ledvin, usazenin šťavelanu vápenatého nebo neutrální depozice lipidů bylo provedeno na příčných řezech ledvin, které měly tloušťku 5 μm. S výjimkou neutrálního lipidového barvení byly myši anestetizovány a jejich levá ledvina byla před odběrem tkáně prokrvena břišní aortou 4% roztokem paraformaldehydu. Pro analýzu globální struktury ledvin byly plátky ledvin vložené do parafínu deparafinizovány, rehydratovány, obarveny H&E, dehydratovány a namontovány v ROTI Histokitt (Carl Roth GmbH). Neutrální lipidy byly obarveny v ledvinových plátcích vložených do sloučeniny OCT (Tissue-Tek) pomocí roztoku Oil Red O. Usazeniny šťavelanu vápenatého byly obarveny metodou popsanou Pizzolato (25). Stručně řečeno, plátky ledvin vložené do parafínu byly deparafinizovány a rehydratovány, pak ponořeny do roztoku 1: 1 dusičnanu stříbrného o koncentraci 5% w / v a peroxidu vodíku 30% a umístěny pod 60 W žárovku po dobu 30 minut. Skluzavky byly důkladně omyty v destilované vodě a potřísněny červenou barvou Nuclear Fast Red (MilliporeSigma), poté dehydratovány před montáží doROTI Histokitt. Podélné plátky ledvin z myši ošetřené dietou vyvolanou nefropatií šťavelanu vápenatého (1,5% vápníku + 1,5% hydroxyprolin smíchaný ve standardním chow po dobu 3 týdnů) sloužily jako pozitivní kontrola ledvinových usazenin šťavelanu vápenatého. Výsledky byly analyzovány pomocí skeneru Zeiss AxioScan.Z1 Slide Scanner při původním zvětšení 100× nebo 200×.

Testy ELISA a Trolox.4-HNE byly měřeny pomocí lipidové peroxidační (4-HNE)testovací sady od společnosti Abcam (ab238538). Celkové a neenzymatické antioxidační schopnosti byly hodnoceny testovací sadou Trolox od společnosti Abcam (ab65329).

Statistika. Všechny údaje jsou vyjádřeny jako střední ± SEM. Statistické testy a práh významnosti jsou popsány v legendách na obrázku nebo v příslušných oddílech Metody. Statistická analýza byla provedena pomocí balíčků R nebo softwaru GraphPad Prism verze 8.2.1. Všechny t-testy byly 2 ocasní.

Schválení studie. Všechny pokusy se zvířaty byly prováděny švýcarskými směrnicemi pro péči o zvířata, které jsou v souladu s pokyny Národního institutu pro péči o zvířata, a schváleny švýcarským kantonálem (Kanton de Vaud) a federálními veterinárními orgány (povolení 31827 pro DF) (Direction genérale de P'agriculture, de la viticulture et des affairs vetérinaires, Epalinges, Švýcarsko).

Předchozí publikace: Část této práce byla předložena jako abstrakt na výroční zasedání Americké nefrologické společnosti 2021 (4. listopadu 2021.https://www.asn-online.org/education/kidney-week/2021/program-abstract.aspx?controlId=3605774).