Kapitola 1: Krϋppelův faktor 15 potlačuje proliferaci glomerulárních mezangiálních buněk ledvin prostřednictvím posílení konjugace P53 SUMO1

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní

Mesangiální buňka (MC)proliferaceje klíčovým patologickým rysem u řady běžných lidíonemocnění ledvinvčetně mezangiální proliferativní nefritidy a diabetických nefropatií. Znalost reakcí MC na patologické podněty je zásadní pro pochopení těchto chorobných procesů. Dříve jsme určili, že Krüppelův faktor 15 (KLF15), transkripční faktor zinek-prst obohacený ledvinami, byl nutný pro inhibici proliferace MC. V této studii jsme zkoumali přímý cílový gen a základní mechanismus, kterým KLF15 reguloval mezangiální proliferaci. Nejprve jsme provedli screening malého modifikátoru 1 souvisejícího s ubikvitinem (SUMO1) jako přímého transkripčního cíle KLF15 a toto zjištění jsme potvrdili pomocí ChlP-PCR a luciferázových testů. Dále jsme prokázali, že nadměrná exprese KLF15 nebo SUMO1 zvýšila stabilitu P53, což blokovalo buněčný cyklus lidských ledvinových MC (HRMC), a proto zrušilo buněčnou proliferaci. Naopak, knockdown SUMO1 v HRMC, dokonce i těch, které jsou nadměrně exprimovány s KLF15, nemohl inhibovat rychlost proliferace HRMC a zvýšit SUMOylaci P53. Nakonec výsledky ukázaly, že hladiny SUMOylovaného P53 v ledvinových kortexech anti-Thy 1 modelových krys byly během období proliferace sníženy. Tato zjištění odhalují kritický mechanismus, kterým se KLF15 zaměřuje na SUMO1, aby zprostředkoval proliferaci MC.

KLÍČOVÁ SLOVA: KLF15, Proliferace mesangiálních buněk, P53, SUMO1

Kliknutím sem se seznámíte s výhodamicistanchea kde si můžete koupit cistanche tubulosa

1| ÚVOD

Mesangiální buňky (MC) tvoří přibližně jednu třetinu buněčné populace v glomerulu. Hrají důležitou roli v homeostáze tím, že udržují strukturní architekturu glomerulu, produkují a udržují mezangiální matrix, regulují povrch filtrace a fagocytují apoptotické buňky nebo imunitní komplexy.1 U mnoha glomerulárních onemocnění, jako je mezangiální proliferativní nefritida a diabetické nefropatie MC jsou zraněni a procházejí velkou změnou fenotypu, což vede k nekontrolované proliferaci mezangia a nadměrnému ukládání mezangiální matrix.2-4 Kromě hyperproliferace a zvýšení produkce proteinů extracelulární matrix (ECM) a matrixových metaloproteináz mohou MC také uvolnění zánětlivých faktorů, což vede ke glomerulární skleróze a intersticiální fibróze; dále zhoršují poškození ledvin a způsobují progresi do nevratného konečného stádia renálního onemocnění.5-Znalost reakce MC na patologické podněty je zásadní pro vývoj léčebných postupů ke snížení poškození ledvin způsobeného abnormální proliferací MC a oddálení progrese do konečného stádia onemocnění ledvin.

Krüppel-like faktory (KLF) jsou skupinou transkripčních faktorů vázajících DNA na zinkový prst. Stále více důkazů naznačuje, že se tato rodina podílí na různých buněčných procesech, jako je diferenciace buněk, remodelace srdce, krvetvorba a určování osudu kmenových buněk.8-10 Rodina KLF se skládá z osmnácti členů, mezi nimiž je široce rozšířený KLF15 vledvina, slinivka břišní, srdce,játraa kosterní svaly. Předchozí studie ukázaly, že KLF15 je klíčovým regulátorem transkripce v různých fyziologických procesech, včetně glukoneogeneze,imunitní reakcea diferenciace adipocytů.1-14 Naše předchozí studie prokázala, že KLF15 je nutný pro inhibici proliferace MC.15 Cílem této studie bylo objasnit přímý cílový gen a následný mechanismus, kterým KLF15 reguluje proliferaci mesangia.

2|MATERIÁLY A METODY

2.1|Model nefritidy Anti-Thy1

Samci krys Wistar (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) o hmotnosti mezi 200 a 220 g byli náhodně rozděleni do kontrolní skupiny a skupiny anti-Thy1. Všechny krysy byly umístěny v zařízení péče o zvířata v cyklu světlo/tma 12/12 hodin s volným přístupem k potravě a vodě. Během experimentu byla prováděna hodnocení a intervence související s welfare. Celkem 28 krysám byla injikována myší anti-Thy1 monoklonální protilátka, jak bylo popsáno dříve,16 a sedmi krysám byl injikován fyziologický roztok (kontroly). Glomeruly byly purifikovány z tkáně ledvinové kůry pomocí sítové metody. Séra byla odebírána pro měření hladin močovinového dusíku a kreatininu v séru. Krysí model Anti-Thy1 byl zabit ve dnech 0, 3, 5, 7 a 10 a byly odebrány jejich glomeruly. Všechny postupy týkající se pohody zvířat a experimentální postupy byly prováděny v přísném souladu s Příručkou pro péči a používání laboratorních zvířat (USA National Research Council, 1996).

2.2|Kultura a léčba lidské ledvinové MC (HRMC).

Primární renální HRMC byly zakoupeny od ScienCell (San Diego, CA). HRMC ze třetí až šesté pasáže byly udržovány v médiu MC (MsCM; ScienCell) podle pokynů výrobce. Pro experimenty byly buňky pěstovány do konfluence, růst byl zastaven v redukovaném séru (0.5 procent FBS) po dobu 24 hodin a rozděleny do různých experimentálních skupin.

Pro ošetření různými koncentracemi glukózy byly buňky inkubovány v MsCM obsahujícím buď 5 mmol/l glukózy (normální glukóza) nebo 30 mmol/l glukózy (vysoká glukóza, HG) po dobu 48 hodin při 37 °C. podmínky s 5 mmol/l glukózy a 25 mmol/l manitolu místo 30 mmol/l glukózy byly použity jako osmotické kontroly. Pro ošetření PDGF-BB byly buňky inkubovány v MsCM obsahujícím 20 ng/ml PDGF-BB (R&D Systems, Minneapolis, MN) po dobu 48 hodin při 37 °C.

2,3|Imunohistochemie (IHC)

Tkáň ledvin zalitá v parafínu byla nařezána na tloušťku 4 μm a řezy byly obarveny na IHC. Řezy byly inkubovány se 3 procenty H20, aby se zablokovala endogenní peroxidáza po deparafinizaci. Po vyhledání a zablokování antigenu byly řezy inkubovány s protilátkami anti-KLF15 (ab81604, Abcam), modifikátorem proti malému ubikvitinu 1 (SUMO1, ab32058, Abcam) a anti-PCNA (ab92552, Abcam) při 4 stupních C Řezy byly poté inkubovány se sekundární protilátkou značenou křenovou peroxidázou při 37 stupních po dobu 30 minut a imunohistochemická reakce byla pozorována podle pokynů výrobce s 3,3'-diaminobenzidinem (DAB, ORIGINE, CN) jako chromogenním činidlem. . Následně byla sklíčka kontrastně obarvena hematoxylinem-eosinem a zobrazena světelným mikroskopem (Olympus). Imunohistochemické barvení bylo hodnoceno pomocí softwaru Image J podle hodnoty průměrné optické hustoty (AOD).

2.4|Imunoprecipitace chromatinu (ChlP) s paralelním sekvenováním (ChIP-Seq)

ChIP byl proveden pomocí Simple ChlP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads; Cell Signaling Technology) podle protokolu výrobce. Stručně řečeno, HRMC byly nadměrně exprimovány buď KLF15 nebo scramble při buněčné hustotě 2.0×10³buňky/ml a zesíťovány 1,7% formaldehydem v PBS po dobu 5 minut při pokojové teplotě (RT ). Zesíťované buňky byly lyžovány, aby se získala jaderná frakce, která byla sonikována v 1x ChIP pufru. Lyzáty byly vyčeřeny centrifugací při 9300×g po dobu 10 minuty při 4 stupních. Vzorky chromatinu byly inkubovány buď s protilátkou anti-KLF15 (ab81604, Abcam) nebo protilátkou anti-lgG (kontrola pozadí) přes noc při 4 stupních. Komplexy navázané na protilátku byly zachyceny inkubací s magnetickými kuličkami proteinu G. Knihovny ChlP-Seq pro sekvenování byly připraveny pomocí TruSeq ChlP Sample Prep Kit (Illumina). Knihovny byly podrobeny paralelnímu sekvenování pomocí sekvenátoru HiSeq2500 (Illumina) s použitím protokolu délky 50 bp sekvenování s jedním koncem. Nezpracovaná data sekvenování nové generace (NGS) byla převedena do souborů FASTQ pomocí softwaru CASAVA (verze 1.8.2) a každý soubor dat byl porovnán s lidským referenčním genomem (UCSC hg19) pomocí Burrows-Wheeler Aligner (verze 0.7.12 ).17 Volání vrcholu ChIP-Seq bylo provedeno pomocí programu MACS2 (verze 2.0.1) s výchozími parametry, ale hodnotou aq 0,05, se vstupními daty pro odečítání.18 Porovnání vrcholu se zakódovanou kontrolou (rodičovské buňky) a vzorky nadměrné exprese byly provedeny pomocí Diffbind, balíčku R, s použitím algoritmu DeSeq2 a falešná míra objevení 0,1 byla považována za indikující významnost.1 Superenhancery byly identifikovány ze sady píku detekovaných v DMSO ošetřených HRMC pomocí superenhanceru. software ROSE.2 stupeň Vrcholy ChIP-Seq byly označeny balíčkem R ChlPpeakAnno a promotory byly definovány jako KLF15-obohacené oblasti do 1 kb od místa začátku transkripce.21 Gen s místem začátku transkripce nejblíže C vstup každého super-enhanceru byl definován jako cílový gen tohoto super-enhanceru.

2.5|ChIP-kvantitativní PCR v reálném čase (ChlP-PCR)

Postup ChlP-PCR byl podobný postupu popsanému výše. K detekci asociace mezi KLF15 a SUMO1 byla použita ChIP DNA z buněk ošetřených protilátkou anti-KLF15. DNA z buněk ošetřených anti-lgG protilátkou sloužila jako kontrola. Purifikovaná DNA byla použita pro analýzu oblasti proximálního promotoru SUMO1 pomocí PCR v reálném čase na ABI PRISM 7600 s použitím SYBR GreenER qPCR Supermix. Primery SUMO1 byly následující: vpřed: 5'-AGCAGCGGTCTTTAGCATCA-3';reverzní:5'-TCGGTTAACCAGCACCCTTG-3'. Relativní amplifikace promotorové sekvence genu byla vypočtena pomocí {{18 }} Metoda AcT a normalizace byla provedena proti ředění 1:100 vstupní DNA.

2.6|Značení buněk a značení stabilních izotopů pomocí aminokyselin v analýze buněčné kultury (SILAC)

Buňky při 15% konfluenci byly nasazeny do vhodného kompletního média (pro HRMC: MsCM). Postupy značení a SILAC byly popsány v předchozím výzkumu.22 Stručně řečeno, po označení lehkým (značeným 13C) nebo těžkým (značeným 15N) lysinem a lehkým (značeným 1c) nebo těžkým (značeným 15N) )argininu byly buňky transfekovány plazmidem s nadměrnou expresí KLF15 nebo kontrolním plazmidem. Po ošetření byly buňky trypsinizovány a spočítány, aby se získala buněčná peleta 2x1 0' buněk/stav, a buňky byly podrobeny analýze SILAC pomocí hmotnostní spektrometrie. Pelety těžkých a lehkých buněk byly lyžovány v radioimunoprecipitačním pufru s přídavkem inhibitorů proteázy a fosfatázy pomocí krátkých 15-sekundových sonikačních vzplanutí. Lyzáty byly centrifugovány při 14,000 otáčkách za minutu po dobu 20 minut. Po odstředění byly supernatanty shromážděny a koncentrace proteinu byla měřena pomocí Hitachi L-8900 analyzátoru aminokyselin. Ze vzorků byly připraveny alikvoty 200 ug proteinu, spojeny a vysráženy za použití srážecí metody methanol-chloroform. Proteinové pelety byly resuspendovány v pufru 8 mol/l močoviny/0,4 mol/l hydrogenuhličitanu amonného, ​​redukovány 45 mmol/l DTT po dobu 30 minut při 37 °C, alkylovány 100 mmol/l jodacetamidu po dobu 30 minut ve tmě při teplotě místnosti a štěpena Lys-C proteázou (1:20 w/w) přes noc (-16 hodin) při 37 stupních. Lys-C štěpení bylo dále zředěno a štěpeno trypsinem (1:20 w/w) po dobu 8 hodin při 37 stupních. Digest byl odsolen na koloně MacroSpin (The Nest Group, Inc) a vysušen v koncentrátoru SpeedVac. Odsolené peptidy byly poté obohaceny o fosfopeptidy za použití pryskyřice oxidu titaničitého zapuštěné do 10 μl špiček (Glygen Corp). Průtoky byly rezervovány a obohacené peptidy byly eluovány s použitím poměru hydroxidu amonného k vodě 1:33. Průtokové a eluční frakce vysušené SpeedVac byly resuspendovány v pufru A (0,1% kyselina mravenčí ve vodě) a podrobeny analýze kapalinovou chromatografií a tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC/MS).

2.7| Duální luciferázový reportérový test

Lidský promotor SUMO1 (NM_001005781) divokého typu s 1604 bp (-1474nt- plus 129nt) včetně potenciálního vazebného místa (-205nt--199nt) byl získán pomocí PCR amplifikovat a subklonovat do pGL3-základního vektoru (kat. č. E1751 Promega) s místy pro restrikční enzymy SacI a Bglll, pojmenované pGL3-WT-SU. Také vazebné místo-CACCCA-uvnitř promotoru SUMO1 bylo mutováno na -CGTTTG-, pojmenované pGL3-MT-SU. Plazmid (pReceiver-M94) obsahující lidskou KLF15 cDNA plné délky byl získán od GeneCopoeia. Plazmid nadměrné exprese KLF15 a pGL3-WT-SU nebo pGL3-MT-SU byly transfekovány do buněk HEK293T pomocí činidla Lipofectamine 2000. Vzorky byly poté kotransfekovány plazmidem pRL-TK (Kat č. E2241, Promega) exprimujícím luciferázu Renilla. Po 24 hodinách transfekce byly buňky lyžovány. Hladiny aktivity luciferázy světlušky a Renilla byly zkoumány pomocí duálního luciferázového reportérového testovacího systému (Biotek).

2.8 |Příprava RNA, syntéza cDNA a analýza RT-qPCR

Celková RNA byla extrahována pomocí TRlzol (Invitrogen) a purifikována pomocí RNeasy Mini Kit (Qiagen) podle pokynů výrobce. cDNA byla vytvořena pomocí soupravy pro syntézu prvního vlákna cDNA ProtoScript (New England Biolabs. Kvantitativní PCR byla provedena pomocí Power SYBR Green Master Mix (Life Technologies). Oligonukleotidové sekvence použité pro RT-qPCR jsou uvedeny v tabulce 1.

2.9|Test buněčné proliferace

Lidská cDNA SUMO1 plné délky (NM_003352.8) získaná od OriGene Technologies (Peking, Čína) byla vložena do pCMV6-Entry plasmidu (CAT#: RC200633). Buněčná proliferace byla analyzována pomocí Click-iT⑧ Plus EdU Alexa Fluor⑧555 Imaging Kit (Invitrogen) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, buňky byly inkubovány v 6-jamkové kultivační destičce a transfekovány kontrolním plazmidem KLF15 (Scramble, skupina VECTOR), plazmidem s nadměrnou expresí KLF15 (stejný výše, skupina KLF15), expresním vektorem pro SUMO1 (skupina VECTOR), plazmid s nadměrnou expresí SUMO1 (skupina SUMO1), negativní kontrolní siRNA (skupina SI CON), SUMO1 siRNA (skupina SI SUMO1), plazmid s nadměrnou expresí KLF15 se SUMO1 siRNA (skupina KLF15 plus SI SUMO1) nebo KLF15 overexpression plasmid s negativní kontrolou siRNA (skupina KLF15 plus SICON) po dobu 24 hodin. Poté bylo médium nahrazeno médiem doplněným 20 ng/ml PDGF-BB na 48 hodin a asi 12 hodin před stimulací PDGF-BB byla přidána optimalizovaná koncentrace EdU 10 μmol/l. Po ošetření byly buňky fixovány 4% formaldehydem, permeabilizovány 0,5% Tritonem X-100, promyty 3% BSA v PBS, inkubovány s Click-iT⑧ reakčním koktejlem po dobu 30 minut při teplotě místnosti a inkubovány s DAPIre-akční pufr po dobu 10 minut při teplotě místnosti, při ochraně před světlem. Buňky byly pozorovány fluorescenční mikroskopií (Olympus, Tokio, Japonsko). Jádra proliferujících buněk pak byla obarvena červeně.

2.10|Western blot analýza a imunoprecipitace (IP)

Buňky byly lyžovány pomocí pufru RIPA (Thermo Scientific) a celkový protein v supernatantech byl kvantifikován pomocí soupravy pro stanovení proteinů BCA (Thermo Scientific). Analýza Western blot a IP byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve. 23.24 Pro analýzu Western blot byly použity protilátka anti-KLF15 (AV32587, Merk), protilátka anti-SUMO1 (S8070, Merk) a anti - -aktin (A5316, Sigma). Pro IP analýzu byla použita protilátka anti-P53 (P5813, Merk).

2.11 |Bioinformatická analýza

Kandidáti z ChIP-Seq nebo SILAC vykazovali alespoň dvojnásobné obohacení oproti kontrolám. Analýza genové ontologie (GO) byla provedena pomocí databáze pro anotaci, vizualizaci a integrované zjišťování (DAVID; verze 6.7). P-hodnoty byly upraveny pro testování více hypotéz pomocí Benjamini-Hochbergovy metody. Výrazně obohacené kategorie ve funkční subontologii a KEGG drahách s upravenou P-hodnotou<.05 were="" chosen.="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa)="" of="" 52="" intersecting="" genes="" or="" proteins="" between="" chlp-seq="" and="" silac="" was="" performed="" on="" the="" qiagen="" ipa="" platform(https://digitalinsights.qiagen.com/),="" and="" the="" motifs="" in="" the="" target="" genes="" were="" analyzed="" using="" meme="" suite="" 5.3.0.="">

2.12|Statistická analýza

Všechny experimenty byly provedeny trojmo a výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± SE. Všechna data byla analyzována pomocí softwaru SPSS (ver.20.0; SPSS Inc) a porovnána pomocí Studentova t-testu nebo jednocestné ANOVA. P-hodnota<.05 was="" considered="" to="" reflect="" statistical="">