Kapitola 5 Změny v enzymatické aktivitě během fermentace enzymu

Kapitola 5 Změny v enzymatické aktivitě během fermentace enzymu

 

Proteáza, lipáza aSuperoxiddismutáza (SOD)jsou hlavní funkční enzymyZdravotní potraviny mikrobiálního enzymu. Mezi nimi,proteázahraje roli vpodpora hydrolýzy bílkovin v potravěv lidském těle. Kromě toho může také rozložit některé umírající buňky, odstranit nečistoty na povrchu a pórech kůže a hrát roli při exfoliaci, takže se široce používá v produktech vany. Lipáza působí na esterovou vazbu mezi mastnými kyselinami a glycerolem a hydrolýzou substrátu jsou obecně přírodní oleje. Proto je vidět v mnoha potravinách a zdraví na hubnutí. Mnoho žen je velmi znepokojeno tématem hubnutí, a proto se enzymy rychle staly populárními po celém světě.Enzymy jsou bohaté na lipázu, což znamená, že mají vysokou hodnotu výzkumu a vyhlídky na aplikace.DRNje speciální kovový enzym, který katalyzuje reakci na demitaciSuperoxidové aniontové radikály, takOdstranění superoxidových aniontových radikálův těle. Je to ochranná bariéra pro organismy, takže se široce používá v lékařské oblasti.
Tato kapitola bere jako příklad Apple Enzyme. Počínaje počátečním stádiem fermentaceaktivity superoxiddismutázy, amyláza, lipáza, proteáza a celuláza v experimentální skupině a kontrolní skupina byla měřena každých 15 dní, aby se komplexně a systematicky odrážela měnící se trend aktivity enzymu během celého procesu fermentace.

Nové byliny cistanche

Kliknutím získáte další podrobnosti

 

Podpůrná služba Wecistanche-největšího vývozce Cistanche v Číně:
E -mail: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 Materiály a metody

5.1.1 Materiály

(1) Experimentální materiály

Umyjte čerstvá jablka sterilní vodou za sterilních podmínek, přirozeně je vysušte na sterilním operačním stole, loupá je a nakrájejte je pro pozdější použití. Přidejte bílý cukr a jablka do sterilizované skleněné nádoby při hmotnostním poměru 1: 1. Aktivujte bakterie potřebné pro experiment a naočoute je do enzymu podle optimálního schématu (tento operační krok je vynechán pro kontrolní skupinu), utěsněte je a umístěte na chladné a suché místo. Po 3 měsících fermentace teploty místnosti si vezměte vzorek a získejte celou enzymovou kapalinu obsahující buničinu a filtrujte ji. Vezměte supernatant jako experimentální vzorek. Poté, co je vzorek odstředěn na 10, 000 RPM po dobu 15 minut ve vysokorychlostní odstředivce se používá k měření příslušných údajů. Stojí za zmínku, že v procesu výroby enzymů, aby se zabránilo zbytečné kontaminaci, byly všechny naše operace prováděny za sterilních podmínek.

(2) Hlavní nástroje
Nástroje potřebné pro experiment jsou stejné jako 3.1.1 (2).

 

5.1.2 Metody

(1) Stanovení aktivity superoxiddismutázy (SOD) [66]
Roztok pyrogallolu byl po určitou dobu předehřát ve 25 stupňové konstantní teplotě. Podle tabulky 5.1 bylo do zkumavky přidáno vhodné množství pufru, destilované vody a stejného objemu kyseliny chlorovodíkové kyseliny nebo roztoku pyrogallolu. Konstantní teplotní vodní lázeň byla nastavena na 25 stupňů po dobu 2 0 min. Poté, co byla smíšená kapalina rychle otřesena, byla okamžitě vstříknuta do kyvety. Hodnota absorbance A0 vzorku byla měřena každých 30 sekund při vlnové délce 325nm pomocí spektrofotometru.

Tab.5.1 Přidejte množství sousedního benzenu tři fenolové činidlo pro stanovení rychlosti autoxidace

 

Metoda pro stanovení aktivity SOD je v podstatě stejná jako výše uvedená operace. Jediný rozdíl je v tom, že před přidáním Pyrogallol {{0}}. 5 ml enzymu vzorového roztoku různých koncentrací je třeba přidat jako první. Současně se přidá stejný objem destilované vody. Měřená absorbance je ASOD. Aktivita inhibice a enzymatická aktivita SOD se počítá podle vzorce 5.1 a vzorce 5.2: rychlost inhibice (%)=(△ a 0- △ asod)/△ A 0 × 100 (5.1) Enzyme Activity (U/Ml) V1/V2 × N (5.2) Kde: V1 je celkový objem roztoku, ML; V2 je objem roztoku enzymu, ML; △ A0 je rychlost autooxidace pyrogallolu; △ ASOD je rychlost změny hodnoty absorbance vzorku; n je ředění více (2) stanovení aktivity amylázy Tato studie použila ke stanovení aktivity amylázy kolorimetrickou metodu jódového škrobu. Specifické kroky provozu se vztahují na „Národní postup klinické laboratoře“ [67]. Je to hlavně rozděleno do následujících dvou bodů:

 

① Příprava řešení
Buffered starch solution ({{0}}.4g/L): Accurately weigh 9g of sodium chloride, 22.6g of anhydrous disodium hydrogen phosphate, and 12.5g of anhydrous potassium dihydrogen phosphate, dissolve them in 500mL of distilled water, and heat Dokud se roztok vaří; Přesně vážte 0,4 g rozpustného škrobu, rozpusťte jej v 10 ml destilované vody, rovnoměrně promíchejte a přizpůsobte se na pastu; Vložte roztok škrobu nastaveného na pasta do výše uvedeného roztoku varu a kádinka opakovaně omyjte, dokud se škrob zcela přenese do roztoku vroucí vody. Po rovnoměrném míchání skleněnou tyčkou, ochlazením na teplotu místnosti, přidejte 5 ml 37% roztoku formaldehydu vlasů a zředí se na 1L destilovanou vodou. Hodnota pH roztoku je 7,0 ± 0,1 a je umístěna do chladničky pro použití.
Jodní zásobní roztok (0. 1 mol/l): Přesně vážte 1,7835 g joodate a 22,5 g draselný jodid v čistém 500 ml
Beaker, pomalu a rovnoměrně přidává 4,5 ml koncentrovanou kyselinu chlorovodíkovou za stálého míchání během procesu přidání, zředí se do stupnice destilovanou vodou a rovnoměrně promíchejte. Vložte ji do chladničky pro použití a uložte ji do hnědé láhve činidla.
Idoninové aplikační řešení ({{0}}. 01mol/L): Vezměte určité množství zásobního roztoku jódu (0,1 mol/l), zřeďte jej 10krát destilovanou vodou, vložte jej do chladničky pro použití a uložte jej až 1 měsíc.

② Kroky experimentálního provozu
Vezměte enzymový roztok a zřeďte jej 10krát fyziologickým fyziologickým roztokem a pracují podle tabulky 5.2. Dobře promíchejte, vlnová délka spektrofotometru je 660 nm a světelná cesta kolorimetrického šálku je 10 mm. Nula s destilovanou vodou a přečtěte si absorbance každé trubice. Vypočítejte aktivitu amylázy na základě základního výpočtového vzorce 5.3.

 

Tab.5.2 Provozní kroky stanovení amylázy

 

(3) Stanovení aktivity lipázy

Metoda stanovení byla provedena v souladu s QB/T {{0}} [68]. 2% enzymový testovací roztok byl připraven pomocí 0 0 25 mol/l fosfátového pufru (pH 7,5), fenolftalein byl použit jako indikátor a mastné kyseliny byly titrovány standardním roztokem hydroxidu sodíku. Aktivita lipázy byla vypočtena na základě objemu hydroxidu sodného spotřebovaného v experimentu. Pravidlo je: při pH 7,5 a okolní teplotě 40 stupňů, 1 ml roztoku kapalného enzymu hydrolyzuje lipázu po dobu 1 minuty za vzniku 1 μmol mastné kyseliny, což je jedna jednotka aktivity lipázy, vyjádřená jako U/ml. Poté byla aktivita lipázy vypočtena podle vzorce 5.4: Enzymatická aktivita (U/ML)=(BA) × C/0,05 × 50 × 1/15 × N=200/3 × (BA) × C × N (5,4), kde: B je hlasitost hydroxidu sodíku, Ml; A je objem standardního roztoku hydroxidu sodného spotřebovaného ve skupině s kontrolou prázdné, ML; C je koncentrace standardního roztoku hydroxidu sodného, ​​mol/l; 0,05 je konverzní faktor koncentrace standardního roztoku hydroxidu sodného; 50 je obsah mastné kyseliny v roztoku hydroxidu sodného; 15 minut je reakční doba; n je ředění více.

(4) Stanovení proteázové aktivity

Viz GB/T 23527-2009 [69] s mírnými úpravami.
① Příprava standardní křivky
Vezměte 1 ml standardního roztoku tyrosinu s různými hmotnostními koncentracemi, které jsou 0, 1 0, 20, 30, 40 a 50 mg/l, a přidejte 5 ml 0,4mol/l roztoku uhličitanu sodného a 1 ml reagenčního roztoku. Reagujte po dobu 20 minut při teplotě 40 stupňů. Po dokončení reakce odstraňte reakční roztok a změřte hodnotu absorbance roztoku při vlnové délce 680 nm pomocí spektrofotometru. Nakreslete standardní křivku tyrosinu s koncentrací tyrosinu jako horizontální ose a hodnotu absorbance jako svislé ose.

Nové byliny cistanche se silnou antioxidační silou

② Stanovení proteázové aktivity
Experimentální skupina: Vezměte 1 ml roztoku kaseinu s koncentrací 10 g/l a rovnoměrně ji smíchejte s 1 ml vzorku, který má být testován, a reagujte po dobu 10 minut při okolní teplotě 40 stupňů; Filtrujte a získejte filtrát po postavení, vezměte 1 ml filtrátu, 5 ml roztoku uhličitanu sodného a 1 ml folinového činidla, rovnoměrně promíchejte a reagujte po dobu 20 minut při okolní teplotě 40 stupňů; Pomocí spektrofotometru změřte hodnotu absorbance roztoku při vlnové délce 680 nm.
Blank Control Group: Vezměte 1 ml roztoku vzorku, který má být testován, přidejte kyselinu trichloroctovou, plně reaguje na inaktivaci proteázy a další provozní metody jsou stejné jako experimentální skupina.

Vypočítejte proteázovou aktivitu podle vzorce 5.5:
Proteasová aktivita (u/ml)=AK × 4/10 (5.5), kde: A je absorbance enzymového roztoku v experimentální skupině; K je množství tyrosinu, když se absorbance rovná 1; 4 je celkový objem reakčního roztoku, ML; 10 je reakční doba, min.

(5) Stanovení aktivity celulázy [70]

Aktivita celulázy v enzymech je obecně exprimována množstvím glukózy uvolňovaného určitým množstvím enzymového roztoku za jednotku času. Princip používání metody filtračního papíru k měření aktivity celulázy je to, že celuláza může rozkládat celulózu ve filtračním papíru za vzniku sekundárních metabolitů, jako je glukóza, a glukóza mohou reagovat pomocí 3, 5- dinitrosalicylové kyseliny za vzniku žlutého komplexu. Barva této reakce je relativně jasná, což může dobře určit množství produkovaných glukózy a dalších redukujících cukrů.

 

①3, 5- dinitrosalicylová kyselina kolorimetrická látka
Přesně vážte 1 0 g 3, 5- dinitrosalicylová kyselina s bodem tání 168-169 stupeň, rozpusťte ji destilovanou vodou, přidává 20 g hydroxidu sodného a 200 g tartasů, přidává 500 ml, přidává 500 ml, což je 500 ml, přidává 500 ml, což je 500 ml. Fenol a 0,5 g bezvodého siřičitého sodného, ​​promíchejte nepřetržitě během procesu přidání, dokud se zcela nerozpustí, zastavte se po rovnoměrném smíchání, chlazení na teplotu místnosti, přeneste vše na 1000 ml objemné baňky, zředí se do značky s destilovanou vodou po dobu jednoho týdne, filtrujte, získejte supernatant a skladujte a do skladu do hnědé láhve.②enzymatická hydrolýza
Přesně Pipette {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1,5, 2,0ml vzorku enzymu do 2ml roztoku octaně a kyseliny a octanu octanu s hodnotou pH 4,5. Po 5 minutách konstantní teplotní vodní lázeň při 40 stupních přidejte 6 kusů chromatografického filtračního papíru s plochou 1 x 1cm2 a okamžitě začněte načasování, aby byla reakční doba přesná na 60 minut. Okamžitě přeneste do vařící vodní lázeň pro reakci po dobu 10 minut a celuláza ztrácí svou aktivitu.

 

 

③ barevná reakce
Vezměte roztok vzorku enzymu, přidejte 3 ml 3, 5- dinitrosalicylovou kyselinu kolorimetrický činidlo připravené v ①, teplo ve vroucí vodní lázně po dobu 15 minut, vychladnout na pokojovou teplotu, přidat 10ml destilované vody, vyrovnat rovnoměrné, používat spektrofotometr při vlnové délce 550nm, upravujte prázdnou kontrolní skupinu a měří hodnotu a měří hodnotu a měřit absorbování.
④ Kreslení standardní křivky glukózy
Připravte standardní roztok glukózy s koncentrací 1 mg/ml přesně a použijte destilovanou vodu k vytvoření standardního roztoku glukózy s objemem 0, 0. 2, {}}. 4, 0. 6, 0. 3ML 3, 5- Dinitrosalicylové kyseliny kolorimetrické látky připravené v ① pro provádění reakce na vývoj barev. Vynese standardní křivku koncentraci glukózy jako horizontální ose a absorbance jako svislá osa.
⑤Calkulace
Použijte hodnotu absorbance A po vývoji barvy s roztokem enzymu a poté vypočítejte množství uvolňování glukózy M podle standardní křivky glukózy a vypočítejte podle vzorce 5.6:
Aktivita celulázy (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) Kde: m je množství uvolňování glukózy, ug; T je enzymatická doba hydrolýzy, min; M je enzymový obsah v reakci, UG/ML.