CaWRKY30 pozitivně reguluje imunitu pepře zacílením CaWRKY40 proti Ralstonia Solanacearum očkování prostřednictvím modulace genů souvisejících s obranou, část 2

2.5. CaWRKY30 Přechodná nadměrná exprese stimulovaná HR podobná buněčná smrt, produkce H2O2 a transkripční upregulace markerových genů souvisejících s imunitou

Experimenty VIGS ukázaly, že CaWRKY30 pozitivně reguluje imunitu pepře vůči RSI. Experimenty s přechodnou nadměrnou expresí byly prováděny infiltrací buněk GV3101 nesoucích 35S:00 (EV) nebo 35S: CaWRKY30 do listů pepře pro další ověření této spekulace. Studovali jsme roli přechodné nadměrné exprese CaWRKY30 na indukci buněčné smrti podobné HR a akumulaci H2O2 v rostlinách pepře. Exprese CaWRKY30 v rostlinách pepře byla stanovena experimenty western blotting (obrázek 5A).

Buněčná smrt podobná HR a akumulace H2O2 byly potvrzeny barvením trypanovou modří a DAB. Výsledky ukázaly, že přechodná nadměrná exprese CaWRKY30 způsobila HR podobnou buněčnou smrt a akumulaci H2O2 v listech pepře, projevující se tmavším barvením trypanovou modří a tmavě hnědým barvením DAB (obrázek 5B). Vodivost byla provedena ke studiu intenzity buněčné nekrózy způsobené přechodnou nadměrnou expresí CaWRKY30 a výsledky ukázaly, že listy pepře přechodně nadměrně exprimující CaWRKY30 vykazovaly větší únik iontů po 24 a 48 hodinách po Agro-infiltraci ve srovnání s listy papriky nadměrně. exprimující prázdný vektor (obrázek 5C). Relativní úrovně exprese transkripce markerových genů spojených s obranou, jako je CaPR1 související s biosyntézou ET, CaNPR1 související s SA, CaABR1 citlivý na ABA a markerový gen CaHIR1 spojený s HR, byly detekovány analýzou qRT-PCR.

Naše výsledky ukázaly, že přechodná nadměrná exprese CaWRKY30 v pepřových listech výrazně zesílila transkripční akumulaci CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 a CaHIR1 v pepři ve srovnání s přechodně nadměrnou expresí prázdných vektorových rostlin pepře při 48 dpi (obrázek 5D). Tyto výsledky ukazují, že CaWRKY30 působí jako pozitivní regulátor buněčné smrti rostlin podobných HR, produkce H2O2 a transkripční upregulace markerových genů souvisejících s imunitou.

Obrázek 5. Přechodná nadměrná exprese CaWRKY30 indukovaná HR-podobná buněčná smrt, akumulace H2O2 a exprese markerových genů spojených s imunitou v listech pepře. Úspěšná nadměrná exprese CaWRKY30-Flag byla potvrzena experimentem western blotting (A), HR podobná buněčná smrt spuštěná přechodnou nadměrnou expresí 35S: CaWRKY30, potvrzená detekcí fenotypu, expozicí pod UV světlem a Barvení DAB a trypanové modři při 48 hpi, v daném pořadí; Měřítko=50 µm (B), Měření úniku elektrolytu (iontová vodivost) k odhadu odezvy buněčné smrti v terčích listů pepře po 24 a 48 hodinách po agroinfiltraci, respektive (C), test qRT-PCR na zkontrolujte hladiny exprese transkripce markerových genů spojených s imunitou, včetně CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 a CaHIR1 v 35S: CaWRKY30 exprimoval listy pepře při 48 dpi, v tomto pořadí (D). Relativní úroveň exprese známých markerových genů souvisejících s obranou v listech pepře přechodně nadměrně exprimujících prázdný vektor byla nastavena na "1". Data představující průměr ± SE ze čtyř biologických replikátů. Chybové úsečky jsou standardní chyby průměru. Různá písmena nad pruhy označují významné rozdíly mezi průměry.

2.6. Vzájemný vztah mezi CaWRKY30 a CaWRKY40

Uvádí se, že různé WRKY TF tvoří sítě dohromady a dříve jsme uvedli, že různí členové WRKY TF, tj. CaWRKY6, CaWRKY22 a CaWRKY40, jsou vzájemně výrazově a funkčně spojeni. Proto předpokládáme, že CaWRKY30 by se mohl týkat jiných členů rodiny WRKY, včetně CaWRKY40, což je pozitivní regulátor imunity pepře proti RSI. Analýza qRT-PCR byla provedena pro další zkoumání možné zpětnovazební regulace CaWRKY40 pomocí CaWRKY30 a pro studium potenciální modulace CaWRKY30 pomocí testu přechodné nadměrné exprese CaWRKY40 nebo umlčení CaWRKY40 pomocí VIGS.

CaWRKY40 je transkripční faktor WRKY zapojený do reakcí rostlin na různé biotické a abiotické stresy. Studie ukázaly, že CaWRKY40 je indukován v rajčatech a může zvýšit odolnost rostlin při ošetření suchem a nízkými teplotami. Kromě toho studie také zjistila, že nadměrná exprese CaWRKY40 může zlepšit odolnost rajčat vůči suchu a zmírnit inhibici růstu způsobenou stresem ze soli, ale odolnost vůči patogenům vyžaduje další studium. Proto CaWRKY40 hraje důležitou roli v imunitní odpovědi rostlin a má určitý potenciál pro zvýšení zemědělského výnosu. Zároveň je potřeba dbát i na naši imunitu. Imunita našeho těla je velmi důležitá. Cistanche má významný vliv na zlepšení imunity. Cistanche je bohatá na různé antioxidační látky, jako je vitamín C, vitamín C, karotenoidy atd. Tyto složky dokážou vychytávat volné radikály, snižovat oxidační stres a zlepšovat odolnost imunitního systému.

Klikněte na doplněk cistanche deserticola

Naše výsledky vyjádřily transkripční hladiny CaWRKY30 v listech pepře přechodně nadměrně exprimující CaWRKY40 se zvýšily na 24 a 48 hp ve srovnání s rostlinami přechodně nadměrně exprimujícími prázdný vektor (EV) (obrázek 6A), zatímco transkripční hladiny CaWRKY40 se u těchto rostlin přechodně zvýšily nadměrně exprimující CaWRKY30 ve srovnání s rostlinami přechodně nadměrně exprimujícími EV (obrázek 6B). Naše výsledky naopak ukázaly, že transkripční akumulace CaWRKY40 byla výrazně snížena u rostlin CaWRKY30- infikovaných Ralstonií ve srovnání s rostlinami bez umlčení (obrázek 6C). Kromě toho byla transkripční akumulace známých markerových genů spojených s imunitou, např. CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 a CaHIR1 zcela nebo částečně potlačena v rostlinách umlčených CaWRKY30, které byly spuštěny CaWRK40 (obrázek 6D).

Tato data naznačují transkripční regulaci CaWRKY40 pomocí CaWRKY30 a přítomnost pozitivní regulační smyčky zahrnující CaWRKY30 a CaWRKY40.

Obrázek 6. Vzájemný vztah mezi CaWRKY30 a CaWRKY40. Transkripční výraz lev. els CaWRKY40 v listech papriky přechodně nadměrně exprimují CaWRKY30 v časovém intervalu 24 a 48 dpi (A), úrovně transkripční exprese CaWRKY30 v listech papriky přechodně nadměrně exprimují CaWRKY40 v časovém intervalu 24 a 48 dpi (B), gRT-PCR analýza hladin transkripční exprese CaWRKY40 v CaWRKY30-umlčených a neumlčených rostlinách pepře při 48 dpi (C)gRT-PCR test transkripčních hladin markerových genů spojených s obranou v CaWRKY{21}}umlčených a netlumené rostliny pepře přechodně nadměrně exprimující 35S: CaWRKY40-HA a 35S:00při 48 hpi (D). Data průměr plus SE ze čtyř biologických replikátů. Chybové úsečky jsou standardní chyby průměru. Různá písmena nad pruhy ukazují významné rozdíly mezi prostředky.

2.7. Vzájemný vztah mezi CaWRY30 a CaWRKY6, CaWRKY22 a CaWRKY27

V našich předchozích studiích bylo zjištěno, že CaWRKY40 je expresně a funkčně asociován s různými WRKY TF, jako jsou CaWRKY6 a CaWRKY22. Vztah mezi CaWRKY30 a CaWRKY40 ukazuje, že CaWRKY30 je možná spojen s různými WRKY TF, které se podílejí na imunitě pepře proti RSI. Pro potvrzení tohoto předpokladu byla provedena analýza RT-PCR za účelem studia vztahu mezi CaWRKY30 a různými WRKY TF, o kterých bylo dříve hlášeno, že se podílejí na imunitě pepře proti RSI, včetně CaWRKY6, CaWRKY22 a CaWRKY27. Naše výsledky ukázaly, že transkripční akumulace CaWRKY30 byla zesílena u rostlin CaWRKY6, CaWRKY22 a CaWRKY27 přechodně nadměrně exprimujících pepřové rostliny při 48 dpi (obrázek 7A), zatímco transkripční akumulace CaWRKY6, CaWRKY22 a CaWRKY27 byla přechodně zvýšena také v listech papriky. CaWRKY30 při 48 dpi (obrázek 7B). Naše výsledky testu qRT-PCR naznačují, že CaWRKY30 a CaWRKY6, CaWRKY22 a CaWRKY27 jsou vzájemně výrazově a funkčně propojeny.

3. Diskuse

Protein WRKY je jednou z největších rodin rostlinných transkripčních faktorů (TF). Je známo, že skupina členů rodiny WRKY TF, hlášená z Arabidopsis thaliana a Oryza sativa, se účastní a hraje klíčovou roli v regulaci imunity rostlin. Byly hlášeny značné funkční variace mezi úzce strukturními homology WRKY [17,48] a funkce WRKY TF v imunitě nemodelových rostlin, jako je pepř, nejsou dostatečně prozkoumány.

V současné studii byl funkčně charakterizován CaWRKY30, gen skupiny Ill WRKY. Výsledky naznačují, že CaWRKY30 pozitivně reguluje imunitu pepře proti RSl a je zásadní složkou sítě WRKY zahrnující CaWRKY6, CaWRKY22CaWRKY27 a CaWRKY40. Zapletení CaWRKY30 do imunity pepře je podporováno cis-elementy reagujícími na patogeny, včetně prvku TGA, TGACG-motivIATC-boxu, TATA-boxu a W-boxu přítomných v promotorové oblasti CaWRKY30. Tento předpoklad byl v souladu s upregulací transkripčních hladin CaWRKY30 po a po exogenně dodávaném ETH, ABA a SA [49,50].

Protože je často známo, že geny spouštěné vystavením určitému stresovému faktoru se podílejí na reakci na tento stres [51], spekulovali jsme, že CaWRKY30 by mohl pozitivně regulovat imunitu pepře vůči RSI. Tato spekulace byla podpořena údaji o umlčení CaWRKY30 pomocí VIGS a testem přechodné nadměrné exprese CaWRKY30. Tato omezená imunita v důsledku ztráty funkce CaWRKY30 byla doprovázena zesíleným růstem RSI a downregulací markerových genů souvisejících s imunitou, jako je SA-dependentní CaPR1 (52CaNPR1 [53], CaDEF1 související s JA (54], CaABR1 související s ABA [55) ] a HR-asociovaný CaHIR1 (561. Na druhé straně HR-podobná buněčná smrt a HO, sekrece byly spuštěny přechodnou nadměrnou expresí CaWRKY30 doprovázenou transkripční upregulací markerových genů souvisejících s imunitou, jako je CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 a CaHIR1. To naznačuje roli CaWRKY30 jako pozitivního regulátoru buněčné smrti podobné HR a imunity pepře proti RSI. Podobně bylo v předchozích studiích pozorováno, že AtWRKY30, homolog CaWRKY30 u Arabidopsis, pozitivně reguluje imaginaci rostlin. -munitv proti biotickým a abiotickým stresům 157 581. To lze naznačit, že CaWRKY30 je upregulován po infekci Ralstonia, což vede ke snížené zranitelnosti pepře vůči infekci bakteriálním patogenem.

Fytohormony jako ET, ABA a SA jsou základní signální molekuly, které se podílejí na reakci rostlin na útoky patogenů a vysokoteplotní stres. Ty se také podílejí na přeslechů mezi reakcemi rostlin na biotické a abiotické stresy [59]. SA podněcuje rezistenci proti biotrofním patogenům, zatímco ET hraje zásadní roli v imunitě rostlin proti nekrotrofním patogenům [60]. Obecně je syntéza SA, ET a JA spojena s imunitou spouštěnou PAMP (PTI) nebo s imunitou spouštěnou efektorem (ETI). Tyto fytohormony mohou hrát svou roli jak synergicky, tak antagonisticky na základě jejich koncentrací během obranné signalizace [61]. Synergická asociace mezi těmito třemi signálními prvky byla detekována u PTI, zatímco kompenzační asociace byla detekována u ETI [62]. CaWRKY30 byl neustále indukován exogenně dodávanými fytohormony. Známé markerové geny související s imunitou závislé na SA, ET a ABA, jako je CaPR1, CaNPR1, CaDEF1 a CaABR1, byly downregulovány umlčením CaWRK30; byly však upregulovány přechodnou nadměrnou expresí CaWRKY30 v rostlinách pepře, což ukazuje, že CaWRKY30 se účastní synergicky zprostředkované obranné signalizace SA, ET a ABA, což vede k PTI.

Analýza celého genomu ukázala zapojení několika WRKY TF do imunity rostlin [63–65]. Studiemi funkční genomiky, WRKY1 [66], -11 [67], -17 [67], -18 [68], -22 [69], {{13} } [70], -28 [71], -33 [72], -38 [73], -40 [68], -45 [74], -46 [75], -53 [76], -54 [75], -60 [68], -62 [77], -70 [75] a -75 [78] byly funkčně charakterizovány v imunitě Arabidopsis, regulují imunitu pozitivně nebo negativně. Tyto WRKY TF byly navrženy tak, aby se uspořádaly do WRKY transkripční sítě, obsahující kladné a záporné zpětnovazební smyčky a dopředné moduly [12]. Konfigurace těchto sítí WRKY však zůstává špatně pochopena.

V dřívějších studiích jsme zjistili, že CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 a CaWRKY40 jsou pozitivní regulátory imunity pepře vůči RSI [9,44,45], zatímco CaWRKY58 je negativní regulátor [46]. Současná studie vyvozuje, že CaWRKY30 působí jako pozitivní regulátor při HR podobné buněčné smrti pepře a odpovědi pepře na infekci R. solanacearum. Hladiny transkripční exprese CaWRKY30 byly upregulovány po přechodné nadměrné expresi CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 a CaWRKY40. Naopak, přechodná nadměrná exprese CaWRKY30 upregulovala transkripční akumulaci CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 a CaWRKY40, což naznačuje přítomnost sítí WRKY TFs a kladné zpětnovazební smyčky mezi CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY40 a CaWRKY. Předpokládá se, že na imunitě rostlin se podílejí podobné kladné zpětnovazební smyčky [47]. Stejný druh kladné zpětné vazby byl přítomen mezi CaWRKY40 a CaWRKY6, CaWRKY40 a CabZIP63, CaWRKY40 a CaCDPK15. V předchozích studiích bylo také zjištěno, že CaWRKY6 [44] a CabZIP63 [16] se přímo a transkripčně účastní regulace exprese CaWRKY40 proti RSI. S ohledem na tyto výsledky lze navrhnout, že CaWRKY40 by mohl být koordinován různými TF. Závěrem lze říci, že exprese CaWRKY40 je koregulována CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY30 a CabZIP63 po RSI a exprese CaWRKY40 je regulována CaWRKY6 a CabZIP63, ale ne CaWRKY30 v pepři po vystavení vysoké teplotě.

4. Materiály a metody

4.1. Rostlinné materiály a podmínky růstu

Semena kultivaru pepře 'Mexi' a Nicotiana benthamiana byla získána z Ayub Agriculture Research Institute, Faisalabad, Pákistán. Semena pepře a N. benthamiana byla zasazena do plastových květináčů se směsí půdy [rašelina a perlit; 2/1 (v/v)] a uchovávají se v pěstební místnosti za kontrolovaných podmínek, tj. teplota 25 ◦C, intenzita světla 60–70 µmol fotonů m−2 s −1 a relativní vlhkost 70 procent při 16 hodinách světla/8 h tmavá fotoperioda.

4.2. Generování vektorů

Ke generování vektorů byla použita technika klonování brány. Pro konstrukci satelitních vektorů byl CaWRKY30 ORF plné délky (s terminálním kodonem nebo bez terminálního kodonu) klonován do vstupního vektoru pDONR207 pomocí BP reakce. Poté byl tento konstrukt přenesen do destinačních vektorů pMDC83, CD3687 (HA-tag), CD3688 (Flag-tag) a Pk7WG2 provedením LR reakce pro vytvoření vektorů pro subcelulární lokalizaci a nadměrnou expresi.

Pro konstrukci vektorů pro VIGS byl vybrán 364 bps fragment v 30 -nepřekládané oblasti (UTR) CaWRKY30 a specificita byla potvrzena pomocí BLAST proti sekvenci genomu v databázi CM334 (http://peppergenome.snu. ac.kr/ (vstup 29. října 2021)) a Zunla-1 (http://peppersequence.genomics.cn/page/species/blast. jsp (vstup 29. října 2021)). Dále byla provedena BP reakce pro klonování tohoto fragmentu do pDONR207/201 poté, co byl tento konstrukt přenesen do vektoru PYL279 provedením LR reakce.

4.3. Růst patogenu a postupy očkování

Izolovali jsme kompatibilní virulentní kmen R. solanacearum z rostlin pepře infikovaných Ralstonia z Dera Ghazi Khan, Pákistán. Tetrazoliumchloridová metoda byla použita k čištění exsudátů nadzemních částí cévní tkáně rostlin infikovaných patogenem [9,45]. Izolovaný R. solanacearum byl kultivován v médiu SPA v termoregulační třepačce (200 g brambor, 20 g sacharózy, 3 g hovězího extraktu, 5 g tryptonu a 1 l dvakrát destilované H2O) při 200 otáčkách za minutu a 28 ◦C pro přes noc. Dále byl kultivovaný kmen R. solanacearum centrifugován při 6500 pm a 28 °C po dobu 10 minut. Kapalný supernatant po centrifugaci byl vylit a pelety na dně centrifugační zkumavky byly zředěny ve sterilizovaném 10 mM roztoku MgCl2. Hustota bakteriálních buněk byla upravena na 108 cfu ml-1 (OD600=0.8).

Pro studium účinků RSI na transkripční hladiny CaWRKY30 a na odolnost rostlin pepře vůči napadení R. solanacearum byl horní třetí list rostlin pepře infiltrován 10 ul roztoku R. solanacearum injekční stříkačkou bez jehly. Vzorky listů ošetřených patogenem byly sklizeny ve specifických časových bodech pro experimenty s histochemickým barvením (např. barvení DAB nebo barvení trypanovou modří), elektrickou vodivostí, cfu a extrakci RNA pro více experimentů. Pro fenotypový experiment CaWRKY30-umlčených a neumlčených rostlin byly kořeny poraněny pomocí skleněné tyčinky a infiltrovány kompatibilním virulentním R. solanacearum. Rostliny byly udržovány v růstové komoře za kontrolních podmínek při teplotě 28 ± 2 ◦C, intenzitě světla 60–70 µmol fotonů m–2 s −1, 70procentní relativní vlhkosti a pod 16-světlem/{{12 }}h tmavá fotoperioda po inokulaci R. solanacearum. Obrázky fenotypu byly pořízeny po RSI ve specifických časových intervalech.

4.4. Aplikace fytohormonů na list

Pro studium účinků fytohormonů byly zdravé rostliny pepře postříkány 100 uM ETH, 100 uM ABA a 1 mM SA ve stádiích čtyř listů. Falešné (kontrolní) rostliny byly ošetřeny sterilní ddH20. Vzorky ošetřené fytohormony byly odebrány v požadovaných časových bodech pro extrakci RNA a další studium.

4.5. Vyšetření subcelulární lokalizace CaWRKY30

Buňky Agrobacterium mající 35S: CaWRKY30-GFP nebo 35S:GFP (kontrola) byly kultivovány přes noc v LB médiu obsahujícím odpovídající antibiotika. Kultivační médium bylo odstředěno při 6500 ot./min., kapalný supernatant byl vylit a peleta na dně byla zředěna v indukčním médiu (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5,7 a 150 uM acetosyringonu) a nastavena na OD{{ 10}}.8. Agrobacterium obsahující 35S: CaWRKY30-GFP a 35S:GFP byly injikovány do listů N. benthamiana pomocí injekční stříkačky bez jehly. Výše popsaná metoda byla použita k provedení 4,6-diamidino-2-fenylindolového barvení (DAPI) [9]. Při 48 hpt byly pozorovány fluorescenční signály GFP a DAPI a snímky byly zachyceny laserovým skenovacím konfokálním mikroskopem (TCS SP8, Leica, Solms, Německo) s excitační vlnovou délkou 488 nm a pásmovou emisí 505–530 nm filtr.

4.6. Histochemické barvení

Histochemické barvení (trypanová modř a 3, 30 -diaminobenzidin) bylo provedeno tak, jak bylo popsáno dříve [9,11,79]. Pro provedení testu barvení trypanovou modří byly listy pepře vařeny v roztoku trypanové modři (10 ml kyseliny mléčné, 10 ml glycerolu, 10 ml fenolu, 40 ml ethanolu, 10 ml ddH2O a 1 ml trypanové modři) po dobu 30 minut. Poté byly listy udržovány při teplotě místnosti po dobu 8 hodin, ponořeny do roztoku chloralhydrátu (2,5 g chloralhydrátu rozpuštěného v 1 ml destilované vody) a odbarveny varem po dobu 30 minut. Roztok chloralhydrátu byl několikrát vyměněn, aby se snížilo pozadí, a poté byly vzorky upevněny v 70% glycerolu. Listy byly umístěny do 1 mg/ml roztoku DAB přes noc pro test barvení DAB. Listy obarvené DAB byly vařeny ve směsi kyselina mléčná:glycerol:absolutní ethanol [1:1:3 (v/v/v)] a poté přes noc odbarveny v absolutním ethanolu [80]. Snímky trypanové modři a listů obarvených DAB byly pořízeny fotoaparátem a světelným mikroskopem (Leica, Wetzlar, Německo).

4.7. Umlčení CaWRKY30 pomocí virem indukovaného umlčení genů (VIGS)

Pro umlčování CaWRKY30 v rostlinách pepře byl proveden dříve popsaný systém na umlčování genu indukovaného virem (VIGS) založený na viru tabákového chřestění (TRV) [47,81,82]. Konstrukty Agrobacterium GV3101 obsahující PYL192, PYL279-CaWRKY30, PYL279 a PYL279-PDS (OD600=0.8) byly smíchány v poměru 1:1. Tato směs byla infiltrována do děložních listů 2-týdenních rostlin papriky pomocí injekční stříkačky bez jehly. Infiltrované rostliny byly inkubovány v růstové komoře po dobu 56 hodin ve tmě při teplotě 16 ◦C a relativní vlhkosti 45 procent a poté byly přesunuty do růstové místnosti za kontrolovaných podmínek při teplotě 25 ± 2 ◦C, 60–70 µmol fotonů m-2 s -1 a relativní vlhkost 70 procent při fotoperiodě 16 h světlo/8 h tma.

4.8. CaWRKY30 Přechodná nadměrná exprese v listech pepře

Buňky Agrobacterium GV3101 obsahující CaWRKY30-Flag a EV byly kultivovány v médiu LB v termokontrolní třepačce s odpovídajícími antibiotiky přes noc do OD600=1.0. Poté byly tyto Agrobacterium GV3101 centrifugovány při 6000 pm a 28 °C po dobu 10 minut. Po odstředění byl kapalný supernatant odstraněn a pevná peleta na dně byla zředěna na OD600=0.8 v indukčním médiu (10 mM MES, pH 5,4, 10 mM MgCl2, 200 uM acetosyringonu). Tato směs byla infiltrována do listů injekční stříkačkou bez jehly. Tyto přechodně nadměrně exprimované listy byly pozorovány na HR podobnou buněčnou smrt nebo byly odebrány vzorky pro provedení experimentů s DAB a trypanovou modří a pro izolaci RNA pro více experimentů.

4.9. Extrakce RNA a kvantitativní RT-PCR v reálném čase

Reagenční metoda TRIzol (Invitrogen) byla použita k extrakci celkové RNA ze vzorků listů ošetřených rostlin pepře a z falešných semenáčků. Poté byla k reverzní transkripci extrahované RNA použita souprava Prime Script RT-PCR (TaKaRa, Dalian, Čína). Pro studium relativních transkripčních hladin cílových markerových genů byla provedena analýza qRT-PCR v reálném čase. Zpracování dat bylo provedeno podle dříve popsaných metod [45,82] se specifickými primery (doplňková tabulka S3), za použití pokynů výrobce pro systém Bio-Rad Real-time PCR (Bio-Rad, Foster City, CA, USA) a Systém SYBR premix Ex Taq II (TaKaRa Perfect Real Time).

4.10. Odhad ELEKTRICKÉ vodivosti

Elektrická vodivost (iontový únik) byla vypočítána pomocí výše popsané metody s malými změnami [44,83]. Šest listových kotoučů (šířka 4 mm) bylo získáno použitím děrovačky. Disky byly třikrát promyty sterilizovanou ddH20 a okamžitě inkubovány v 10 ml ddH20. Poté byly tyto listové disky udržovány v mírně třepané (60 ot./min.) třepačce při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Pro záznam dat o elektrické vodivosti byl použit měřič vodivosti (Mettler Toledo 326 Mettler, Zurich, Švýcarsko).

4.11. Immuno blotting

K extrakci proteinu z listů papriky byl použit dříve popsaný postup proteinového extrakčního pufru [3]. Extrahovaný protein byl přes noc inkubován s antiHA agarózou při 4 °C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Magnetické praskání bylo použito ke sběru kuliček a třikrát promyto Tris pufrem (TBS) a tweenem 20 (0,05 procenta). Eluovaný protein byl pozorován pomocí imunoblotu a anti-HA-peroxidázy (Abcam, Cambridge, UK).

5. Závěry

Na závěr jsme toho názoru, že CaWRKY30 transkripčně aktivuje imunitu pepře proti RSI. Umlčení CaWRKY30 pomocí VIGS omezilo imunitu rostlin pepře vůči infekci bakteriálním patogenem, zatímco přechodná nadměrná exprese CaWRKY30 vyvolala rezistenci k R. solanacearum. Souhrnně je vytvoření pozitivní zpětnovazební smyčky a její funkce paralelně s jinými TF dostatečným důkazem její aktivace při biotickém stresu. Kromě toho navrhujeme vytvoření stabilních transgenních rostlin pepře CaWRKY30 a cílového proteinu CaWRKY30, abychom komplexně vysvětlili úlohu tohoto genu proti bakteriálním patogenům a také v různých metabolických drahách.

Příspěvky autora:

Konceptualizace, AH, MIK, MA, BSA, ZL a ATKZ; Správa dat, AH, MIK a AME-S.; Formální analýza, ZL a SF; Získávání finančních prostředků, AH, MIK, MAAA, MA, BSA, AME-S. a ATKZ; Administrace projektu, AH a MIK; Zdroje, AH; Validace, SM; Vizualizace, SM a SF; Psaní – původní návrh, AH a MIK; Psaní – recenze a úpravy, IRN, MAAA, MA, BSA, AME-S., ZL, SF a ATKZ Všichni autoři si přečetli a souhlasí s publikovanou verzí rukopisu.

Financování:

Hlavní autor je vysoce zavázán pákistánské komisi pro vysoké školství za finanční pomoc na dokončení této studie v rámci grantu SRGP č. 21-2651/SRGP/HRD/HEC/2020. Aktuální práce byla financována výzkumnými pracovníky Taif University Supporting Project číslo (TURSP2020/245), Taif University, Taif, Saúdská Arábie. Studie byla také podpořena projektem Rozvojového fondu Zemědělské a lesnické univerzity Fujian (CXZX2018114, CXZX2020008A a CXZX2019024G).

Prohlášení institucionální revizní komise: Neuplatňuje se.

Prohlášení o informovaném souhlasu: Neuplatňuje se.

Prohlášení o dostupnosti dat: Všechna data jsou součástí rukopisu a jeho doplňkových souborů.4

Střet zájmů: Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Reference

1. Arif, M.; Atta, S.; Bashir, MA; Khan, MI; Hussain, A.; Shahjahan, M.; Alwahibi, MS; Elshikh, MS Vliv načasování aplikace FosetylAluminium na potlačení sněti karnalské a ekonomickou návratnost pšenice chlebové (Triticum aestivum L.). PLoS ONE 2021, 16, e0244931.

2. Khalofah, A.; Khan, MI; Arif, M.; Hussain, A.; Ullah, R.; Irfan, M.; Mahpara, S.; Shah, RU; Ansari, MJ; Kintl, A. Hluboké umístění dusíkatého hnojiva zlepšuje výnos, účinnost využití dusíku a ekonomickou návratnost transplantované jemné rýže. PLoS ONE 2021, 16, e0247529. [CrossRef] [PubMed]

3. Noman, A.; Hussain, A.; Adnan, M.; Khan, MI; Ashraf, MF; Zainab, M.; Khan, KA; Ghramh, HA; He, S. Nový transkripční faktor MYB CaPHL8 poskytuje vodítka o vývoji imunity pepře proti patogenu přenášenému v půdě. Microb. Patog. 2019, 137, 103758. [CrossRef] [PubMed]

4. Hussain, A.; Noman, A.; Khan, MI; Zaynab, M.; Aqeel, M.; Anwar, M.; Ashraf, MF; Liu, Z.; Raza, A.; Mahpara, S. Molekulární regulace vrozené imunity pepře a tolerance stresu: Přehled WRKY TF. Microb. Patog. 2019, 135, 103610. [CrossRef] [PubMed]

5. Reboledo, G.; Agorio, Ad; Vignale, L.; Batista-García, RA; de León, IP Transkripční profilování odhaluje konzervované a druhově specifické obranné reakce rostlin během interakce Physcomitrium patens s Botrytis cinerea. Plant Mol. Biol. 2021, 1.–21. [CrossRef]

6. Aerts, N.; Mendes, MP; van Wees, SC Mnohonásobné úrovně přeslechů v hormonálních sítích regulujících obranu rostlin. Závod J. 2021, 105, 489–504. [CrossRef] [PubMed]

7. Liu, Z.; Shi, L.; Weng, Y.; Zou, H.; Li, X.; Yang, S.; Qiu, S.; Huang, X.; Huang, J.; Hussain, A. ChiIV3 působí jako nový cíl WRKY40 ke zprostředkování pepřové imunity proti infekci Ralstonia solanacearum. Mol. Interakce rostlina-mikrobi. 2019, 32, 1121–1133. [CrossRef] [PubMed]

8. ul Haq, MI; Maqbool, MM; Ali, A.; Farooq, S.; Khan, S.; Saddiq, MS; Khan, KA; Ali, S.; Khan, MI; Hussain, A. Optimalizace geometrie výsadby pro systém meziplodin ječmen-egyptský jetel v semiaridním subtropickém klimatu. PLoS ONE 2020, 15, e0233171.

9. Hussain, A.; Li, X.; Weng, Y.; Liu, Z.; Ashraf, MF; Noman, A.; Yang, S.; Ifnan, M.; Qiu, S.; Yang, Y. CaWRKY22 působí jako pozitivní regulátor v reakci pepře na Ralstonia solanacearum tím, že vytváří sítě s CaWRKY6, CaWRKY27, CaWRKY40 a CaWRKY58. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1426. [CrossRef] [PubMed]

10. Mukhtar, MS; Liu, X.; Somssich, IE Objasnění role WRKY27 v mužské sterilitě u Arabidopsis. Rostlinný signál. Chovej se. 2018, 13, e1363945. [CrossRef] [PubMed]

11. Khan, MI; Zhang, Y.; Liu, Z.; Hu, J.; Liu, C.; Yang, S.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Noman, A.; Shen, L. CaWRKY40b v pepři působí jako negativní regulátor v reakci na Ralstonia solanacearum přímou modulací obranných genů včetně CaWRKY40. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1403. [CrossRef] [PubMed]

12. Eulgem, T.; Somssich, IE Sítě transkripčních faktorů WRKY v obranné signalizaci. Curr. Opin. Plant Biol. 2007, 10, 366–371. [CrossRef] [PubMed]

13. Bakshi, M.; Oelmüller, R. WRKY transkripční faktory: Jack of many trades in plants. Rostlinný signál. Chovej se. 2014, 9, e27700. [CrossRef] [PubMed]

14. Xu, Y.-P.; Xu, H.; Wang, B.; Su, X.-D. Krystalové struktury N-terminálních transkripčních faktorů WRKY a komplexů DNA. Proteinová buňka 2020, 11, 208–213. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, X.; Li, C.; Wang, H.; Guo, Z. WRKY transkripční faktory: Evoluce, vazba a akce. Fytopathol. Res. 2019, 1, 13. [CrossRef]

16. Shen, L.; Liu, Z.; Yang, S.; Yang, T.; Liang, J.; Wen, J.; Liu, Y.; Li, J.; Shi, L.; Tang, Q. Pepper CabZIP63 působí jako pozitivní regulátor během Ralstonia solanacearum nebo výzvy vysoké teploty a vysoké vlhkosti v kladné zpětné vazbě s CaWRKY40. J. Exp. Bot. 2016, 67, 2439–2451. [CrossRef] [PubMed]

17. Schluttenhofer, C.; Yuan, L. Regulace specializovaného metabolismu pomocí WRKY transkripčních faktorů. Plant Physiol. 2015, 167, 295–306. [CrossRef] [PubMed]

18. Jiang, J.; Ma, S.; Ano, N.; Jiang, M.; Cao, J.; Zhang, J. WRKY transkripční faktory v reakcích rostlin na stresy. J. Integr. Plant Biol. 2017, 59, 86–101. [CrossRef]

19. Yu, K.; Pieterse, CM; Bakker, PA; Berendsen, RL Prospěšné mikroby, které se dostaly do podzemí kořenové imunity. Prostředí rostlinných buněk. 2019, 42, 2860–2870. [CrossRef]

20. Noman, A.; Liu, Z.; Yang, S.; Shen, L.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Khan, MI; He, S. Exprese a funkční hodnocení CaZNF830 během reakce pepře na Ralstonia solanacearum nebo vysokou teplotu a vlhkost. Microb. Patog. 2018, 118, 336–346. [CrossRef] [PubMed]

21. Noman, A.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Khan, MI; Liu, Z.; He, S. CabZIP53 je cílem CaWRKY40 a působí jako pozitivní regulátor v obraně pepře proti Ralstonia solanacearum a termotoleranci. Environ. Exp. Bot. 2019, 159, 138–148. [CrossRef]

22. Ashraf, MF; Yang, S.; Wu, R.; Wang, Y.; Hussain, A.; Noman, A.; Khan, MI; Liu, Z.; Qiu, A.; Guan, D.; a kol. Capsicum annuum HsfB2a pozitivně reguluje reakci na infekci Ralstonia solanacearum nebo transkripční kaskádu tvořící vysokou teplotu a vysokou vlhkost s CaWRKY6 a CaWRKY40. Plant Cell Physiol. 2018, 59, 2608–2623. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, L.; Dossa, K.; Ty, J.; Zhang, Y.; Li, D.; Zhou, R.; Yu, J.; Wei, X.; Zhu, X.; Jiang, S.; a kol. Sekvenování časového transkriptomu s vysokým rozlišením odhaluje ERF a WRKY jako hlavní hráče v regulačních sítích, které jsou základem sezamových reakcí na zamokření a obnovu. Genomika 2021, 113, 276–290. [CrossRef]

24. Yang, X.; Zhou, Z.; Fu, M.; Han, M.; Liu, Z.; Zhu, C.; Wang, L.; Zheng, J.; Liao, Y.; Zhang, W.; a kol. Identifikace genů rodiny WRKY v rámci celého transkriptomu a jejich profilování exprese vůči kyselině salicylové u Camellia japonica. Rostlinný signál. Chovej se. 2021, 16, 1844508. [CrossRef] [PubMed]

25. Pervez, M.; Babar, M.; Iqbal, J.; Hasnain, M.; Abbas, S.; Shah, S.; Ashraf, M. In Silico strukturní a funkční analýza genů Wrky1 a Wrky3 ve vybraných obilných plodinách. J. Anim. Plant Sci.-JAPS 2021, 31, 322–341.

26. Liu, Z.-Q.; Liu, Y.-Y.; Shi, L.-P.; Yang, S.; Shen, L.; Yu, H.-X.; Wang, R.-Z.; Wen, J.-Y.; Tang, Q.; Hussain, A.; a kol. SGT1 je vyžadován v PcINF1/SRC 2-1-indukované pepřové obranné reakci interakcí s SRC2-1. Sci. Rep. 2016, 6, 21651. [CrossRef] [PubMed]

27. Srinivasan, K. Biologické aktivity červeného pepře (Capsicum annuum) a jeho štiplavý princip Kapsaicin: Přehled. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2016, 56, 1488–1500. [CrossRef] [PubMed]

28. Liu, Z.; Shi, L.; Yang, S.; Lin, Y.; Weng, Y.; Li, X.; Hussain, A.; Noman, A.; He, S. Funkční a promotorová analýza ChiIV3, chitinázy z rostliny pepře, v reakci na infekci Phytophthora capsici. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1661. [CrossRef] [PubMed]

29. Ali, M.; Luo, D.-X.; Khan, A.; Haq, SU; Gai, W.-X.; Zhang, H.-X.; Cheng, G.-X.; Muhammad, I.; Gong, Z.-H. Klasifikace a celogenomová analýza genové rodiny chitin-vazebných proteinů v pepři (Capsicum annuum L.) a transkripční regulace na Phytophthora capsici, abiotické stresy a hormonální aplikace. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2216. [CrossRef] [PubMed]

30. Noman, A.; Liu, Z.; Aqeel, M.; Zainab, M.; Khan, MI; Hussain, A.; Ashraf, MF; Li, X.; Weng, Y.; He, S. Základní transkripční faktory domény leucinového zipu: Předvoje rostlinné imunity. Biotechnol. Lett. 2017, 39, 1779–1791. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com