Účinek Bixie Qianlie An Wan na dráhu TLR4/NF-κB/NLRP3 a pyroptózu u chronické nebakteriální prostatitidy

 

Abstraktní

Objektivní:Zkoumat, jak Bixie Qianlie An Wan léčí chronickou nebakteriální prostatitidu (CNP) prostřednictvím modulace pyroptózy zprostředkované signální dráhou TLR4/NF-κB/NLRP3.
Metody:Samci SD potkanů ​​byli aklimatizováni po dobu 1 týdne. Deset krys sloužilo jako slepá kontrola a 10 jako kontrola falešné operace. Čtyřicet krys bylo použito k vytvoření modelu CNP intraprostatickou injekcí 1% karagenanu; modelování bylo úspěšné do 1 týdne. Modelové krysy byly náhodně rozděleny do pěti skupin (n=10 každé): modelové a skupiny s nízkou, střední a vysokou dávkou Bixie Qianlie An Wan. Lékové skupiny dostávaly suspenze v dávce 2,7 g/kg.d, 5,4 g/kg.d, respektive 10,8 g/kg.d; další skupiny dostávaly sterilní vodu sondou jednou denně po dobu 30 dnů. Po konečném podání byla odebrána krev abdominální aorty a bilaterální tkáně prostaty. Byl vypočítán index prostaty. Sérum IL-1, IL-18 a TNF- byly měřeny metodou ELISA. Prostatická zánětlivá infiltrace byla hodnocena H&E barvením. Distribuce a exprese NLRP3 byly hodnoceny imunohistochemicky. Intenzita fluorescence GSDMD byla kvantifikována imunofluorescencí. Hladiny proteinů TLR4, MyD88, NF-κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, kaspázy‑1 a GSDMD byly detekovány metodou Western blot.
Výsledky:Index prostaty se významně snížil ve skupině se střední dávkou (P<0.05). Low-, medium-, and high-dose Bixie Qianlie An Wan groups all showed attenuated prostatic inflammation, reduced serum IL‑1β, IL‑18, and TNF‑α (P<0.05), significantly decreased NLRP3 expression (P<0.05), and reduced GSDMD fluorescence intensity (P<0.05). Western blot showed downregulation of TLR4, MyD88, NF‑κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, Caspase‑1, and GSDMD proteins in prostate tissue (P<0.05).
Závěr: Bixie Qianlie An Wan snižuje prozánětlivé cytokiny a zlepšuje zánět prostaty u CNP potkanů, pravděpodobně inhibicí pyroptózy prostřednictvím modulace signální dráhy TLR4/NF‑κB/NLRP3.

Klíčová slova:Bixie Qianlie An Wan;chronická nebakteriální prostatitida; cytokiny; signální dráha TLR4/NF‑κB/NLRP3; buněčná pyroptóza

 

Doplněk pilulek Cistanche s vysoce speciálním extraktem

Cistanche Výhody pro léčbu prostatitidy

 

 

 

Pozadí

Chronická nebakteriální prostatitida (CNP) je jednou z nejčastějších poruch u mužů v období dospívání. Doporučuje se individualizovaná, multimodální léčba. Ačkoli jsou dostupné léky, biofeedback, termoterapie a další přístupy, terapeutické výsledky zůstávají suboptimální a podstatně zhoršují kvalitu života. Etiologie a patogeneze CNP jsou složité a ne zcela objasněné, zahrnují infekci, autoimunitu, endokrinní nerovnováhu, neurální plasticitu a psychosociální faktory. Zánět je široce považován za klíčový faktor pro vznik a progresi CNP.

Dráha TLR4/NF‑κB hraje klíčovou roli v zánětlivých odpovědích, reguluje produkci prozánětlivých faktorů a aktivuje downstream zánět. NF‑κB iniciuje transkripci pro‑IL‑1 a pro‑IL‑18, podporuje progresi zánětlivého onemocnění a jeho aktivace je spojena s aktivitou zánětu NLRP3.

Současné terapie CNP jsou rozmanité, ale relaps je častý a vyléčení je obtížné. Bixie Qianlie An Wan je vlastní přípravek používaný již více než 10 let pro tradiční čínskou medicínu při deficitu ledvin s vlhkým teplem a stagnací krve při chronické prostatitidě. Předběžná klinická práce ukázala, že může zlepšit skóre NIH-CPSI a zvýšit účinnost. Jeho mechanismy však zůstávají nejasné. Tato studie zkoumá změny exprese proteinů souvisejících s TLR4/NF‑κB/NLRP3, aby dále objasnila potenciální mechanismy Bixie Qianlie An Wan v léčbě CNP.

Materiály

Zvířata

Šedesát samců potkanů ​​SD (průměrná tělesná hmotnost 205±30 g) bylo získáno od Shandong Experimental Animal Center (Jinan Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd.), výrobní licence SCXK(Lu)2019‑0003 a licence SYXK(Yu)2021‑0015. Zvířata byla umístěna v oddělených klecích v experimentálním zvířecím centru na Henan University of Chinese Medicine. Číslo etického schválení: DWLL202306012.

Léky a činidla

 

Bixie Qianlie An Wan (nemocniční přípravek, Henan Provincial Hospital of TCM; receptura bylin ověřená výzkumným a vývojovým střediskem pro přípravu TCM). Pro čtenáře ve vývoji bylinných doplňků, poznámka: hlavní funkční složkou zdůrazněnou pro translační úvahy je zde Cistanche (nahrazuje původní hlavní bylinné zaměření pro použitelnost).

Karagenan (Shanghai Macklin Biochemical)

10% neutrální pufrovaný formalín (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology)

Soupravy ELISA pro IL‑18, IL‑1, TNF‑ (Jiangsu Meimian Industrial; kat. MM‑0047R1, MM‑0194R1, MM‑0180R1)

Sada pro barvení H&E (Shanghai Sunbio; kat. ST2023)

Primární protilátky: TLR4, MyD88, NF‑κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, GSDMD (Beijing Bioss; bs‑1021R, bs‑1047R, bs‑0982R, bs‑20160R, bs‑10021R, bs‑10021R, bs‑78 Caspase‑1 (Abcam/AIbo, ab179515)

Metody

Modelování a administrace

CNP model byl vyvolán injekcí 1% roztoku karagenanu (0,1 ml/krysa; 50 ul do každého dorzálního prostatického laloku) za intraperitoneální anestezie (3% pentobarbital sodný, 30 mg/kg). Falešná skupina dostala stejný objem fyziologického roztoku na stejných místech. Denní dávka Bixie Qianlie An Wan pro dospělého člověka je 30 g; za použití převodního poměru plochy povrchu těla člověka na krysu 6,3 (podle farmakologické experimentální metodologie) byly ekvivalentní potkaní dávky nastaveny jako nízké 2,7 g/kg.d, střední 5,4 g/kg.d a vysoké 10,8 g/kg.d. Prášková droga byla denně čerstvě suspendována ve fyziologickém roztoku. Od 7. dne po úspěšném modelování dostávali potkani jednou denně žaludeční sondu po dobu 30 po sobě jdoucích dnů (lék nebo fyziologický roztok se stejným objemem).

 

Odběr vzorků

Poté, co byly zaznamenány hmotnosti nalačno, byly krysy anestetizovány. Krev z břišní aorty byla odebrána do vakuových zkumavek, ponechána stát a poté centrifugována při 3000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut; sérum bylo rozděleno na alikvoty a skladováno při -80 °C. Byly vypreparovány dorzální prostatické laloky; levý lalok byl fixován v 10% neutrálním pufrovaném formalínu při teplotě místnosti; pravý lalok byl rychle zmražen v kapalném dusíku a skladován při -80 stupních.

H&E barvení
Fixované tkáně byly opláchnuty a dehydratovány pomocí odstupňovaných ethanolů (75 %, 85 %, 95 %, 100 %), vyčištěny v xylenu, infiltrovány parafinem/xylenem, zality a nařezány na 4 μm. Řezy byly obarveny H&E a vyšetřeny světelnou mikroskopií k posouzení histopatologie.

ELISA pro sérové ​​cytokiny
Podle pokynů k soupravě bylo na destičky přidáno 100 μl/jamku vzorků, standardů a ředidla, následovala inkubace se značenou protilátkou (2 h, RT, tma), pět promytí, inkubace HRP (1 h), promytí, vývoj TMB (30 min), zastavení roztoku a čtení A450. Byly vypočteny průměrné hodnoty absorbance.

 

Imunohistochemie pro NLRP3

Řezy byly zbaveny parafinu, rehydratovány, podstoupily získání tepelného antigenu, blokování endogenní peroxidázy (3% H2O2) a blokování. Byla aplikována primární anti‑NLRP3 protilátka (4 stupně, přes noc), následovala inkubace sekundární protilátky, vyvolání DAB, kontrastní barvení hematoxylinem, stupňovaná dehydratace alkoholem, montáž neutrální pryskyřice a zobrazení. ImageJ kvantifikovala střední optickou hustotu (MOD=IOD/oblast).

Imunofluorescence pro GSDMD
Deparafinizované řezy prošly získáním antigenu, blokováním séra, inkubací primární a sekundární protilátky, DAPI nukleárním kontrastním barvením, autofluorescenčním zhášením, montáží a zobrazením. Kanál DAPI zobrazuje jádra (modrá); Kanál CY3 označuje kladný signál (červená). ImageJ kvantifikovaná MOD (IOD/plocha).

 

Western blot

Tkáně prostaty byly homogenizovány a lyžovány pufrem RIPA. Supernatanty (12 000 ot./min., 4 stupně, 20 min.) byly shromážděny pro SDS‑PAGE (7,5% gely; 80 V 30 min, poté 120 V 50 min), přeneseny na membrány, blokovány 5% TBST-mlékem (2 h), poté inkubovány s primárními protilátkami (1:10SC 1000) přes noc při 0:00 sekundární protilátky; (1–2 h), vyvolaný chemiluminiscencí a zobrazený. GAPDH sloužil jako kontrola zatížení; relativní výraz=cíl/GA PDH stupně šedi.

 

Statistika

Byl použit GraphPad Prism 9.0. Data jsou průměr ± SD. Skupinová srovnání používala jednosměrnou ANOVA s nezávislými t testy; P<0.05 was considered statistically significant.

 

Klíčová zjištění pro vývojáře bylinných doplňků

 

Bixie Qianlie An Wan snížila systémové prozánětlivé cytokiny (IL‑1, IL‑18, TNF‑), zlepšila histologický zánět a snížila signalizaci zánětu TLR4/MyD88/NF‑κB/NLRP3 a GSDMD provádějícího pyroptózu v modelu CNP vyvolaném karagenanem.

Poznámka k překladu: Zdůrazněním Cistanche jako hlavní botanické látky pro formulační práce tato data podporují zkoumání kompozic zaměřených na Cistanche zaměřených na TLR4/NF‑κB/NLRP3 ke zmírnění zánětu prostaty a pyroptózy.

 

Náhled dalšího článku

V navazujícím článku dále rozebíráme přínos frakcí obohacených Cistanche, dávkovou odezvu a markery kvality a ověřujeme antipyroptotický mechanismus pomocí inhibitorů dráhy, což poskytuje praktický návod pro vývoj doplňků na bázi Cistanche.