Biomonitoring mykotoxinů v plazmě pacientů s Alzheimerovou a Parkinsonovou chorobouⅡ

2. Výsledky a diskuse

2.1. LC-MS/MS analýza

Vzhledem k jejich odlišným fyzikálně-chemickým vlastnostem byly mykotoxiny rozděleny pro chromatografickou separaci do dvou skupin (viz část materiál a metody). Následující obrázky (obrázky 1–4) ukazují superponované extrahované chromatogramy mykotoxinů v kalibrátorech a vzorku plazmy (kódované jako vzorky 1–4) před a po enzymatickém ošetření. Jak je vidět, OTA se objevuje ve vzorcích před a po enzymatickém ošetření (obr. 1; obr. 3); zatímco STER se objeví až po enzymatickém ošetření (obrázek 3). Žádný z dalších analyzovaných mykotoxinů nebyl ve vzorcích plazmy detekován.

Každá z kalibračních křivek použitých při kvantifikaci mykotoxinů splnila kritéria definovaná dříve během validace metody. Příklady získaných kalibračních křivek pro každý mykotoxin jsou uvedeny v tabulkách S1 a S2. Identita sloučenin byla také hodnocena: přechody kvalifikace (q) a kvantifikace (Q) pro každý detekovaný mykotoxin byly pozorovány u každého z jednotlivců a pozitivních vzorků a získaná relativní chyba (RE) mezi hodnotami poměru q/Q pro každý mykotoxin v kalibrátorech a ve vzorcích byl méně než 20 procenta [32]. Navíc retenční časy se u vzorků a kalibrátorů nelišily o více než 2,5 procenta [33] (1,3 procenta pro OTA před a 1,6 procenta po enzymatickém ošetření; 0,3 procenta pro OTB a 1,8 procenta pro STER).

2.2. Vzorky plazmy

Z neurologické služby v nemocnici San Pedro v La Rioja (Španělsko) bylo přijato celkem 93 subjektů, včetně 25 zdravých kontrol (CNT) a 68 pacientů. Kontrolní dárci byli nepříbuzní společníci pacientů bez zjevných nebo diagnostikovaných neurologických onemocnění. Pacienti byli rozděleni podle patologií: 44 pacientů s PD a 24 s AD.

Klikněte pro tobolky cistanche tubulosa pro Alzheimerovu chorobu a Parkinsonovu chorobu

Diagnózu a progresi onemocnění rekrutovaných pacientů provedli experti neurologové podle Hoehnovy a Yahrovy (HY) škály pro PD (tabulka S3) a globální škály zhoršení (GDS) pro AD (tabulka S4). Všichni pacienti s AD již vykazovali klinické známky mírného poklesu kognitivních funkcí nebo demence (od 3 do 7, stupnice GDS). Pacienti s PD byli rozděleni do dvou skupin, protože progrese onemocnění byla odlišná mezi pacienty s jedinci, kteří nevykazovali žádné zhoršené posturální reflexy (1 a 2, HY škála) a jiní již vykazovali zhoršené posturální reflexy (od 2,5 do 3, HY škála).

Vzhledem k nízkému počtu vzorků však byla statistická analýza pacientů s PD provedena jako jedna skupina. Počet subjektů zařazených do každé skupiny a podskupiny je uveden spolu s pohlavím, věkovým rozmezím a progresí onemocnění v tabulce 1. Kompletní individuální informace o subjektech přijatých do studie jsou uvedeny v doplňkových materiálech (tabulky S5 a S6).

2.3. Přítomnost mykotoxinů

Z 19 hodnocených mykotoxinů byly ve vzorcích detekovány pouze OTA, OTB a STER. OTA byl přítomen před a po ošetření směsí glukuronidáza/arylsulfatáza, zatímco OTB byl detekovatelný pouze před a STER se objevil až po enzymatickém ošetření. Je třeba poznamenat, že vzhledem k omezenému objemu některých vzorků bylo hodnocení po enzymatickém ošetření možné pouze u 74 z 93 odebraných vzorků.

Analytické výsledky získané pro OTA, OTB a STER jsou shrnuty v tabulce 2. Kvůli potvrzení identifikačních kritérií (přechody q a Q by měly být přítomny a porovnány s kalibrátory RE jak pro poměr q/Q, tak pro retenční čas, což by mělo být < 20 procent nebo 2,5 procenta, v daném pořadí), vzorky s hodnotami většími nebo rovnými LOD byly použity pro analýzu zpracování dat. Proto byly výpočty provedeny pomocí substituční metody dolní meze [34].

Only OTA (77% of the samples) and OTB (13% of the samples) were detected (>LOD) ve vzorcích zpracovaných před enzymatickým zpracováním. Pokud jde o přítomnost OTA, u všech skupin byly nalezeny vzorky pod LOD. Maximální hladina OTA (8,81 ng/ml) odpovídala 66leté ženě v kontrolní skupině. Pokud jde o kontrolní populaci, OTA a OTB byly přítomny v 92 procentech a 24 procentech vzorků.

Tyto výsledky jsou v souladu s nedávnou studií provedenou v Navarře, sousedním regionu ve Španělsku. V této studii byla OTA přítomna v 97,3 procentech a OTB v 10 procentech vzorků (n=438) [35] měřeno stejnou metodou, jako je metoda použitá v současné studii [36]. V této studii jsou průměrné hladiny OTA (2,15 ng/ml) mírně pod hladinami naměřenými v Navarře (2,87 ng/ml). Hladiny OTA se pohybovaly od LOD do 8,81 ng/ml, zatímco ve vzorcích z Navarry se koncentrace OTA pohybovaly mezi LOD a 19,9 ng/ml (ve vzorku dosahujícím 45,7 ng/ml u 66-leté ženy).

Pokud jde o pohlaví, a také ve shodě se studií Navarra [35] bylo možné pozorovat, že průměrné hodnoty OTA před enzymatickou léčbou měly tendenci být vyšší u mužů než u žen ve všech skupinách. Ačkoli procento vzorků pozitivních na OTA je v souladu s předchozími studiemi provedenými ve Španělsku, průměrné a maximální hladiny OTA v populaci CNT v této studii a nedávné studii Navarra [35] jsou vyšší než v předchozích studiích ze Španělska. .

Protože tyto informace byly získány před rokem 2011, naše data podporují potřebu pokračovat v biomonitoringu hladin mykotoxinů v běžné populaci. Jak bylo dříve pozorováno [35], OTB byl přítomen v několika vzorcích a vždy se vyskytoval společně s OTA (kromě jednoho muže s CNT). Překvapivě nebylo OTB detekováno ve skupině AD. OTB je dechlorovaný analog OTA a nebyl měřen v dosud provedených studiích lidského biomonitoringu.

OTB může být přítomen v lidských vzorcích, protože je známo, že je přítomen v některých potravinových matricích, jako je víno [37], ale může být také lidským metabolitem OTA [38]. Bohužel v této studii není možné rozlišovat mezi možnými zdroji OTB nebo vědět, zda nepřítomnost OTB ve skupině AD nemůže být způsobena odlišným vzorcem konzumace potravy pacientů nebo odlišným metabolismem v důsledku onemocnění, nebo pokud je to způsobeno nízkým počtem analyzovaných vzorků. Analýza dat po enzymatickém ošetření odhalila, že OTA byl stále detekován (89 procent vzorků).

Navíc, jak bylo dříve pozorováno u zdravých dárců z Navarry [35], STER se objevil ve většině vzorků (88 procent), zatímco OTB již nebyl detekován. Při srovnání přítomnosti OTA před a po enzymatické léčbě bylo procento pozitivních vzorků před enzymatickou léčbou u CNT vyšší než u pacientů; zatímco po enzymatické léčbě se přítomnost OTA u CNT snížila, zatímco u pacientů s AD a PD se zvýšila. Někteří autoři podporují hypotézu, že konjugáty OTA mohou vznikat během lidského metabolismu [39–41].

However, more data are needed to understand and monitor the human metabolism of OTA. In this study, and again in line with the study conducted in Navarra, STER only appeared after treating the samples with β-glucuronidase/arylsulfatase and this mycotoxin was found positive (>LOD) v 88 procentech analyzovaných vzorků. Tato data podporují hypotézu, že STER-glukuronidy vznikají během lidského metabolismu [35,42].

2.4. Statistická analýza

Podle analytických výsledků byly statistické výpočty provedeny pouze pro OTA a STER. OTB nebylo zahrnuto do statistické analýzy, protože pouze 12 vzorků (13 procent) bylo větších nebo rovných LOD. Hypotéza rozdělení normality (Shapiro–Wilkův test) byla zamítnuta, a proto byly pro statistické zpracování použity neparametrické testy, které neimplikují žádný předpoklad rozdělení. STER byl detekován až po enzymatickém ošetření, proto byla statistická analýza STER provedena na 74 dostupných výsledcích získaných po enzymatickém štěpení. Na druhou stranu pro OTA byly k dispozici dva soubory výsledků, jeden získaný zpracováním dat před enzymatickým zpracováním a jeden získaný po enzymatickém ošetření (tj. OTA před a po).

Vzhledem k neúplnosti OTA po datovém souboru (74 záznamů) bylo rozhodnuto provést statistické výpočty zohledňující pouze OTA před datovým souborem (93 záznamů). Aby se potvrdilo rozhodnutí vyloučit OTA po datovém souboru, byl proveden Wilcoxonův test shodných párů se znaménkem, aby se prozkoumaly možné rozdíly mezi párovými výsledky OTA před a po datových sadách.

Test nezdůraznil žádný významný rozdíl, když byl aplikován na hodnoty OTAbefore a OTAafter pro celou skupinu populace (n=74, z=−1,438, p-hodnota=0,1503), což potvrzuje že kompletní datový soubor OTAbefore odpovídá statistickým vyhodnocením. Jak již bylo zmíněno, nejsou k dispozici žádné předchozí studie sledující mykotoxiny ve vzorcích plazmy pacientů s PD nebo AD. Proto, aby byly zachyceny všechny možné rozdíly a asociace úrovní koncentrace OTA a STER mezi skupinami a podskupinami, byl proveden Wilcoxonův rank-sum test nebo Kruskal-Wallisův test pro srovnání více proměnných.

Kromě toho byly zkoumány možné rozdíly se statistickou významností rozdělením skupin podle pohlaví a onemocnění (pacienti s PD a AD), rovněž s přihlédnutím ke stadiu onemocnění (škála HY nebo GDS). Souhrn všech rozdílů, které byly statisticky významné (p-hodnota < 0,050) při srovnání distribucí OTA nebo STER mezi skupinami, mezi CNT a skupinou pacientů (jako celek a jako skupina PD a AD), mezi pohlaví a mezi skupinami v každé proměnné pohlaví a pohlaví, jsou uvedeny v tabulce 3.

Bylo zjištěno, že rozdíly mezi úrovněmi distribuce OTA jsou statisticky významné při srovnání skupiny CNT, PD a AD, ale tento rozdíl (p-hodnota=0,0447) se řídí srovnáním PD/AD (p- hodnota=0.0114), což je PD skupina pacientů charakterizovaná vyššími hodnotami. Při zvažování stadia onemocnění, srovnání distribuce PD podskupiny 1 a PD podskupiny 2, nebyl pozorován žádný rozdíl, což naznačuje, že ve skupině s PD stadium onemocnění neovlivňuje rozdíl v distribuci. Při srovnání pohlaví poskytly srovnávané hladiny OTA mužů a žen statistické rozdíly buď u všech subjektů nebo ve skupině pacientů (PD plus AD), přičemž muži vykazovali vždy vyšší hladiny než ženy.

Distribuce OTA se tedy neliší ve srovnání s CNT a skupinami pacientů, ale zdá se, že pohlaví může působit jako hnací síla pro rozdíly v distribucích úrovní OTA více než diagnóza onemocnění. Kromě toho při testování rozdílů distribuce OTA pro muže a ženy zvlášť, mezi skupinami (CNT, PD, AD) test neprokázal žádný rozdíl.

Statistická analýza hladin STER mezi CNT a skupinou pacientů ukázala distribuce statisticky odlišné (p-hodnota < 0.0001), přičemž hodnoty CNT byly nižší. Skupina CNT/PD/AD vykazovala statisticky odlišná rozdělení (p-hodnota=0,0001) a rozdíl byl potvrzen také srovnáním CNT/PD a CNT/AD (p-hodnota < 0,0001 v obou případech), přičemž střední hodnota nižší ve skupině AD.

Proto v hladinách STER byla distribuce skupiny CNT vždy odlišná ve srovnání s pacienty a skupinami onemocnění. Při srovnávání rozdělení pohlaví mezi muži a ženami byl zdůrazněn jakýkoli statistický rozdíl, hladiny STER u jednotlivých skupin mužů a žen se ve všech srovnáních lišily (CNT/PD/AD, CNT/skupina pacientů, CNT/PD, CNT/AD), a muži a ženy ve skupině CNT byly vždy nižší než ve skupinách pacientů.

To naznačuje, že diagnóza onemocnění může ovlivnit distribuci hladiny STER. Rozdíly mezi koncentračními hladinami OTA a STER byly také zkoumány srovnáním distribucí dvou skupin pacientů (PD a AD) u každého pohlaví (u mužů a žen) a srovnáním škály onemocnění, GDS ve skupině pacientů s AD a HY škály v u skupiny pacientů s AD a nezvýšil se žádný statistický rozdíl. Ani distribuce OTA ani STER nevykázala žádný rozdíl také ve srovnání HY stupnice jako binární proměnné HY_d=0 (PD podskupina 1, HY stupnice v rozsahu 1–2) a HY{{6 }}d=1 (PD Podskupina 2, stupnice HY v rozsahu 2,5–3).

Při srovnání chování distribuce OTA a STER je tedy zřejmé, že rozdíly OTA jsou uvnitř pohlaví (s M > W) a uvnitř skupin pacientů (PD > AD) a ze všech srovnání vyšel výrazný statistický rozdíl. Pokud jde o STER, rozdíly v distribucích jsou registrovány pro srovnání CNT a skupiny pacientů (skupina pacientů > CNT) a všechna hodnocení vždy testovala statistický rozdíl. Na druhé straně dva zkoumané mykotoxiny nezdůrazňovaly žádný rozdíl prostřednictvím průzkumu v podskupinách pacientů a/nebo ve stádiu onemocnění.

Podle našich nejlepších znalostí nejsou k dispozici žádné další studie, které by porovnávaly hladiny mykotoxinů u pacientů s neurodegenerativními onemocněními. Někteří autoři však naznačili potřebu dalšího hodnocení role mykotoxinů při zhoršování klinických projevů poruch autistického spektra [43,44].

Autoři skutečně zdůraznili statisticky významné rozdíly ve srovnání mykotoxinů (DON, DOM{0}} v moči a AFM1, OTA a FB1 v plazmě) mezi autistickou a kontrolní skupinou dětí. Výsledky této studie jsou také v souladu s novější studií naší skupiny [45], ve které byla zjištěna vyšší incidence OTA a plazmatické koncentrace u dětí v kontrolní skupině než u dětí s autistickým spektrem nebo poruchami pozornosti s hyperaktivitou.

Co se týče vlivu pohlaví a podle výsledků této studie byly ve většině publikovaných studií plazmatické hladiny OTA u mužů vyšší než u žen [46]; ačkoli Warensjö et al. (2020) u švédských adolescentů [47] a Coronel et al. (2011) [48] nezjistili rozdíly v plazmatických hladinách OTA mezi muži a ženami. Nakonec byl pro posouzení vztahu mezi hladinami OTA a STER v plazmě a věkovou proměnnou vypočten Spearmanův koeficient pořadové korelace (rho).

Všechny rho se statistickou významností (p-hodnoty < 0.050) jsou shrnuty v tabulce 4. Obecně byly nalezeny slabé negativní a pozitivní korelace: OTA a STER slabě korelují s věkem. Zejména hladiny OTA klesají s věkem (negativní korelace, rho < 0) a hodnota rho se zvyšuje, když je vybrána skupina PD nebo skupina mužů; kromě toho je hodnota rho ještě vyšší, když jsou vybrány hodnoty mužů ve skupině PD. Naopak korelace STER jsou pozitivní a jsou statisticky významné, pokud je vybrána skupina žen.

Pro znázornění pozorovaných korelací jsou na obrázku 5 uvedeny bodové grafy OTA/muži ve skupině pacientů s PD a STER/ženy u všech subjektů. Ukazují bodový graf dvou proměnných pro toxiny a věk a proložená čára pomáhá vizualizovat korelace.

Mechanismus Cistanche's léčí Parkinsonovu chorobu a Alzheimerovu chorobu

Cistanche je tradiční čínská bylina, která se pro své potenciální zdravotní přínosy používá již mnoho let. V nedávných studiích bylo zjištěno, že Cistanche může mít neuroprotektivní účinky a může být účinný při léčbě Alzheimerovy choroby (AD) a Parkinsonovy choroby (PD).

Mechanismus přípravku Cistanche při účinné léčbě AD a PD je připisován jeho aktivním složkám, jako je echinakosid, akteosid a cistanosidy. Předpokládá se, že tyto sloučeniny mají antioxidační a protizánětlivé vlastnosti, které mohou snížit oxidační stres a zánět v mozku, které jsou spojeny s rozvojem a progresí neurodegenerativních onemocnění.

Cistanche může také podporovat růst nervových buněk a zlepšovat kognitivní funkce zvýšením hladin mozkového neurotrofického faktoru (BDNF), proteinu, který hraje klíčovou roli v růstu a udržování neuronů. Kromě toho bylo prokázáno, že Cistanche redukuje -amyloidní plaky, které jsou charakteristickým znakem Alzheimerovy choroby, a snižuje akumulaci -synukleinu v mozku, která je spojována s Parkinsonovou chorobou.

Celkově jsou potenciální terapeutické přínosy přípravku Cistanche při léčbě AD a PD slibné, ale jsou zapotřebí další studie k objasnění jeho přesných mechanismů účinku a potvrzení jeho účinnosti a bezpečnosti v klinických podmínkách.

pokračování příště...

Beatriz Arce-López 1 , Lydia Alvarez-Erviti 2 , Barbara De Santis 3 , María Izco 2 , Silvia López-Calvo 4 , Maria Eugenia Marzo-Sola 4 , Francesca Debegnach 3 , Elena Lizarraga 1 , Adela López, Cerain 56 de Elena González-Peñas 1,† a Ariane Vettorazzi 5,6,* ,†

1 Ústav farmaceutické technologie a chemie, Výzkumná skupina MITOX, Škola farmacie a výživy, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, ​​Španělsko; barce@alumni.unav.es (BA-L.); elizarraga@unav.es (EL); mgpenas@unav.es (EG-P.)

2 Laboratoř molekulární neurobiologie, Centrum pro biomedicínský výzkum La Rioja (CIBIR), Piqueras 98, 3. patro, 26006 Logroño, Španělsko; laerviti@riojasalud.es (LA-E.); mizco@riojasalud.es (MI)

3 Národní referenční laboratoř pro mykotoxiny a rostlinné toxiny, Istituto Superiore di Sanità, 00161 Roma, Itálie; barbara.desantis@iss.it (BDS); francesca.debegnach@iss.it (FD)

4 Servicio de Neurología, Hospital San Pedro, Piqueras 98, 26006 Logroño, Španělsko; slcalvo@riojasalud.es (SL-C.); memarzo@riojasalud.es (MEM-S.)

5 Department of Pharmacology and Toxicology, Research Group MITOX, School of Pharmacy and Nutrition, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, Spain; acerain@unav.es 6 IdiSNA, Navarra Institute for Health Research, 31008 Pamplona, Spain