Biochemické a histopatologické odpovědi Biomphalaria Alexandrina na RIPEX (regulátor růstu rostlin)Ⅱ

3 Výsledky

3.1 Toxicita RIPEX

Výsledky toxicity přípravku RIPEX pro Biomphalaria alexandrina po 1 dni ukázaly, že hodnoty LC50 a LC90 byly 39.9 5 a 73,6 µL/L, v tomto pořadí. Subletální koncentrace Te LC10 a LC20 byly 8 a 16 ul/l (tabulka 1 a obr. 1).

3.2 Vliv RIPEX na markery oxidačního stresu

Expozice RIPEXu ovlivnila aktivity SOD a GST a hladiny MDA v trávicí žláze B. Alexandriny (tabulka 2). Hlemýždi vystavení RIPEX v 8 µL/L vykazovali nevýznamné zvýšení (p=0.6) v aktivitě SOD ve srovnání s kontrolními hlemýždi. Avšak hlemýždi B. alexandrina vystavení 16 µL/L po dobu 7 dnů vykazovali významné snížení aktivity SOD (p=0.05). Aktivita GST se významně zvýšila (p menší nebo rovno 0,001) po expozici oběma koncentracím. Nejvyšší nárůst byl zaznamenán u hlemýžďů vystavených 16 µl/l po dobu 1 dne (39,7±3,2 U/mg) a nejvyšší hodnota při koncentraci 8 µl/l byla (33,7±1,7 U/mg) po 7 dnech ve srovnání s kontroly při 17,1±3,6 U/mg (po 1 dni) a 22,6±1,3 U/mg (po 7 dnech).

Klikněte pro cistanche beneficios pro testosteron

V závislosti na časových intervalech způsobila expozice po dobu 7 dnů významný nárůst (p=0.0{{20}}3). Expozice různým koncentracím RIPEX způsobila významné zvýšení (p menší nebo rovno 0,04) hladin MDA. Koncentrace 8 ul/l zvýšila hladinu MDA (45,06±4,1) ve srovnání s kontrolou (16,4±2,1). V závislosti na době expozice byly hladiny MDA 45,06 ± 4,1 a 56,1 ± 0,7 nmol/g při koncentracích 8 a 16 ul/l, v daném pořadí, ve srovnání s 13,5 ± 0,7 nmol/g pro kontrolu (tabulka 2).

3.3 Účinek přípravku RIPEX na aktivitu steroidních hormonů

Expozice 16 µL/L způsobila významné zvýšení koncentrace testosteronu (52,6±2,5 nmol/L) (p=0,002) ve srovnání s kontrolou (34,6±2,3 nmol/L). Zatímco koncentrace 8 µL/L RIPEX způsobila významný nárůst (p=0.005) testosteronu po 3 dnech expozice ve srovnání s 16 µL/L. V závislosti na časových intervalech není žádný význam kromě významného poklesu koncentrace testosteronu, ke kterému došlo po 7 dnech (19,6±2 nmol/l) expozice (p=0,003) ve srovnání s 3 dny (47,3± 6 nmol/l). Pokud jde o estradiol, došlo k významnému zvýšení (p=0,003) koncentrace hormonu po 3 dnech expozice 16 µl/l (73,6±3,5 pg/ml ve srovnání s kontrolou (43,3 pg/ml) a 7 dní expozice 8 ul/l (56,3±1,5 pg/ml ve srovnání s kontrolou (50,3±5,6 pg/ml) (obr. 2, b).

3.4 Účinek přípravku RIPEX na imunitní potenciální enzymy

Expozice B. Alexandrina dvěma koncentracím RIPEX způsobila významné zvýšení aktivity enzymu MPO (obr. 3a) v závislosti na době expozice po 3 dnech (p=0.0{ {35}}4) a 7 dní (p=0.01). Expozice 8 µL/L RIPEX významně zvýšila aktivitu MPO (55,3±4,8 mU/mg proteinu (p=0,004) ve srovnání s 15,4±1,2 mU/mg pro kontrolu. Zatímco 16 µL/l vystavených u hlemýžďů byla aktivita (53,03 ± 2,3 mU/mg proteinu a 73,9 ± 2,8 mU/mg proteinu, p menší nebo rovno 0,05). Také koncentrace 16 µL/l způsobila významný nárůst (p=0 0,05) v aktivitě ve srovnání s 8 µL Obě koncentrace (8 a 16 µL/L) významně zvýšily (p Menší nebo rovno 0,009) aktivitu ADA ve srovnání s kontrolou (obr. 3b) po celou dobu Nárůst aktivity při koncentraci 16 µL/L. V závislosti na časových intervalech zaznamenala expozice po dobu 7 dnů významný nárůst ve srovnání s 1 dnem a 3 dny (p Menší nebo rovno 0,05). aktivita po 7 dnech byla 27,03±14 a 74,3±1,9 U/mg proteinu

3.5 Diferenciální počet hemocytů

Vyšetření vzorků hemolymfy z B. alexandrina hlemýžďů ukázalo tři morfologicky odlišné typy hemocytů; hyalinocyty, kulaté malé a rozšiřující se hemocyty. Hyalinocyty jsou charakteristické svým kruhovým tvarem, čirou, hustou buněčnou membránou a velkým poměrem jádra k cytoplazmě. Je reprezentován vysokým počtem v kontrolní skupině (56,3±0,5, 1 den). Malé kulaté buňky jsou intermediární buňky s několika cytoplazmatickými granulemi a bez pseudopodií. Šířící se hemocyty mají různé velikosti, s malým jádrem a velkými cytoplazmatickými granulemi. Jsou to fagocytární buňky, protože mohou tvořit málo a krátce se šířící pseudopodia. Expozice dvěma koncentracím RIPEX zvýšila počet hemocytů a významný nárůst byl pozorován u granulocytů hlemýžďů vystavených 8 µL/L (p=0.02) a 16 µL/L (p{{12 }}.006) po dobu 1, 3 a 7 dnů ve srovnání s kontrolou. (Tabulka 3). Léčba způsobila některé morfologické abnormality v hemocytech, jako jsou hyalinocyty s elongací filopodií, deformované granulocyty s vakuolami a rozšiřující se filopodie (obr. 4).

3.6 Účinek přípravku RIPEX na histopatologii trávicích žláz a ovotestes

Trávicí žlázy B. Alexandrina jsou složeny z tubulů a každý tubul se skládá z jedné vrstvy sloupcových epiteliálních buněk diferencovaných na trávicí a sekreční buňky, které jsou uspořádány kolem centrálního lumenu (obr. 5a). Te tubuly jsou spojeny pojivovou tkání. Expozice RIPEX způsobila některé změny, jako je degenerace pojivové tkáně. Šneci vystavení 8 ul/l vykazovali přítomnost buněčných váčků, které indikují smrt buněk a ucpání lumen. Byla pozorována nestrávená potrava (obr. 5b–d). Šneci vystavení 16 ul/l vykazovali degeneraci vystlaných buněk s některými patologickými příznaky, jako je vakuolizace a dilatace lumen. Tubul se poškodil, deformoval a nekrotizoval (obr. 5e, f).

Ovotestis kontrolních plžů B. alexandrina sestává z několika acini spojených pojivovou tkání. Každý acinus je lemován zárodečným epitelem složeným z různých stádií spermatogonie a oogonie. Tey se rozlišuje na primární, sekundární a jeden nebo dva zralé oocyty (oogonia). Zralé spermie se nacházejí ve skupinách uvnitř acinu (obr. 6a). Histologická struktura ovotestis exponovaných hlemýžďů se změnila po 7 dnech expozice RIPEXu. U hlemýžďů vystavených 8 µL/l byl pozorován rostoucí počet spermií, nekrotické spermie a atrofie. Deformace mužských nebo ženských gametocytů a degenerace acini byly také hojné. Také expozice 16 µL/l způsobila, že acini více degenerovali a zvýšila se nekróza (obr. 6b–e).

4. Diskuze

V zemědělských postupech se PGR široce používají. Tyto látky mají četné škodlivé účinky na živé organismy. Tato studie se zaměřila na posouzení toxikologických dopadů RIPEX (organofosforový pesticid obsahující ethephon obsahující 48 procent etefonu jako aktivní složku plus 52 procent inertních složek). Testy toxicity RIPEX s B. Alexandrina ukázaly, že 1-denní hodnoty LC50 a -LC90 byly 39,95 a 73,6 µl/l, v daném pořadí.

Tyto výsledky podpořili [54], kteří prokázali hodnotu EC50 pro ethephon proti embryím Daphnia magna (125 mg/l po 48 hodinách expozice). Tis pesticid se zdá být pro Biomphalaria toxičtější než jiné formulace organofosforových sloučenin, jako je chlorpyrifos (LC50 9,6 mg/l; [30] a profenofos (LC50 1,10 mg/l; [10]) .

Mezi tvorbou volných kyslíkových radikálů a produkcí antioxidačních molekul za normálních fyziologických podmínek existuje homeostáza [23]. Nerovnováha mezi antioxidačním a oxidačním systémem je známá jako oxidační stres [32]. U eukaryot i prokaryot jsou superoxiddismutáza (SOD) a glutathion S-transferázy klíčovými antioxidačními enzymy, které mohou odstraňovat příliš mnoho kyslíku z volných radikálů a chránit organismus před oxidačním poškozením [34, 38].

Podílejí se také na detoxikaci některých xenobiotik [8, 15]. Tato studie odhalila, že vystavení hlemýžďů B. alexandrina subletálním koncentracím RIPEX 48 procent EC narušilo antioxidační aktivitu exponovaných hlemýžďů. Akutní expozice (24 h) má tendenci snižovat celkové aktivity SOD a GST u hlemýžďů, následuje zvýšení po 3 dnech expozice a ostrá inhibice po 7 dnech expozice.

Hladiny MDA byly významně vyšší u exponovaných hlemýžďů ve srovnání s kontrolami po všech expozičních obdobích. Tyto výsledky naznačují stav oxidačního stresu u hlemýžďů vyvolaný expozicí RIPEX. U hlemýžďů došlo k náhlému poklesu enzymových aktivit po 1 dni expozice a pokusili se kompenzovat nadprodukcí enzymů po 3 dnech expozice. Do 7. dne expozice však hlemýždi nebyli schopni překonat nadměrnou produkci reaktivních forem kyslíku, což se projevilo zvýšením hladiny MDA (peroxidace lipidů), což vedlo k inhibici produkce antioxidačních enzymů. MDA patří mezi hlavní účinky peroxidace lipidů a má schopnost narušit výměnu iontů v buněčné membráně, modifikovat permeabilitu iontů a ovlivnit funkci enzymů [9].

Mechanismus RIPEX 48% EC-indukovaného oxidačního stresu v Biomphalaria se může lišit od jiných organofosforových pesticidů. Způsobil inhibici enzymu až po 7 dnech expozice. Chlorpyrifos však například způsobil zvýšení aktivity SOD a snížení aktivity GST u B. Alexandrina krátce po 1 dni expozice [30]. Testosteron a estradiol hrají zásadní roli v reprodukci plžů B. alexandrina [20, 45]. Změny těchto hormonů lze použít jako koncový bod chemické toxicity [14]. RIPEX 48 procent EC způsobil hormonální poruchu u šneků B. alexandrina.

Hlemýždi vystavení 16 µL/l vykazovali významné zvýšení testosteronu po 3 dnech expozice. RIPEX však snížil hladiny hormonů u hlemýžďů vystavených 8 µl/l po 1 a 3 dnech expozice. Pokud jde o estradiol, hormon má tendenci se zvyšovat u exponovaných hlemýžďů. Nejvýraznější zvýšení však bylo pozorováno u hlemýžďů vystavených 16 µL/l po 3 dnech expozice. RIPEX proto může mít endokrinní narušující účinek na plže B. alexandrina. Podobné nálezy zaznamenali také Ibrahim a Hussein [30], kteří uváděli významné zvýšení hladin testosteronu i estradiolu po expozici B. Alexandrina subletálním koncentracím chlorpyrifosu 48 procent EC. Jiné agrochemikálie, jako je herbicid oxyfluorfen (24 procent EC), však snížily hladiny testosteronu a 17-estradiolu u B. Alexandrina po dvou týdnech expozice [31]. Myeloperoxidáza (MPO), která přeměňuje H2O2 na kyselinu chlornou (HOCl), silné antibiotikum, je často považována za základní kámen cytotoxicity zprostředkované ROS a existují silné důkazy, že hemocyty měkkýšů mají aktivitu MPO srovnatelnou s aktivitou savčích fagocytů [22 44, 49]. Adenosindeamináza (ADA) hraje důležitou roli v imunitním systému obratlovců a bezobratlých, včetně hlemýžďů Biomphalaria [51].

Jeho nedostatek je spojen s kombinovanou imunodeficiencí [25]. Expozice B. Alexandrina 8 a 16 µL/L RIPEX způsobila významné zvýšení aktivit enzymů MPO a ADA v trávicích žlázách hlemýžďů po 3 a 7 dnech expozice. Zdá se, že zvýšení enzymové aktivity je závislé na čase a shodě. Trávicí žlázy jsou primárním místem pro metabolismus chemických kontaminantů u plžů [46]. Nárůst těchto enzymů naznačuje imunologickou odpověď B. Alexandriny na toxicitu RIPEX, protože například MPO může přeměňovat znečišťující látky na volné radikály prostřednictvím abstrakce jednotlivých elektronů [41], což může vést k redoxním cyklům, které produkují oxyradikály a případně iniciovat peroxidace lipidů [36].

Šneci primárně spoléhají na cytotoxicitu zprostředkovanou buňkami, aby se zbavili napadajících objektů [5, 53]. Nejvíce dobře prozkoumanými obrannými buňkami u plžů jsou hemocyty. Hemocyty postupují z malých, zaoblených, agranulárních buněk do velkých, granulárních, šířících se buněk prostřednictvím intermediárních fází [6, 53]. Granulované hemocyty většinou fagocytují cizorodé látky [28]. Expozice dvěma koncentracím RIPEX 48 procent EC zvýšila počet hemocytů. Ve vzorcích odebraných od exponovaných hlemýžďů se objevily hyalinocyty s vakuolami. Významné zvýšení bylo zaznamenáno v granulocytech, což ukazuje na zvýšení buněčné imunitní odpovědi hlemýžďů na provokaci toxicity RIPEX. Ibrahim a Hussein [30] ukázali, že expozice B. Alexandrina chlorpyrifosu měla negativní dopad na morfologii a celkový počet hemocytů exponovaných plžů.

Světelná mikroskopie dále odhalila, že některé hyalinocyty měly scvrklá jádra, neúplné buněčné dělení a tvorbu pseudopodií. Tyto účinky na počet hemocytů a morfologii B. Alexandrina mají negativní dopad na imunitu hlemýžďů, protože tyto organismy jsou z velké části závislé na hemocytech, pokud jde o jejich ochranu před cizími setkáními. Histopatologická vyšetření trávicích žláz B. Alexandriny ukázala, že expozice RIPEXu po dobu 7 dnů způsobila některé patologické změny, jako je degenerace pojivové tkáně, buněčná tvorba puchýřů a degenerace vystlaných buněk v lumen. Trávicí tubuly se poškodily, deformovaly a nekrotizovaly. Histopatologie je důležitým koncovým bodem při hodnocení patologických změn u vodních živočichů vystavených kontaminantům [33].

Vysoká citlivost trávicích žláz je přímo připisována jejich roli v homeostáze, příjmu kontaminantů, trávení, metabolismu a detoxikačním procesu [24]. Pozorované účinky mohou být způsobeny přímou akumulací RIPEX v buňkách trávicí žlázy nebo nepřímo prostřednictvím oxidačního poškození způsobeného produkcí reaktivních forem kyslíku (ROS). Extrémní oxidační stres je skutečně spojován s poškozením tkáně zahrnujícím řadu fyziologických procesů a proměnných prostředí, včetně nekrotické a apoptotické buněčné smrti [19]. Kromě toho expozice dvěma různým koncentracím RIPEX po dobu 7 dnů změnila histologickou strukturu ovotestes se zvýšením počtu nekrotických spermií, atrofií, deformací mužských nebo ženských gametocytů a degenerací acini. Tyto změny pravděpodobně sníží reprodukční potenciál plžů a tím i jejich zdatnost ve vodním systému.

5 Závěr

Subletální koncentrace RIPEX 48 procent EC měly mnohostranný účinek na šneky Biomphalaria alexandrina. U hlemýžďů chronická expozice RIPEXu snížila produkci antioxidačních enzymů SOD a GST a zároveň zvýšila produkci MDA, což ukazuje na stav oxidačního stresu. Dále měl endokrinní narušující účinek na slimáky, o čemž svědčí celkové zvýšení hladiny steroidních hormonů. Zdá se, že imunitní systém šneka je vůči expozici RIPEX zranitelný. Způsobil významné zvýšení aktivity enzymů MPO a ADA v trávicích žlázách hlemýžďů po 3 a 7 dnech expozice a také významné zvýšení granulocytů u exponovaných skupin hlemýžďů. Patologické abnormality v exponovaných trávicích žlázách hlemýžďů a ovotestes byly také známkami histopatologických změn způsobených expozicí RIPEXu. Tato zjištění ukazují, že RIPEX poškozuje vodní faunu, včetně B. Alexandriny. Plži Tus, Biomphalaria lze použít jako bioindikátory znečištění životního prostředí pomocí regulátorů růstu rostlin.

Mechanismus Cistanche zvyšuje účinek testosteronu

Bylo zjištěno, že Cistanche zvyšuje hladinu testosteronu několika způsoby. Za prvé, obsahuje sloučeniny známé jako echinakosid a akteosid, u kterých bylo prokázáno, že zvyšují produkci luteinizačního hormonu (LH) v hypofýze. LH stimuluje Leydigovy buňky ve varlatech k produkci testosteronu. Cistanche také obsahuje polysacharidy a fenylethanoidní glykosidy, u kterých bylo prokázáno, že mají antioxidační a protizánětlivé vlastnosti. To může pomoci snížit oxidační stres a zánět ve varlatech, což může narušit produkci testosteronu. Navíc bylo zjištěno, že Cistanche zvyšuje expresi genů zapojených do syntézy testosteronu a snižuje aktivitu enzymů, které rozkládají testosteron, jako je {{1} }alfa-reduktáza. Celkově se předpokládá, že kombinace těchto mechanismů přispívá k účinkům Cistanche na zvýšení testosteronu.