Autofluorescence jako neinvazivní biomarker koncových produktů stárnutí a pokročilé glykace u Caenorhabditis Elegans

Pro posouzení užitečnosti autofluorescence jako neinvazivního biomarkeru stárnutí u Caenorhabditis elegans jsme měřili autofluorescenci jednotlivých hlístic pomocí spektrofluorimetrie. Fluorescence každého červa se s věkem zvyšovala. Zvířata s nižší intenzitou fluorescence vykazovala delší očekávanou délku života. Když byly proteiny extrahované z červů inkubovány s cukry, intenzita fluorescence a koncentrace konečných produktů pokročilé glykace (AGE) se v průběhu času zvyšovaly. Ribóza zesílila tyto změny nejen in vitro, ale také in vivo. Blokátor glykace rifampicin toto zvýšení fluorescence potlačil. Hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením odhalila, že vitellogeniny se hromadily ve starých červech a glykované vitellogeniny emitovaly šestkrát vyšší fluorescenci než naivní vitellogeniny.Nárůst fluorescence se stárnutím pochází z glykovaných láteka proto by mohl sloužit jako užitečný neinvazivní biomarker AGE.Cistanchemůže sloužit jako nový model pro hledání anti-AGE faktorůa studovat vztah mezi AGEs a ​​stárnutím.

CistancBylinky pro anti-AGE faktory

ÚVOD

Střední délka života u lidí se ve vyspělých zemích během posledního půlstoletí dramaticky prodloužila. Nicméně,progresivní poškození se stárnutím má škodlivé účinky na fyziologické funkce, známý jakostárnutí, aonemocnění související se stárnutímtaké přibývajípoměr s dlouhověkostí. Rozšíření"zdraví" je nyní nutné spíše než samotné prodlužování životnosti. Zásahy, které zpomalují stárnutí a prodlužují zdraví, jsou žádoucí. Brenner a kol. představilCaenorhabditis elegans, což je malý, volně žijící půdní háďátko, které se živí bakteriemi, pro použití vmolekulárně genetické studie diferenciace a vývoje.

Následně byl červ široce používán jako experimentální systém pro biologické studie, včetně výzkumu stárnutí, protože toto zvíře'jednoduchost, transparentnost, snadná kultivace, krátká životnost a vhodnost pro genetickou analýzu2. Senescence lze u červa vyšetřit útlumem pohybových schopností, odolností vůči stresu, kognitivními schopnostmi a pumpováním hltanu a akumulací tzv. věkového pigmentu lipofuscinu3–5 .

Různé chemikálie, včetně antioxidantů a několika léků, jsou kandidáty na prevenci stárnutí6,7. Navíc, protože jsme uvedli, že délka zdraví a životnost háďátek by mohla být prodloužena krmením probiotickými bakteriemi8,9, dlouhověkost prospěšných bakterií prokázala i řada laboratoří10–12. Účinky na dlouhověkost byly zkoumány pomocí křivek přežití, ale takové studie na červech vyžadují více než 3 týdny, a to i přes relativně krátkou životnostC. elegans. K vyhodnocení účinků intervencí proti stárnutí jsou žádoucí vhodné a neinvazivní indikátory stárnutí, aby bylo možné sledovat vliv u jednotlivých červů a (v konečném důsledku) u lidí jako konečného cíle.

Lipofuscin, takzvaný stařecký pigment, se široce používá jako indikátor stárnutí. Přesný vztah mezi autofluorescencí, stárnutím a délkou života červa však zůstal nejasný. Gerstbrein a kol. uvedli, že věkové pigmenty jsou platnými reportéry zdraví háďátek13, zatímco Coburn a kol. uvedli, že modrá fluorescence (excitace/emisní vlnové délky se středem na 340/430 nm) slouží jako marker smrti několik hodin před a po smrti vC. elegans14. Bylo navrženo, že zvýšení modré autofluorescence v průběhu času pozorované u stárnoucích populacíC. elegansnemusí odrážet rychlost stárnutí nebo zdravotní stav populace jako takové, ale místo toho podíl mrtvých nebo téměř mrtvých jedinců ve vzorku15.

Konečné produkty pokročilé glykace (AGE) přitahovaly vědeckou pozornost16 protože se tvoří ve velkém množství při cukrovce, ale také při fyziologickém stárnutí a vedou k oxidativnímu stresu. AGE jsou komplexní sloučeniny tvořené neenzymatickými reakcemi mezi redukujícími cukry a aminoskupinami v proteinech, lipidech nebo nukleových kyselinách; Schiffovy báze a produkty Amadori jsou pak tvořeny Maillardovými reakcemi za vzniku AGE. Obsah AGE je vysoký u pacientů s diabetem, revmatoidní artritidou, Alzheimerem's nemocí a dalšími nemocemi17–19. U pacientů s diabetem akumulace AGE dobře koreluje se závažností mikrovaskulárního onemocnění a stoupá s věkem. Zbývá však objasnit, zda AGE představují příčinu patogeneze nebo jsou pouze sekundárními produkty. AGE jsou také považovány za možné příčiny stárnutí20,21, jak vyplývá ze zjištění v aC. elegansmodel toxicity cukrů22,23.

Metoda systematického enzymového imunosorbentního testu (ELISA) byla vyvinuta s využitím protilátek se specificitou pro několik AGE sloučenin.24–26. Jsou však také vyžadovány neinvazivní metody umožňující hrubé odhady úrovní AGE. Protože je údajně několik AGEsfluorescentní a s nimi spojenéflintenzita uorescence vykazuje signififinemůže korelovat s hladinami naměřenými testem ELISA27, jsme zkoumali, zda totofluorescence by mohla být použita jako alternativní marker pro sledování stavu AGE a stárnutí v aC. elegansModelka.

Pro ověření, zda pozorovánofluorescencepouze odráží smrtfluorescenceuvádí Coburn et al., červi byli zkoumáni sledovánímfluorescence jednotlivých červů zatímconačasování zániku příslušných zvířat. Kromě toho,účinky inhibitorů tvorby AGE nafluorescencea akumulace AGE byly také zkoumány pro ověření užitečnostiC. elegansjako modelové zvíře pro výzkum AGE.

VÝSLEDEK

Autofluorescence extrahovaných proteinů jako biomarker stárnutí a AGEs u červů

Fluorescenční spektrofotometrie extrahovaných proteinů ukázala, že excitace při 325–365 nm vytvořilo 17-denní červyfluoresce s nejvyššími emisemi ze 400–430 nm (vrchol 420 nm) interval (obr.1A). Modráfluorescence byla poměrně nižší během mladé dospělosti (3-denní až 5-denní), ale postupem času rostla (u 7-denních zvířat) (obr.1b). Lipofuscin, takzvaný stařecký pigment, vyzařuje červenoufluorescence (excitace na 530–560 nm, emise při 585–645 nm)15; v naší předchozí studii byl tento marker detekován u červů v pozdním věku (více než 13-denní)9. 

Od autafluorescence nalezená v této studii se objevila v dřívější fázi a postupem času se zvyšovala, modrá autoflOčekávalo se, že uorescence bude lepším biomarkerem pro sledování stárnutí. Protože je známo, že několik sloučenin AGE je autofluorescenční27, zkoumali jsme vztah mezi obsahem AGE a modrou barvoufluorescence westernovým přenosem, ve kterém protilátka proti NεByl použit -(karboxymethyl)lysin (CML), reprezentativní AGE. Přenos ukázal, že vynikající pás byl zesílen v průběhu času (obr.1c a doplňkový obr. 1). Kvantifikace oblasti skutečně ukázala zvýšený AGE (obr.1d), ačkoli CML není autofluorescenční.

Chcete-li zjistit, zda je autofluorescence nepřímo indikovala anzvýšení AGE vzniklých Maillardovou reakcí, proteinyextrahované z červích homogenátů byly asepticky inkubovány po dobu až 4 týdnů s redukujícími cukry, jako je glukóza, ribóza a fruktóza. TheflUorescence proteinů se v průběhu času zvýšila v přítomnosti cukrů, zatímco nedošlo k žádnému výraznému zvýšenífluorescence v reakcích prováděných bez cukrů (obr.2A). Červí proteiny se stalyfluorescenční přes glykaci i in vitro. Mezi reakcemi provedenými s každým ze tří cukrů, ty s ribózou produkovaly nejvyššífluorescence, následovaná dvěma dalšími cukry. TentofiTo lze vysvětlit zprávou Bunna a Higginse, ve které reaktivita každého monosacharidu s aminoskupinami k vytvoření vazeb Schiffovy báze závisí na rozsahu, v jakém existuje v otevřené (karbonylové) struktuře spíše než v kruhu ( hemiacetalová nebo hemiketalová) struktura a rychlosti reaktivity se zvýšily v řádu ribózy (10.0), fruktózy (4,5) a glukózy (0,6) (×10−3 mM−1 h−1 ), resp28.

Obr. 1 Fluorescenční spektrofotometrie a AGEs vzorků červích proteinů. anGrafy matice excitační emise (EEM) autofluorescence z lyžovaných červů u 3-denních a 17-denních. Theflhladiny uorescence při emisní vlnové délce v EEM grafech jsou zobrazeny jako barevné tepelné mapy. Sto červů (divokého typu N2), každý 3-denních a 17-denních, bylo lyžováno ve 3 ul lyzačního pufru a 4 ul 15% SDS. Proteiny byly uvolněny cykly zmrazování a rozmrazování a fotoluminiscenční spektra byla shromážděna pomocí afluorescenční spektrofotometr (Hitachi FL-4500). Fluorescenční vlastnosti lyžovaných nematod byly analyzovány pomocí EEMfluorescenční spektroskopie. Excitace na 325–365 nm vytvořilo 17-denní červyfluoresce s nejvyššími emisemi ze 400–430 nm intervalu odpovídající trajektorie jako sérieflintenzity uorescence, zatímco 3-jednodenní mladí červi nikolifluoresce. Vícerozměrná analýza (buzení jednou vlnovou délkou s více vlnovou emisí a synchronní skenovánífluorometrie) poskytly EEM grafy sestávající z excitace s jedním skenováním.b Úrovně autofluorescence (ex 340/em 360–600) pomocí vzorků bílkovin z červů extrahovaných ze zvířat každé věkové skupiny (3–13 dní starý). Červi (divoký typ N2) se shromáždili do zkumavek, promyliPěta lýzovány v každé zkumavce. Vzorky byly poté rozemlety pomocí Mini Cordless Grinder (Funakoshi, Tokio, Japonsko), aby se uvolnil protein. Obsah proteinu byl kvantitativně měřen, jak je popsáno v metodách. Afluorescenční spektrum bylo stanoveno pro každý 30-ul vzorek (obsahující 1,5μg celkového proteinu) pomocí multimódové čtečky mikrodestiček s mřížkou model SH-9000Lab (Corona Electric, Ibaraki, Japonsko). Každé měření bylo provedeno třikrát.c Western blot analýza AGE CML ve vzorcích extrahovaných z populací červů (divokého typu N2) různého stáří. Je ukázána reprezentativní fotografie tří reprodukovatelných experimentů. Bloty byly odvozeny z různých částí stejného gelu (zobrazeno na doplňkovém obrázku 1) a byly zpracovány paralelně.d KvantifikaceAGEs ve western blotech pomocí denzitometrie. Pásy obklopené pravoúhlými rámy na Obr.1c byly kvantifikovány a data ze tří reprodukovatelných experimentů jsou ukázána jako průměr ± SE.

respektive.

K přímému posouzení, zda se zvyšuje vflUorescence v přítomnosti cukrů byla způsobena tvorbou AGE, k detekci reprezentativní AGE sloučeniny CML byla použita ELISA. CML se v těchto reakcích zvýšila a hladina ve vzorcích inkubovaných s ribózou byla až téměř sedmkrát vyšší než u kontrol inkubovaných bez cukrů po dobu 4 týdnů (obr.2b). Ve srovnání s ribózou byla množství CML produkovaná s glukózou nebo fruktózou nízká, podobně jako CML u kontroly; tentonálezje v souladu s předchozí zprávou29.

Autofluorescence jako biomarker stárnutí a AGEs in vivo

Dále jsme testovali, zdafluorescence mohla být detekována nejen z extrahovaných proteinů, ale také u živých červů. Když byla autofluorescence jednotlivých červů odečtena na fólii z plastového obalu natažené na 384-jamkové destičky pomocí multimódové čtečky mikrodestiček, byly výsledky spektrofotometrie podobné jako u extrahovaných proteinů (obr.3A). Individuální intenzita modréfluorescence se postupem času zvyšovala (obr.3b a doplňkový obr. 2), přičemž žádná červenáfltouto metodou byla detekována uorescence. Od modréfluorescence (340/430 nebo 350/460 nm) byla dříve hlášena jako spojující se smrtí14,15Analýza byla provedena s vyloučením dat získaných během 2 dnů před zvířetem's smrtí. Nicméně modráfluorescence červů se postupem času stále zvyšovala: nárůstfluorescence proto musí být částečně nezávislá na smrtifluorescence. Abychom otestovali, zda může být autofluorescence biomarkerem stárnutí, zkoumali jsme, kolik dní mohou červi přežít poté, co byla autofluorescence naměřena na 13-denních červech. Očekávaná délka života každého červa byla nepřímo úměrná intenzitě autofluorescence (obr.3c).

TheflIntenzita uorescence byla také zvýšena u červů pěstovaných s ribózou (obr.4A); životnost těchto červů byla signififio něco kratší než u kontrolních červů (obr.4b). Naproti tomu červi pěstovaní na médiu obsahujícím rifampicin, blokátor AGEs, emitovali méněfluorescence ve srovnání s kontrolními červy pěstovanými bez rifampicinu (obr.4C); účinek rifampicinu na dlouhověkost byl již dříve hlášen30. dáledaf-2, reprezentativní mutant pro dlouhověkost, také autofluorescoval méně ve srovnání s divokým typem (obr.4d), zatímcoflIntenzita uorescence divokého typu se zvyšovala se stárnutím.

Část zflOčekává se, že uorescence je odvozena ze sloučenin produkovaných v souvislosti se smrtí zvířat. Modráfluorescence by mohla být markerem smrti, který Coburn et al. pozorován vC. elegansněkolik hodin před a po smrti; modré světlo by pocházelo z kyseliny anthranilové, která se tvoří bezprostředně po smrti červů14. Údajně smrtfluorescence je emitována glykosylovanou formou kyseliny anthranilové produkované kynureninovou cestou14. kyu-1Od mutantních červů, kteří postrádají kynureninázu, se proto očekávalo, že nevydají smrtfluorescence. Avšak i v přítomnosti této mutace se zdálo, že staří červi stále emitují vyššífluorescencenež mladší červi (obr.5a) a červi pěstovaní na nematodovém růstovém médiu (NGM) doplněném ribózou vykazovali znakyfifio dost vyššífluorescence než ty, které rostou v nepřítomnosti doplňkové ribózy nebo s kontrolním cukrem sorbitolem (obr.5b). Životnost červů udržovaných s ribózou byla zjevně kratší než u ostatních (obr.5c), což naznačuje pro-stárnutí účinků AGEs u červů.

Identifikace autofluorescenčních materiálůK identifikaci látek, kteréflu stárnoucích zvířat byl na extrahovaných proteinech proveden test LC MALDI. Šest nejhojnějších proteinů nalezených v každém vzorku je uvedeno v tabulce1; zejména vitelogeniny a elongační faktory byly obohaceny mezi nejlepší-45fluorescující proteiny u starších červů. Kromě toho jsme pomocí MS s vysokým rozlišením a výpočetního prostředí Mascot hledali proteiny, které byly hojnější u 15-denních červů než u 3-denních červů, a identifikovali jsme 180 proteinů (doplňkové tabulky 1–3). Ačkoli vitellogeniny byly opět obohaceny (přítomné na šestinásobně vyšších hladinách u starších červů než u mladých dospělých), hladiny prodlužovacích faktorů byly v obou skupinách podobné (doplňkový obr. 3). Aby se ověřilo, zda mohou být tyto proteiny glykovány za vzniku autofluorescenčních AGE, byly purifikovaný elongační faktor a vitellogenin inkubovány s ribózou in vitro. Fluorescence emitovaná z glykovaných vitellogeninů vykazovala spektra podobná těm, která byla získána se surovými extrakty získanými z 17-denních červů (obr.6A). I když je známo, že riboflavinfluoresce jsme zjistili, že vlnová délka emise riboflavinu byla odlišná odvýtažky z červů. Fluorescence FL glykovaného vitellogeninu a elongačního faktoru byla šestkrát a třikrát (v tomto pořadí) fluorescence neglykovaných proteinů po 23 dnech in vitro (obr.6b).

AGE detekované westernovým přenosem s anti-CML protilátkami se také postupem času zvýšily z 3-denních na 13-denní červy in vivo (obr.1C). Současným westernovým přenosem s anti-vitellogeninovými protilátkami jsme zjistili, že anti-CML signály měly pásy stejné velikosti jako vitellogeniny (obr.6C). Přestože se vitellogeniny YP170 a YP115 během tohoto období akumulovaly s věkem, intenzita signálů AGE byla zesílena výše než zvýšení množství vitellogeninu YP170 (obr.6d). Fluorescenční mikroskopie odhalila, že 13-denní červi (obr.7d–f, sloupce 2 a 3) emitované signififinepatrně intenzivnější modré světlo než 3-denní mladí dospělí (obr.7a–c, sloupce 2 a 3; Obr.7G); gonády také vypadaly jasněji (obr.7d–f, sloupce 1 a 2). CML je reprezentativní AGE, i když CML sama o sobě není fluorescenční. Je známo, že pentosidin, další AGE, je fluorescenční. Nicméně imunobarvení ani anti-CML, ani anti-pentosidinovými protilátkami neposkytlo výrazné rozdíly mezi starými a mladými červy (data nejsou uvedena). Anti-CML však vykazovala difuzní šíření přes tkáně, zatímco anti-pentosidin toto téměř nevykazoval.