Aryl uhlovodíkový receptor-závislý
Aug 29, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
2.2.6. Kultivace primárních lidských EC
Lidský primární EC (Lonza, Kolín nad Rýnem, Německo) byl kultivován v kompletním endoteliálním bazálním médiu (EBM) (Lonza, Kolín nad Rýnem, Německo) doplněném 1 ug/ml hydrokortizonu, 12 ug/ml extraktu z hovězího mozku, 5 0 ug/ ml gentamicinu, 10 ng/ml lidského epidermálního růstového faktoru a 10 procent (o/v) fetálního telecího séra při 37 stupních a 5 procentech CO až do třetí pasáže. Po oddělení pomocí 0,05 procenta (o/o)trypsinu/EDTA (Thermo Scientific, Schwerte, Německo) byly buňky kultivovány v 6 cm kultivačních miskách nebo 6jamkových kultivačních miskách po dobu alespoň 18 hodin před transfekcí nebo ošetřením.
2.2.7. Přechodná transfekce EC
Buňky byly transfekovány, jak bylo popsáno dříve [65]. Stručně řečeno, EC byl transfekován pomocí SuperFectTransfection Reagent (Qiagen, Hilden, Německo) podle pokynů výrobce. Nadměrná exprese nebo knockdown AhR bylo dosaženo po 24 nebo 48 hodinách. Účinnost transfekce po nadměrné expresi byla přibližně 40 procent.
2.2.8. Scratch Wound Assay of EC
Pro zkoumání migrační kapacity EC byly provedeny testy škrábanců, jak bylo popsáno dříve [66]. Podrobně byly rány zasazeny do buněčné monovrstvy pomocí buněčné škrabky podél linie stopy. Po poranění byly nepřichycené buňky odstraněny jemným promytím.extrakt z cistanche salsyOšetření kurkuminem bylo provedeno přímo po usazení rány. Cur-cumin byl rozpuštěn v DMSO a použit v konečné koncentraci 7,5 uM. EC migrace byla kvantifikována barvením buněk 5 ug/ml 4',6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) (Carl Roth, Karlsruhe, Německo) v PBS po dobu 5 minut poté, co byly buňky fixovány se 4 procenty (v/v) paraformaldehydu po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Snímky byly pořízeny pomocí fluorescenčního mikroskopu Zeiss AxioVision Observer D1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Německo)) s použitím 200-zvětšení. Buňky migrované do rány ze stopové linie byly automaticky spočítány pomocí funkce analýzy částic Image]1.52a]67I poté, co byla oddělena překrývající se jádra.
Cistanche může proti stárnutí
2.2.9. Imunobarvení EC
EC byla fixována 4% (o/v) paraformaldehydem po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Po permeabilizaci a blokování v 0,3% (o/o)Triton-X 100 a 3% (o/u)normálním kozím séru v PBS byly buňky inkubovány s králičí protilátkou proti AhR(1:100, Abcam, Cambridge, Spojené království) nebo Nrf2 (klon D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, Frankfurt, Německo) zředěné v 1% (o/v) normálním kozím séru v PBS přes noc při 4 °C. Poté byly buňky promyty PBS a inkubovány s Alexa 594-spřaženým kozím anti-králičím IgG (1:500, Invitrogen, Darmstadt, Německo) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě.cistanche stonekPro barvení aktinu byly buňky inkubovány s Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1:70, Invitrogen, Darmstadt, Německo) po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Jádra byla kontrastně obarvena 0,5 ug/ml DAPI v PBS po dobu 5 minut při teplotě místnosti a buňky byly upevněny pomocí ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen, Darmstadt, Německo). Fluorescenční snímky byly pořízeny pomocí fluorescenčního mikroskopu Zeiss AxioVision Observer D1 se zvětšením 400× nebo 200×.
2.2.10. qPCR v buňkách
Celková buněčná RNA byla izolována kombinací lýzy v TRIzolTM s následným zpracováním pomocí RNeasy Mini Kit (Qiagen (Hilden, Německo)) podle pokynů výrobce. Syntéza cDNA byla provedena pomocí QuantiTect9 Reverse Transscription Kit (Qiagen (Hilden, Německo)) s 1 ug RNA podle pokynů výrobce. Relativní hladiny transkriptů byly stanoveny pomocí PCR s použitím 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix a tepelného cykléru Rotor-Gene Q (Qiagen (Hilden, Německo)). Jako reference byl použit transkript pro ribozomální protein L32 (rpl32) a relativní exprese byla vypočtena metodou AC [68]. Byly použity následující páry primerů zahrnujících Intron:kapitál (přírůstkové číslo genu NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(gen přírůstkové číslo NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(přírůstkové číslo genu NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTTGGGTTC-3';rpl32(přírůstkové číslo genu NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCAGCAC{{ 41}}'.
2.3. Myši
2.3.1. Myší linie a chov
Žena 8-12-týdenní ("mladá") a 18-měsíční ("stará") B6 s deficitem AHR.{6}}AHRtmlBra/J (Schmidt et al., 1996; uvedeno zde jako AHR-KO) myši byly chovány jako heterozygoti ve zvířecím zařízení IUF. Pro kontrolu se použili sourozenci divokého typu. Myši byly chovány a chovány za specifických podmínek bez patogenů v cyklu světlo-tma 12/12 h a dostávaly standardní chow(sniff"MZ, SNIFF, Soest, Německo) ad libitum. 2.3.2.qPCR u myší
Celková RNA byla izolována z orgánových tkání tří myší s deficitem WT a tří AHR pomocí TriZol[. Poté bylo 400 ng RNA reverzně transkribováno pomocí reverzní transkriptázy M-MLV (Promega, Madison, WI, USA) a náhodných hexamerových primerů. Hladiny genové exprese byly měřeny duplicitně pro každou myší tkáň na Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Německo), v 15 μl konečného objemu, obsahujícím 7,5 μl Rotor Gene SybrGreen™ (Biorad, Feldkirchen, Německo), 1 uM každého primeru ,1,5 μl cDNA a vody bez RNázy. Účinnost primeru byla mezi 90 procenty a 146 procenty. Sekvence primerů a účinnosti viz tabulka S2. Úrovně exprese byly kalibrovány na expresi RPS6 jako provozního genu ve stejném vzorku pomocí {{13 }}metoda CT [69].
2.4. Analýzy In Silico
Homologické modelování CeAhR LBD
Strukturní model C. elegans AhR LBD (zbytky 267-372) byl vytvořen homologním modelováním. Rentgenové struktury domén PASB homologních členů rodiny bHLH-PAS sdílejících nejvyšší sekvenční identitu (asi 20 procent) s CeAhR PASB byly použity jako šablony: cirkadiánní lokomotorické výstupní cykly kaput (CLOCK, PDB: 4F3L), neuronální PAS doménu obsahující protein 3 (NPAS3, PDB:5SY7), hypoxií indukovatelné faktory 20 (HIF2o, PDB:3H82,4ZP4,3F1N) a lo(HIFlo, PDB:4H6J). Model byl získán pomocí MODELLER[70-72].výhody a vedlejší účinky cistanche tubulosaOptimální model byl vybrán z 10 vytvořených na základě nejlepšího DOPE SCORE [73]. Kvalita modelů byla hodnocena pomocí PROCHECK [74]. Sekundární struktury byly přiřazeny DSSPcont [75]. Vazebná dutina v modelovaných LBD byla charakterizována pomocí serveru CASTp[76]. Vizualizace modelů byla provedena pomocí PYMOL[77].
2.5. Statistická analýza
Pokud není uvedeno jinak, statistické analýzy byly provedeny v GraphPad Prism (verze 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA). Pro testy délky života a zdraví byla provedena statistická analýza pomocí OASIS[53]. Statistická analýza dat microarray byla provedena v R (R Foundation (Vídeň, Rakousko)). Boxplots byly vytvořeny v GraphPad Prism (verze 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) a ukazují medián (čára), 25-75-tý percentil (box) a 10-90-tý percentil (vousky).
3. Výsledky
3.1. Kurkumin podporuje rozsah zdraví způsobem závislým na AhR a nezávislým způsobem
Ztráta ahr-1 podporuje zdraví a délku života C.elegans v bazálních podmínkách[14] a negativně ovlivňuje vlastnosti související s věkem v reakci na savčí modulátory AhR, jako je benzo[a]pyren (BaP), UVB světlo a mikrobiota [25]. Dietní polyfenoly, jako je kur-kumin, tvoří důležitou skupinu savčích modulátorů AhR s účinky na dlouhověkost u C. elegans [78,79]. Zkoumali jsme tedy účinek kurkuminu na prodloužení života na jeho závislost na ahr{10}}. Kurkumin reprodukovatelně a významně prodloužil délku života a zdraví C. elegans způsobem závislým na ahr{12}}(obrázek 1A,B). Již dříve jsme ukázali, že ztráta ahr-1 také prodlužuje životnost u modelů Huntingtonovy choroby a Parkinsonovy choroby, přičemž svalová nadměrná exprese polyglutaminu (polyQ40) náchylného k agregaci (polyQ40) a -synukleinu ( -syn) současně zvyšují jejich obsah proteinových agregátů [25]. Je zajímavé, že léčba kurkuminem zvýšila počet agregátů polyQ40 a -syn ve stejném rozsahu jako ztráta funkce ahr-7 (obrázek 1C). Kurkumin také podporoval délku života a pohybové schopnosti v těchto modelech onemocnění (obrázek 1DE), ale účinky ztráty ahr-1 a suplementace kurkuminem byly aditivní v pozadí PolyQ (obrázek 1D), což odhalovalo nezávislé ochranné funkce AHR-1- kurkuminu alespoň v tomto ohroženém pozadí.
Obrázek 1. Kurkumin podporuje zdraví způsobem závislým a nezávislým na AHR-1-. Křivky životnosti (A) a zdraví (B) háďátek ošetřených DMSO nebo kurkuminem wt a ahr-1. Křivky přežití ukazují souhrnná data o 290-300 červech/stav v 5 experimentech. Statistický test: log-rank test, # významnost vs. DMSO,*významnost vs.wt, Bonferronip-hodnota<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>
3.2.ugt-45 Zprostředkovává účinky kurkuminu a ahr-1 proti stárnutí
Při hledání možných následných ahr-1-závislých efektorů kurkuminu jsme zvolili cílené a nestranné přístupy. Zkoumali jsme expresi klasických savčích cílových genů AhR a zaměřili jsme se na geny Cyp, protože kurkumin mění expresi CyplA1 a CyplB1 v savčích buňkách [80,81]. Kvantifikace 47 různých cypů u C.elegans pomocí semikvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) však odhalila, že pouze cyp-13B1 byl významně upregulován buď deplecí ahr{11}}, nebo kurkuminem ahr-1-závislým způsobem (obrázek S1A-B), zatímco ostatní tři cypy (tj. cyp-13A5, cyp-13A8 a cyp{19}}A1) byly zvýšená kurkuminem pouze v nepřítomnosti ahr-1(obrázek S1). Tyto údaje spolu s dalšími pracemi [25,82] naznačují, že cypy pravděpodobně nejsou hlavními cíli CeAhR. To je také podpořeno naší transkriptomickou analýzou u mutantů divokého typu a ahr{26}}. V souladu s úlohou AHR-1 při určování neuronů [37,38,40,41] změny genové exprese mezi mutanty divokého typu a ahr-1 skutečně ukázaly obohacení v procesech spojených s vývojem neuronů a diferenciace a žádné velké změny v klasických detoxikačních genech (obrázek 2A).qPCR analýza některých z nejvíce up a down-regulovaných genů mezi ahr-1(jul45) a divokým typem (atf-2 , K04H4.2, egl-46, T20F5.4, ptr-4, dyf-7,clec-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3) většinou potvrdili jejich ahr-1-závislost v bazálních podmínkách (obrázek 2B), ale ani UVB [25] ani kurkumin (obrázek 2C) významně neovlivnily expresi těchto genů. Zajímalo nás, zda jsou změny exprese v těchto genech evolučně konzervované, a hodnotili jsme jejich expresi v různých tkáních (tj. mozku, játrech, střevech a krvi) 8- a 18-měsíců starých divokých a AhR KO myši. Některé geny vykazovaly tendenci ke zvýšené expresi u mladých (atf-2 homolog) nebo starých (lpr{-4/5 homologů) myší tkáňově specifickým způsobem, ale nebyly zjištěny žádné zjevné vzorce ani konzervované změny pozorováno (obrázek S2). Tyto výsledky odrážejí možné druhově specifické rozdíly nebo tkáňově závislou transkripční aktivitu AhR u savců přehlíženou transkriptomickou analýzou celého zvířete u C. elegans. Důkladné prozkoumání nejvíce odlišně exprimovaných genů mezi C. elegans divokého typu a ahr-1(červenec 45) odhalilo, že exprese mnoha z těchto genů je ovlivněna u C.elegans během stárnutí a modulátory AhR u savců ve stravě ( např. kvercetin a resveratrol)[25], což naznačuje roli AHR-1 v genové expresi modulované polyfenolem. V souladu s tímto scénářem data z mikročipů ukázala, že většina genů odlišně exprimovaných po léčbě kurkuminem byla skutečně regulována způsobem závislým na ahr (obrázek 2D; tabulka 1).extrakt z cistanche tubulosaZe 47 genů pozměněných kurkuminem u divokého typu (43 up- a 4 down-regulovaných), pouze 5 bylo také indukováno kurkuminem v ahr-1(ju145). Mezi geny regulovanými kurkuminem v závislosti na AHR-1-byly enzymy fáze II a zajímavé je, že některé z nich (ugt-9 a ugt-29) byly regulovány stejným směrem kurkuminem nebo ztrátou ahr-1 (tabulka 1). Zkontrolovali jsme tedy jejich výraz a výraz dalších ugts (ugt-45 a ugt{15}}), které byly rozdílně vyjádřeny při použití méně restriktivní statistické analýzy neopravené pro vícenásobná srovnání. Ze zkoumaných genů byl ugt-45 zvýšen u ahr-1(ijul45) a při léčbě kurkuminem (obrázek 3A,B). Také jsme pozorovali změny v expresi některých detoxikačních genů mezi divokým typem a AhR KO myši tkáňově závislým způsobem. Rozdílná exprese těchto genů byla nejvyšší v mozku, kde Ugt2a3 (ugt-9 a ugt-29 u C.elegans) byl down- a Hpgds (gst-4 u C.elegans) byla up-regulována (obrázek S3A). Ve vzorcích jater myší nebyla žádná změna v expresi žádného z testovaných genů (obrázek S3B). V souladu s údaji C,elegans vykazoval ugt-45 myší homolog Ugt3a2 tendenci k nadměrné expresi v střeva Ahr KO myší (obrázek S3C). Zejména ugt-45 RNAi zabránila příznivým účinkům na délku života a zdraví podporovaným kurkuminem (obrázek 3C,D) nebo vyčerpáním ahr-1 (obrázek 3E,F), což naznačuje, že tyto dva zásahy mohou spoléhat na společně modulovaly downstream signalizaci, aby vyvolaly jejich aktivitu proti stárnutí.
Obrázek 2. Geny odlišně regulované kurkuminem jsou primárně regulovány způsobem závislým na ahr-1-. (A)Obohacení genové ontologie (GO) pro biologické procesy po fúzi GO termínu v ahr-1 vs. hm. (B, C)Exprese nejsilnějších down- a up-regulovaných genů mezi wt a ahr-1 [25]byla hodnocena pomocí qPCR ve wt vs.ahr-1(B) a DMSO-vs . háďátka ošetřená kurkuminem (C). Boxplots ukazují data ze 3 experimentů. Exprese je uvedena vzhledem k hmotnosti ošetřené DMSO (přerušovaná čára). Statistický test:{12}}způsob ANOVA s Tukeyho vícenásobným srovnávacím testem,*p-hodnota<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">
Obrázek 3.ugt-45 je vyžadován pro prodloužení životnosti mutantů kurkuminu a ahr-1. (A, B) Genová exprese byla hodnocena pomocí qPCR u wt vs. ahr-1(A) a DMSO-vs. kurkuminem ošetřených wt nematodů (B). Boxplots ukazují data ze 3 experimentů. Exprese je uvedena vzhledem k hmotnosti ošetřené DMSO (označeno jako přerušovaná čára). Statistický test: 2-Way ANOVA se Sidakovým testem vícenásobného porovnání, *p-hodnota<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>
3.3. AHR-1 a kurkumin nezávisle chrání před oxidačním stresem
Prospěšné vlastnosti polyfenolů jsou často připisovány jejich schopnosti chránit před reaktivními formami kyslíku (ROS)|83,84]. Protože se AhR podílí na procesech zprostředkovaných oxidačním stresem [85-87], zajímalo nás, zda může kurkumin ovlivnit fyziologii zvířat prostřednictvím antioxidačních reakcí regulovaných AhR. Pozorovali jsme, že ahr-1 mutanty produkují více mitochondriálních (mt)ROS a mají snížený mitochondriální membránový potenciál (obrázek 4A,B), dva parametry korelující s dlouhověkostí [88,89]. I když v souladu s paradigmatem mitohormeze ahr-1(červenec 45) produkují o něco více mtROS a žijí déle, tato zvířata byla citlivější na oxidační stres než divoký typ. Konkrétně, škodlivé účinky vyvolané juglonem a H2O2 na skákání, pohyblivost a přežití zvířat byly významně silnější u ahr-1(jul45) ve srovnání s divokým typem (obrázek 4C-F). Tato data naznačují, že vyčerpání AHR-1 má příznivé motorické účinky v bazálních podmínkách, zatímco jeho přítomnost je nutná pro ochranu před oxidativním stresem, čímž se oddělují dva často korelující parametry související s věkem, konkrétně životnost a odolnost vůči stresu. Místo toho kurkumin významně zlepšil odolnost vůči H, O a juglonu jak u divokého typu, tak u ahr{21}} mutantů (obrázek 4E,F), což naznačuje, že kurkumin vyvolává antioxidační odpověď nezávislou na ahr{23}}. V souladu s nespřaženou regulací délky života a odolnosti vůči oxidativnímu stresu neovlivnilo umlčení ugt-45 citlivost na oxidační stres ani u ahr-1 mutantů, ani u zvířat léčených kurkuminem (obrázek 4G).recenze cistanche tubulosaKurkumin má tedy účinky na dlouhověkost prostřednictvím ahr-1 a ugt-45, ale chrání před oxidačním stresem prostřednictvím ahr-1-nezávislých mechanismů.
3.4. Nrf2/SKN-1 zprostředkovává účinky kurkuminu nezávislé na AhR
Abychom dále vyhodnotili přeslechy mezi AhR a kurkuminem v dalších vlastnostech souvisejících s věkem, měřili jsme migrační kapacitu v lidské primární EC – charakteristický znak pro funkčnost cév, která se s věkem snižuje [90] a snižuje se aktivací AhR [14]. V souladu s anti-aging aktivitou suprese ahr{5}} a kurkuminu byla nadměrná exprese AhR významně inhibována, zatímco kurkumin zvýšil migrační kapacitu primární lidské EC (obrázek 5A). Je třeba poznamenat, že indukce migrační schopnosti kurkuminem byla srovnatelná v buňkách transfekovaných prázdným vektorem nebo expresním vektorem AhR (obrázek 5A). Migrace buněk ošetřených kurkuminem však byla významně snížena nadměrnou expresí AhR: kurkumin indukuje v prázdných buňkách transfekovaných vektorem až 60 migrovaných buněk na vysoce výkonné pole, zatímco v buňkách nadměrně exprimujících AhR pouze až 25 buněk na vysoce výkonné pole (obr. 5A). Tyto údaje naznačují, že promigrační účinek kurkuminu je modulován mechanismy nezávislými na AhR, ale možná také snížením aktivity AhR. Dále jsme určili intracelulární distribuci AhR a expresi cVplal v lidském EC ošetřeném kurkuminem, kurkumin neovlivnil AhR-nukleární translokaci (obrázek 5B) nebo expresi cyplu (obrázek 5C). Při hledání cest modulovaných kurkuminem způsobem nezávislým na AhR jsme se vrátili k transkriptomickým profilům hlístic, abychom našli transkripční faktory regulující geny významně modulované ztrátou ahr-1 nebo léčbou kurkuminem u zvířat divokého typu (tabulka 1 ). Toto vyhledávání in silico identifikovalo redoxní transkripční faktor SKN-1, ortolog lidského Nrf2 (faktor 2 související s jaderným faktorem erytroidního faktoru 2-), jehož aktivace kurkuminem [91] je často uváděna jako možný mediátor jeho antioxidační aktivita [92,93]. Prototyp C.elegans Nrf2/SKN-1-dependentního genu, gst-4, je tedy nadměrně exprimován v alhr-1 mutantě [25] a indukován kurkuminem u divokého typu a ještě více u ahr{40}} mutantů (obrázek 5D). Kromě toho kurkumin zvýšil stabilizaci a jadernou translokaci Nrf2 v primárním lidském EC (obrázek 5E) a indukoval expresi manganové superoxiddismutázy (Sod2) – klasického cílového genu Nrf2 – v buňkách transfekovaných prázdným vektorem nebo v buňkách, ve kterých AhR je umlčen shRNA (obrázek 5F). Nedostatek indukce Sod2 pomocí AhR shRNA v EC může být způsoben částečným snížením (50 procent) exprese (obrázek S3D), které nemusí být dostatečné ke spuštění aktivace Nrf2 nebo dalšího transkripčního faktoru (TF), který , v C.elegans, může souhlasit s indukcí gst-4 [94]po úplném vyčerpání AhR. Je zajímavé, že Hpgds, homolog C.elegans gst-4, byl významně zvýšen v mozku AhR KO myší (obrázek S3A), ale není cílem Nrf2. Dalším důkazem pro možnou Nrf2/SKN-1 nezávislou signalizaci aktivovanou vyčerpáním ahr{58}} je, že aktivace gst-4 kurkuminem je zcela potlačena kožní-7 RNAi v Divoký typ C.elegans, zatímco mutanti ahr-1 stále vyvolávají gst-4 navzdory vyčerpání kůže-1 (obrázek 5G, H). Kožní-1 RNAi však snížila odolnost vůči oxidativnímu stresu jak u divokého typu, tak u ahr-1(ju145) (obrázek 5I). Umlčení kůže neočekávaně neovlivnilo odolnost proti juglonu u zvířat léčených kurkuminem (obrázek 5I). Naše data odhalují složitý scénář, kdy kurkumin podporuje různé funkce proti stárnutí, které se spoléhají buď na AhR-dependentní nebo AhR-nezávislé, ale Nrf2/SKN-1-závislou (a další) signalizaci.
Obrázek 4. AHR-1 a kurkumin nezávisle chrání před oxidačním stresem. (A) Reprezentativní obrázky (vlevo) a kvantifikace intenzity DSRed (vpravo) u háďátek wt nebo ahr-1 obarvených MitoSOX. Boxplots ukazují shromážděná data z 129-135 červů/stavů ve 3 experimentech. (B) Membránový potenciál mitochondrií byl hodnocen barvením TRME u nematodů uvedeného věku. Jsou uvedeny reprezentativní snímky (vlevo) a kvantifikace fluorescence TMRE (vpravo). Boxplots ukazují shromážděná data ze 3 experimentů. (C,D) Faryngeální pumpovací aktivita (C) a motilita (D) wt a ahr-1 mutantů po ošetření H2O2. Boxplots zobrazují sdružená data z 39-54(C) nebo 35-36 červů/stav (D) v 3-4experimentech.*p-value<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">
Obrázek 5. Kurkumin aktivuje Nrf2/SKN-1 nezávisle na AhR.(A) Test na škrábnutí v kurkuminu (cur) nebo DMSO ošetřeném lidském primárním EC transfekovaném prázdným vektorem (EV) nebo expresním vektorem pro lidské AhR. Horní panel: reprezentativní obrázky; přerušovaná čára představuje začátek migrace. Měřítko: 100 um. Dolní panel: kvantifikace; boxplots ukazují data 4-6experimentů. Statistický test:1-způsob ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>
3.5. Kurkumin a prooxidanty vykazují opačné účinky na aktivitu AHR-1
V souladu s anti-aging efektem snížené AhReexprese/aktivity naše údaje naznačují, že kurkumin může prodloužit životnost C.elegans potlačením -1-regulovaných drah AHR prostřednictvím snížení exprese/aktivity AHR-1 nebo působení na společných signálních cestách po proudu. Pokusili jsme se tedy kvantifikovat aktivitu AHR-1 u C.elegans, ale četné pokusy vyhodnotit expresi AHR-1 a subcelulární lokalizaci pomocí protilátek (proti savčímu AhR nebo přizpůsobeným protilátkám proti CeAhR) nebo fluorescenčně značených reportéři (OP562, UL1709, ZG93) nepodali smysluplné důkazy. Vzhledem k tomu, že se AHR-1 váže na XRE in vitro [35], napadlo nás použít genovou expresi řízenou XRE jako výstup pro aktivitu AHR-1. Obrátili jsme se tedy na buňky Cos7 odvozené od opic, které neexprimují endogenní AhR, a nevykazují tedy žádnou endogenní aktivitu AhR [95,96] a lze je využít k monitorování indukce luciferázy řízené XRE jako výstup pro AHR-1 aktivita (Larigot et al.; předloženo spolu s touto studií). Když byly buňky Cos7 kotransfekovány vektory exprimujícími C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha-1 a promotor lidského genu CYPIA1 obsahujícího XRE spojený s luciferázou [64] AHR{ {27}} vykazoval nízkou aktivitu v bazálních podmínkách (léčených vehikulem). Za zmínku stojí, že léčba kurkuminem nebo jinými nutraceutiky, které podporují zdravé stárnutí u C.elegans, jako je lutein [97] a resveratrol [98,99], významně potlačila aktivitu AHR-1 (obrázek 6A-C). Místo toho BaP a leflunomid, známé aktivátory AhR u savců, neovlivnily aktivitu AHR-1 (obrázek 6A,B) v koncentracích, které jsme použili. Aktivita AHR-1 byla zrušena v buňkách Cos7 transfekovaných vektorem exprimujícím alelu ahr-1(jul45) namísto alely divokého typu (obrázek 6A-C), což naznačuje, že jul45 je pravá alely se ztrátou funkce a že naměřená intenzita luciferázy je způsobena funkční AHR-1.
Poté jsme se snažili prozkoumat, zda kurkumin snižuje aktivitu AHR-1 přímou vazbou nebo nepřímou modulací. Dosud nebyly identifikovány žádné ligandy C.elegans AHR-1, a protože nejsou k dispozici žádné informace o jeho LBD, provedli jsme analýzu in silico, abychom jej charakterizovali. Dvě AHR-1 izoformy, la a lb, byly porovnány a ačkoli se liší v délce, jejich sekvence PASB domény je identická. Tato sekvence byla poté porovnána s doménou PASB Drosophila melanogaster a s doménami dvou AhR obratlovců, pro které byly dříve vytvořeny strukturální modely, jmenovitě myši (Mus musculus)[100] a zebrafish (Danio rerio)[101](obrázek 6D). Zarovnání ukázalo jasné rozdíly mezi druhy s hlavní zvláštností bezobratlých, kteří odhalili sekvenční delece v nejvariabilnější oblasti v doméně PAS, což odpovídalo flexibilní oblasti, včetně helikálního svazku (šroubovice C, D, E) a krátkých smyček spojujících tyto prvky (obrázek 6D,E). Tyto delece by mohly snížit dostupný prostor ve vazebné dutině těchto AhR. Poté jsme pomocí homologního modelování vytvořili 3D model AHR-1 PASB. Tento model představuje typické skládání PAS, ale s kratší šroubovicí Do ve srovnání s jinými AhR. Vnitřní dutina má však některé zvláštnosti; obsahuje více hydrofobních zbytků a je zkrácen na polovinu některými vnitřními postranními řetězci. Zejména H365 a H274 jsou proti sobě a mohly by tvořit vodíkovou vazbu uprostřed dutiny; navíc by postranní řetězce Y332, L363 a L302 mohly ucpat dutinu, čímž by se zmenšil vnitřní prostor dostupný pro ligandy (obrázek 6E). Tato malá a zkrácená dutina s největší pravděpodobností neumožňuje vazbu velkých ligandů (např. TCDD nebo kurkumin). Podobně jako strukturní model AHR-1 i model zfAhRla zebrafish ukázal, že dutina LBD je zkrácená ve srovnání s paralogy zfAhR1b a zfAhR2 vázajícími TCDD [101]. Malé a flexibilní ligandy, jako je leflunomid, se vážou a aktivují zfAhRla, ale koncentrace leflunomidu, kterou jsme testovali, neaktivovala AHR-1 v našem buněčném systému Cos7 (obrázek 6B). Pak nás zajímalo, zda mutace v aminokyselinách odpovědných za malou dutinu LBD mohou umožnit klasickým ligandům aktivovat CeAhR. Zbytek CeAhR L363 (obrázek 6D) odpovídá A375 v mAhRb-I a V375 v Madridu a tento zbytek má hlavní dopad na vazbu ligandu [102]. Podobně T386 zfAhRla (obrázek 6D), odpovídající A375 v mAhRb-1 a A386 v zfAhR1b a zfAhR2, přispívá k nedostatečné vazbě zfAhRla na TCDD, a když je mutován na alanin, obnovuje citlivost TCHDD, když je také Y296 představeno [101]. Aminokyselina Y296 je již histidinem v C.elegans(H274). Mutovali jsme tedy pouze leucin v pozici L363 ve vektoru CeAhR na alanin (L363A) (obrázek 6D,E označený šipkou). Navíc jsme mutovali blízký histidin v pozici H365 na glutamin (H365Q), což je Q377 u myší (obrázek 6D, E označeno šipkou), protože pravděpodobně tvoří vodíkovou vazbu s H274 a může přispívat k malé dutině AHR{ {49}} (obrázek 6E). Poté jsme testovali, zda savčí ligandy AhR ovlivňují aktivitu AHR-1, když jsou mutovány L363 a H365. Tyto změny však místo obnovení odpovědi na xenobiotické ligandy jako u zebřiček [101] zrušily dokonce i bazální AHR-1 aktivitu, podobnou alele ju145 (obrázek 6F). Tyto výsledky ukazují jasné rozdíly mezi LBD C.elegans a zebrafish, ale ukazují, že LBD je zásadní pro bazální aktivitu AHR-1. Spolu s předchozími studiemi [35,38,82] naše výsledky naznačují, že AHR-1 se pravděpodobně nepodílí na klasické transaktivační reakci vyvolané xenobiotiky, která tak nemusí být relevantní pro regulaci ahr{64}} fyziologické stárnutí. Místo toho mohou sloučeniny rostlinného původu vykazovat konzervativní účinky alespoň částečně prostřednictvím potlačení drah modulovaných AHR-1-. Náš 3D model naznačuje, že kurkumin nemoduluje aktivitu AHR-1 tím, že váže jeho LBD. Potlačení aktivity AHR-1 kurkuminem by tedy mohlo být způsobeno jeho antioxidačním účinkem. V souladu s touto možností a zvýšenou citlivostí mutantů C.elegans ahr-1 na oxidativní stres jsme zjistili, že aktivitu AHR-1 skutečně zvyšují látky indukující ROS. Konkrétně buňky Cos7 ošetřené prooxidačním rotenonem vykazovaly zvýšenou aktivitu AhR, když byly transfekovány buď C. elegans nebo myší AhR, ale ne, když byly transfekovány alelou jul45 nebo alelou s mutacemi LBD (obrázek 6G, H).
Celkově, zatímco aktivace CeAhR chrání před oxidačním stresem v raném věku, jeho snížená exprese působí proti stárnutí a zprostředkovává příznivý účinek kurkuminu proti stárnutí (obrázek 7). Kurkumin tak může pomoci vyvážit aktivaci redoxní TF v kontextu a čase závislým způsobem a podpořit supresi AhR přímo prostřednictvím svého antioxidačního účinku a/nebo prostřednictvím aktivace Nrf2/SKN-1 (nebo jiného TF), které mohou současně zprostředkovávají aktivitu kurkuminu proti stárnutí.
Obrázek 6. Kurkumin a prooxidanty mají opačné účinky na aktivitu AHR-1. (AC)Vyhodnocení aktivity AHR-1 po ošetření uvedenými sloučeninami v buňkách Cos7 transfekovaných buď wt AHR-1(wt) nebo AHR-1 nesoucími bodovou mutaci ju145 (ju145) a AHA-1 a také XRE-indukovatelná luciferáza. Boxplots ukazují data 3-5experimentů.* p-hodnota<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">
Obrázek 7. Navrhovaný model AHR-1 signální dráhy v odpovědi C.elegan na pro-a antioxidanty. V „normálních“ podmínkách (střední panel) je AHR-1 aktivován intracelulární ROS. To vede k uvolnění chaperonů z cytosolického AHR-1 a následné jaderné translokaci AHR-1. V jádře AHR-1 tvoří heterodimer s jaderným translokátorem AHR (AHA{ {7}}) a váže se na XRE cílových genů, což následně vede ke snížení intracelulárních hladin ROS. Za těchto podmínek vede ztráta funkce ahr-1 k prodloužení životnosti. V přítomnosti antioxidantů (levý panel) jsou intracelulární koncentrace ROS nízké, což vede k AHR-1 sídlícímu v cytoplazmě, vázané svými kofaktory. Inhibice bazální aktivity AHR{10}} vede k prodloužení života. V přítomnosti prooxidantů (pravý panel) je AHR-1 aktivován nadměrným množstvím ROS, což vede k jeho jaderné translokaci, tvorbě AHR-1-AHA-1 heterodimeru a iniciaci transkripce cílového genu. U ahr-1 KO vede snížená detoxikace ROS prostřednictvím AHR-1-indukovaných cílových genů k akumulaci ROS a činí ahr{17}} KO vnímavý.
4. Diskuze
AhR byl původně objeven u savců pro svou aktivitu xenobiotické odezvy indukovanou navázáním environmentálních toxických látek nebo endogenních ligandů, ale existují také modulátory, které se nespoléhají na vazbu ligandu, ale jsou mnohem méně prozkoumány. C.elegans představuje jedinečný modelový organismus pro zkoumání aktivit AhR nezávisle na jeho klasické xenobiotické odpovědi, protože CeAhR neváže prototypy ligandů AhR [35,39]. Pomocí tohoto modelu jsme identifikovali evolučně konzervovanou funkci pro AhR v procesu stárnutí [14] a ukázali, že některé savčí modulátory AhR (tj. bakterie, Bal a UVB) ovlivňují parametry stárnutí prostřednictvím AHR-1 v kontextově závislým způsobem [25]. Zde jsme navázali na naše předchozí zjištění mechanističtějším zkoumáním vlastností stárnutí regulovaných AhR napříč druhy dietním polyfenolovým kurkuminem. Naše kombinované analýzy in vivo, in vitro a in silico odhalily nový a komplexní scénář: zatímco kurkumin podporuje vlastnosti proti stárnutí u nematodů a lidských primárních EC alespoň částečně způsobem závislým na AhR, jeho antioxidační účinky u obou druhů spoléhají na na mechanismech nezávislých na AhR, ale především závislých na Nrf2/SKN{11}}.
Poprvé jsme ukázali, že kurkumin oddaluje fyziologické stárnutí C.elegans v závislosti na AHR-1-. Při hledání možných následných ahr-1-závislých efektorů kurkuminu jsme použili cílené a nestranné přístupy a zjistili jsme, že většina odlišně regulovaných genů při léčbě kurkuminem je regulována způsobem závislým na AHR-1-. Mnoho z těchto genů navíc vykazovalo podobný vzorec exprese u zvířat s ochuzeným AHR-1-a léčených kurkuminem, což naznačuje, že kurkumin podporuje prodloužení života prostřednictvím potlačení aktivity AHR-1. Překvapivě ani cílená, ani transkriptomická analýza neukázala hlavní roli pro klasické cílové geny AhR, jako jsou pohárky, u kterých bylo místo toho zjištěno, že jsou převážně nedostatečně exprimovány v neuronech (Larigot et al.; předloženo spolu s touto studií). Je zajímavé, že tato zjištění mohou naznačovat, že transkriptomika celého zvířete může maskovat neuronálně specifické účinky AhR, v tomto specifickém případě prostřednictvím genů cps. Zjistili jsme, že mezi odlišně exprimovanými geny patří mnohé k enzymům fáze II detoxikace, jako je střevo-45, které bylo zvýšeno jak vyčerpáním ahr{11}} (a v mozku myší AhR KO) a léčba kurkuminem ke zprostředkování prodloužení jejich životnosti. Místo toho léčba kurkuminem a deplece ahr{12}} zvýšily expresi dalšího enzymu fáze II detoxikace, GST-4, prostřednictvím různých mechanismů: první spoléhá na Nrf2/, zatímco druhý je na něm převážně nezávislý SKN-1, klasická redoxní TF indukující GST-4 po oxidativním stresu u C.elegans [103]. Kromě toho, zatímco kurkumin indukuje reakce závislé na Nrf2/SKN-1- u C.elegans (exprese GST-4) a lidských primárních EC (exprese Sod2 a migrační kapacita), také chrání C.eleans před oxidačním stresem v způsobem nezávislým na SKN-1-. U C.elegans nemůže kurkumin prodloužit životnost u velmi nemocných kožních-1(zu67) mutantů [104], zatímco GST-4 může být indukována na SKN-1-nezávisle signalizací EGF [94] a přeslechy mezi EGF dráhou a AhR byly hlášeny u savců [105].
Zajímavé je, že na rozdíl od kmene divokého typu jsme pozorovali AHR-1-nezávislý účinek kurkuminu na zdravotní rozsah v modelech hlístic pro Huntingtonovu a Parkinsonovu chorobu, v daném pořadí. U těchto kmenů léčba kurkuminem zvýšila počet proteinových agregátů ve stejné míře jako deficit AHR-1, což naznačuje buď ochranný účinek samotné agregace proteinu a/nebo aktivaci kurkuminových drah chránících proti agregaci proteinů nezávisle na a/ hr-1 vyčerpání. Vliv kurkuminu na agregaci proteinů je kontroverzní: bylo prokázáno, že inhibuje tvorbu fibril, ale také váže pre-fibrilární/oligomerní druhy amyloidogenních proteinů, čímž urychluje jejich agregaci a snižuje celkovou neurotoxicitu [106]. Za zmínku stojí, že kofein, který také chrání před rysy kardiovaskulárního stárnutí [66,107], také zabraňuje paralýze indukované A bez snížení agregátů A, ale prostřednictvím aktivace ochranné dráhy závislé na Nrf2/SKN -1- [108]. Bude důležité posoudit, zda je ochranný účinek vyvolaný kurkuminem nebo veškerá{12}} deplece v modelech onemocnění C.elegans zprostředkován mechanismy podporujícími odstranění oligomerních/prefibrilárních druhů do méně toxických agregátů a/nebo aktivace dalších mechanismů, jako je Nrf2/SKN-1, které mohou současně chránit před proteotoxicitou. Je třeba poznamenat, že detoxikační enzymy mohou obsahovat jak XRE, tak ARE (antioxidant responzivní prvky) a byla popsána souhra mezi Nrf2/ARE a AhR/XRE regulovanou signalizací [109]. Bude tedy zajímavé objasnit, jak kurkumin podporuje své různé příznivé účinky proti stárnutí prostřednictvím rovnováhy mezi signalizací regulovanou Nrf2 a AhR.
Naše kombinované přístupy ukázaly, že kurkumin inhibuje aktivitu AHR-1. U savců se předpokládá, že inhibiční účinek kurkuminu na AhR je zprostředkován přímou vazbou LBD [110] nebo inhibicí proteinkinázy C, která fosforyluje AhR[79]. Jiná studie ukázala, že transkripční aktivita AhR je závislá na buněčném redoxním stavu a struktuře chromatinu, které jsou obě ovlivněny kurkuminem [111]. Zatímco AHR-1 neváže TCDD, váže XRE in vitro[36], ale systematické studie zabývající se potenciálem polyaromatických uhlovodíků nebo jiných savčích ligandů AhR modulovat AHR-1 chybí především kvůli nedostatek vhodných nástrojů k posouzení. Naše studie se pokoušejí zaplnit tuto mezeru a využívají buňky Cos7 exprimující AHR-1 ve spojení s luciferázovými testy (Larigot et al.; předloženy spolu s touto studií) a in silico modelování C. elegans LBD, odhalily, že kurkumin potlačuje AHR -1 aktivitu, ale pravděpodobně ne přímou vazbou LBD. In vitro test použitý v naší studii potvrdil, že CeAhR není aktivován prostřednictvím klasické xenobiotické signalizace. Přesto by to neodhalilo aktivity způsobené vazbou AhR na sekvence DNA jiné než „klasický“ XRE nalezený v CYP1A1, jako je XRE reagující na polyfenol(quercetin) nalezený v PON1 [112,113]. Imunobarvení v lidských primárních EC také argumentuje proti kurkuminu indukujícímu jadernou translokaci AhR, což spolu s podpůrným účinkem migrační kapacity v buňkách nadměrně exprimujících AhR může také naznačovat, že kurkumin potlačuje aktivitu AhR.
Navrhujeme, aby inhibiční účinek kurkuminu, spíše než spoléhání na vazbu AhR, zahrnoval jeho antioxidační schopnost, která může být skutečně spojena s aktivací Nrf2/SKN{1}} nebo na ní dokonce záviset. Savčí AhR je aktivován ROS prostřednictvím LBD-nezávislé oxidativní modifikace [85], ale naše data ukazují, že indukce AHR-1 aktivity prooxidačním rotenonem vyžaduje LBD. Nepřímým mechanismem aktivace AhR zprostředkované ROS je tvorba silného ligandu AhR FICZ[114]. Přesto je FICZ velká planární molekula, která by podle našeho in silico modelu nevyhovovala AHR-1 LBD. Zatímco přesný mechanismus, kterým je aktivita AHR-1 podporována ROS a inhibována kurkuminem (buď přímým zhášením ROS, nebo nepřímo aktivací Nrf2 nebo jiných antioxidačních regulačních genů), je třeba stanovit, je to silně podporováno našimi zjištění: AHR-1 je aktivován rotenonem a mutanty ahr{12}} vykazují více mtROS, snížený potenciál mitochondriální membrány a jsou citlivější na H, O a juglon a také na UVB a BaP [25] , oba produkují ROS[115,116]. V této souvislosti je zajímavé poznamenat, že ahr{16}} mutanti vykazují mírné změny mitochondriálních funkcí, které se podobají funkcím mitohormeze [117. To naznačuje, že veškerá-1 deplece (a možný kurkumin inhibicí AHR-1) může podporovat zdraví prostřednictvím mírného mitochondriálního stresu, o kterém je známo, že prodlužuje životnost C.elegan díky detoxikačním genům, které jsou podobně modulovány v jiných{19} {20}} mutantů [118,119]. Navíc, zda Nrf2/SKN-1 a mitochondrie hrají roli v modulaci aktivity AHR-1 po léčbě kurkuminem, je zajímavou možností, kterou je třeba ověřit.
Celkově, s využitím mnoha funkcí nabízených háďátkem C.elegans pro studie in vivo, navrhujeme, že funkce předků AhR by mohla být v regulaci enzymů fáze II souvisejících spíše s antioxidačními než xenobiotickými reakcemi. Na rozdíl od škodlivých účinků vyvolaných vysokými hladinami ROS mohou být příznivé účinky podporované nedostatkem AhR zprostředkovány mírným mitochondriálním stresem a/nebo mírnou produkcí ROS (mitohormeze), které také spoléhají na Nrf2/SKN-1. Poskytujeme také silné důkazy pro interakci mezi kurkuminem a AhR. Inhibice signalizace AhR kurkuminem je evolučně konzervovaná a pravděpodobně není zprostředkována vazbou na AhR LBD, ale spíše vlastnostmi kurkuminu pohlcovat ROS nebo aktivací Nrf2/SKN-1. Signální dráha Nrf2 může být skutečně aktivována kurkuminem různými způsoby [91]. Naše data nakonec ukázala, že kurkumin podporuje účinky proti stárnutí také nezávislým způsobem jak u C.elegans (zvýšená exprese GST-4 a odolnost proti oxidativnímu stresu), tak u lidských primárních EC (zvýšená exprese Sod2 a migrační kapacita ), což by také mohlo vysvětlit aditivní účinky kurkuminu a ztrátu funkce AHR-1 na zdravotní rozsah zvířat exprimujících polyQ.
5. Závěry
Na závěr, prostřednictvím originální kombinace in silico, vitro a in vivo přístupů jsme ukázali, že zatímco aktivace CeAhR chrání před oxidačním stresem v raném věku, jeho snížená exprese působí proti stárnutí a zprostředkovává příznivý účinek kurkuminu proti stárnutí (obrázek 7). . Kurkumin tak může pomoci vyvážit aktivitu různých transkripčních faktorů zapojených do detoxikačních/antioxidačních reakcí (potlačit AhR a aktivovat Nrf2) v podmínkách, kde jsou tyto změněny (zvyšuje AhR a snižuje Nrf2/SKN-1), jako je stárnutí nebo poruchy spojené s věkem. Naše práce přidává další úroveň komplexnosti k již tak rozsáhlým multifunkčním a kontextově specifickým aktivitám AhR s významnými dopady na zdraví organismu a životnost. Kromě toho otevírá dveře dalším studiím, které využívají systém háďátek k objevování a zkoumání funkcí předků AhR, u kterých je méně pravděpodobné, že budou identifikovány u savců.
Tento článek je extrahován z Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants
