Kyselina aristolochová indukuje renální fibrózu a stárnutí u myší
Mar 23, 2022
Abstraktní:Ledviny jsou jedním z nejvíce náchylných orgánů k poškození souvisejícím s věkem. Obecně je stárnutí ledvin doprovázeno renální fibrózou, která je konečnou běžnou cestou chronickéonemocnění ledvin. Kyselina aristolochová (AA), nefrotoxická látka, způsobuje AA nefropatii (AAN), která je charakterizována progresivní renální fibrózou a funkčním poklesem. I když je renální fibróza spojena se stárnutím ledvin, zůstává nejasné, zda AA indukuje stárnutí ledvin. Cílem této studie je prozkoumat potenciální využití AAN jako modelu stárnutí ledvin. Zde jsme zkoumali faktory související se stárnutím v modelech AAN chronickým podáváním AA myším C57BL/6. Ve srovnání s kontrolami skupina AA prokázala stárnutíledvinafenotypy, jako je renální atrofie, renální funkční pokles a tubulointersticiální fibróza. Navíc AA podporovala buněčné stárnutí specificky vledvinya zvýšenou renální expresi p16 mRNA a aktivitu galaktozidázy související se stárnutím. Kromě toho myši ošetřené AA vykazovaly proximální tubulární mitochondriální abnormality, stejně jako akumulaci reaktivních forem kyslíku. Klotho, gen proti stárnutí, byl také významně sníženledvinymyší ošetřených AA. Souhrnně výsledky této studie naznačují, že AA mění faktory související se stárnutím a že renální fibróza úzce souvisí se stárnutím ledvin.
klíčová slova:chronické onemocnění ledvin; renální fibróza; kyselina aristolochová; stárnutí; buněčné stárnutí
CISTANCHE ZLEPŠÍ ONEMOCNĚNÍ LEDVIN/RENÁL
ÚvodS neustále se prodlužující délkou života u lidí trpí stále více jedinců poruchami souvisejícími s věkem.Ledvinyjsou typicky ovlivněny poškozením tkání souvisejícím s věkem a výskytem chronickýchnemoc ledvinroste s věkem [1]. Renální stárnutí urychluje celkové stárnutí, což má za následek kratší životnost. Proto je nezbytný výzkum stárnutí ledvin, ačkoli vhodné zvířecí modely nebyly plně vyvinuty. Stárnutí ledvin je doprovázeno různými patologickými změnami, včetně renální atrofie, glomerulosklerózy a tubulointersticiální fibrózy [2]. Renální tubulointersticiální fibróza je poslední běžnou cestou u většiny forem progresivního renálního onemocnění, což naznačuje, že renální fibróza je úzce spojena s věkemledvina. Ve výzkumu stárnutí jsou myši spolehlivým nástrojem kvůli jejich genetické blízkosti k lidem, schopnosti geneticky manipulovat s jejich genomem a skutečnosti, že během svého života představují podobné fenotypy související se stárnutím jako lidé [3]. Podélná pozorování pomocí inbredních myší jsou ideální jako model stárnutí, i když je časově náročné sledovat myši po celou dobu jejich života. Kromě toho existuje několik geneticky modifikovaných myších modelů stárnutí. Klotho-deficientní myš je modelem předčasného stárnutí, který se používá ve výzkumu stárnutí. V tomto modelu však není ovlivněna funkce ledvin a je poškozeno několik orgánů jiných než ledviny [4]. Tento myší model tedy může být nevhodný pro výzkum stárnutí ledvin.Podávání kyseliny aristolochové (AA) způsobuje specifický typ renálního poškození známého jako AA nefropatie (AAN), který je charakterizován rozsáhlou intersticiální fibrózou [5,6]. AA je toxická pro renální tubulární epitel, protože podporuje tvorbu DNA aduktů v renálních tkáních [7]. Je nepravděpodobné, že by AA ovlivnila jiné orgány než močový systém a může být užitečná pro hodnoceníledvina- specifické změny. Proto se AA běžně používá k vytvoření modelů renální fibrózy u myší [8,9]. Zůstává však nejasné, zda změny vyvolané AA souvisejí se stárnutímledviny. V této studii jsme zkoumali věkově podmíněné fenotypy a molekulární faktory v AAN u myší
Výsledek 2.1. Podávání AA vyvolalo významný úbytek hmotnosti, renální atrofii a pokles renálních funkcíZákladní tělesná hmotnost (BW) a systolický krevní tlak (BP) byly identické mezi kontrolní skupinou s vehikulem a skupinou AA. BW v kontrolní skupině s vehikulem se během 8 týdnů konzistentně zvyšovala. Avšak přírůstek hmotnosti byl inhibován podáváním AA a skupina AA měla významně nižší BW 4 a 8 týdnů po zahájení podávání AA (obrázek 1A). Mezi kontrolní skupinou s vehikulem a skupinou AA nebyl žádný významný rozdíl v systolickém TK nebo srdeční frekvenci (obrázek 1B,C). Poměr srdeční hmotnost/tělesná hmotnost nevykazoval žádný rozdíl mezi skupinami 8 týdnů po zahájení podávání AA (obrázek 1D), zatímcoledvinapoměr hmotnost/tělesná hmotnost byl významně nižší ve skupině AA 8 týdnů po zahájení podávání AA (obrázek 1E). Dále jsme zkoumali renální funkce ve skupině s vehikulem a AA. Koncentrace kreatininu v plazmě a močovinového dusíku (UN) byly významně vyšší ve skupině s AA než ve skupině s kontrolním vehikulem 8 týdnů po zahájení podávání AA. Kromě toho léčba AA významně snížila clearance kreatininu ve srovnání s kontrolní skupinou s vehikulem 8 týdnů po zahájení podávání AA (obrázek 1F–H).
2.2. Podávání AA indukovalo zjevnou tubulointersticiální fibrózu a signifikantní upregulaci genové exprese související s fibrózou v ledvináchHistologické vyšetření pomocí barvení periodickou kyselinou-Schiff (PAS) odhalilo, že glomerulární oblast byla významně snížena ve skupině AA ve srovnání s kontrolní skupinou s vehikulem (obrázek 2A). Ve skupině AA (obrázek 2B) byla pozorována rozsáhlá tubulointersticiální fibróza, hodnocená pomocí barvení Massonovým trichromem (MT), stejně jako s upregulací hladin mRNA genů souvisejících s fibrózou ledvin, kolagenu I a III a transformačního růstového faktoru ( TGF)- (obrázek 2C–E).
2.3. Podávání AA Zrychlené buněčné stárnutí, mitochondriální dysfunkce a akumulace reakčních kyslíkových/genových druhů (ROS) v ledvináchPro hodnocení buněčné stárnutí jsme zkoumali renální mRNA expresi p53, p21, p16 a glutaminázy (GLS). Skupina AA prokázala významně vyšší hladiny mRNA těchto genů souvisejících se stárnutím vledviny(Obrázek 3A-D). Navíc intenzita barvení -galaktosidáza (SA- -gal) spojená se stárnutím vledvinybyla zvýšená ve skupině AA a téměř chyběla v kontrolní skupině s vehikulem (obrázek 3E). Ve skupině AA elektronová mikroskopie odhalila vymizení mitochondriálních krist, mitochondriální fragmentaci, cytoplazmatickou vakuolizaci a autolysozomy v proximálních tubulárních buňkách, současně s downregulace BCL2/adenovirus E1B 19-kDa interagujícího proteinu 3 (Bnip3), genu souvisejícího s mitochondriemi (obrázek 3FG). Renální mRNA exprese Nox2. složka nikotinamid adenindinukleotid fosfát (NADPH) oxidázy, byla významně zvýšena ve skupině AA ve srovnání s kontrolní skupinou s vehikulem (obrázek 3H). Kromě toho analýza western blot odhalila, že renální 4-hydroxy-2-nominální (4-HNE) hladina byla významně zvýšena ve skupině AA (obrázek 3I). Tyto výsledky ukázaly, že podávání AA indukovalo buněčnou senescenci, mitochondriální dysfunkci a akumulaci ROS vledviny.
2.4. AA Snížená renální exprese Klotho proteinuZkoumali jsme renální expresi antiaging proteinů ve skupině s vehikulem a AA. Exprese Klotho byla významně snížena ve skupině AA ve srovnání s kontrolní skupinou s vehikulem (obrázek 4A), zatímco renální exprese nikotinamid fosforibosyltransferázy (NAMPT) a sirtuinu1 (SIRT1) byly mezi skupinami podobné (obrázek 4B,C).
3. DiskusePokud je nám známo, tato studie je první, která se zaměřuje na hodnocení změn AAN souvisejících se stárnutím ledvin pomocí markerů stárnutí, jako je aktivita p16 a SA{2}}gal. Léčba AA podporovala renální atrofii, tubulointersticiální fibrózu a renální funkční pokles, které byly doprovázeny upregulací renální p16 mRNA a SA- -gal-pozitivním barvením. Kromě toho skupina AA prokázala rysy mechanismů souvisejících se stárnutím ledvin, jako jsou mitochondriální abnormality, zvýšený oxidační stres a downregulace genu proti stárnutí Klotho. Celkově naše pozorování naznačují, že chronické podávání AA částečně napodobuje stárnutí ledvin.
Buněčné stárnutí je trvalé zastavení buněčné proliferace v reakci na různé stresory, jako je poškození DNA, a přispívá ke stárnutí a nemocem souvisejícím se stárnutím. Exprese p16, inhibitoru cyklin-dependentní kinázy, koreluje se stárnutím v různých orgánech, včetně ledvin. Kalorická restrikce zvyšuje životnost inhibicí exprese pl6 [10]. Kromě toho eliminace senescentních buněk exprimujících p{5}} u myší INK-ATTAC pomocí injekce AP20187, proteinového dimerizátoru vázajícího FK{8}} [11], způsobuje útlum fenotypů stárnutí ledvin, jako je glomerulární skleróza a renální funkční pokles. Proto je p16 jedním z nejdůležitějších faktorů souvisejících se stárnutím. Senescentní buňky lze detekovat pomocí barvení SA- -gal, které prokazuje zvýšenou aktivitu -galaktosidázy při pH 6,0 [12] a je široce používaným biomarkerem senescentních a stárnoucích buněk. Renální mRNA exprese pl16 se u starých potkanů zvyšujeledvinya je doprovázena zvýšenou aktivitou SA- -gal v renálním epitelu [13I. V této studii jsme prokázali zvýšenou renální expresi mRNA p16 a barvení SA- -gal, což naznačuje, že AA indukuje renální senescenci. Nedávno bylo popsáno, že GLS je nezbytný pro přežití senescentních buněk prostřednictvím zvýšené glutaminolýzy a intracelulární neutralizace pH [14]. Ukázalo se, že inhibice glutaminolýzy závislé na GLS u starých myší odstraňuje senescentní buňky a zlepšuje dysfunkci orgánů související s věkem. V této studii upregulace renální GLS mRNA indikovala renální akumulaci senescentních buněk ve skupině. Chronické podávání AA tedy způsobilo stárnutí buněk v ledvinách.
CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCI LEDVIN/RENÁL
Kromě buněčného stárnutí je mitochondriální dysfunkce základním mechanismem poškození tkáně související s věkem a je doprovázena akumulací ROS [15,16. Mitochondriální dysfunkce řídí a udržuje buněčné stárnutí [17], zatímco buněčné stárnutí přímo přispívá k mitochondriální dysfunkci [18]. Bnip3, lokalizovaný primárně ve vnější mitochondriální membráně, může hrát roli v regulaci mitofagie v kultivovaných renálních proximálních tubulárních buňkách v reakci na oxidační stres a hypoxii. U starých myší zvyšuje kalorická restrikce autofagii v tubulárních buňkách prostřednictvím upregulace Bnip3 a zlepšuje věkem indukovanou degeneraci renálních funkcí [19]. V této studii elektronová mikroskopie odhalila rysy mitochondriálních abnormalit, které mohou být ovlivněny sníženou renální expresí Bnip3 nebo buněčnou senescencí. Mitochondrie jsou hlavním intracelulárním zdrojem ROS. Abychom vyhodnotili účinky mitochondriálních abnormalit na renální ROS, zkoumali jsme renální akumulaci 4-HINE a prokázali jsme akumulaci ROS vyvolanou AA vledviny.NADPH oxidázy jsou hlavním zdrojem ROS. Během akutní fáze AAN u myší byla zvýšená renální mRNA exprese Nox2 a snížena dostupnost oxidu dusnatého, což vedlo k trvalé hypoxii a ischemii [20. U staré krysyledvinyakumulace ROS je doprovázena zvýšenou expresí Nox2 [21]. Tato zjištění naznačují, že AA může indukovat fenotypy související s věkem prostřednictvím akumulace ROS způsobené mitochondriální dysfunkcí a upregulací NADPH oxidáz.
Renální Klotho genová exprese byla snížena ve skupině AA, zatímco exprese NAMPT a SIRT1 byla mezi skupinami podobná. Klotho je gen proti stárnutí, který kóduje jednoprůchodový transmembránový protein, který působí jako supresor stárnutí. Proces stárnutí u myší s deficitem Klotho se podobal procesu u lidí, včetně kratší délky života, neplodnosti, arteriosklerózy, atrofie kůže, osteoporózy a emfyzému [22]. Hypomorfní mutantní myši Klotho také vykazovaly fenotyp zrychleného stárnutí, který byl obnoven ablací p16 [23]. Vzhledem k tomu, že Klotho je důležitým faktorem stárnutí, byly myši s modifikovaným genem Klotho široce používány ve výzkumu stárnutí. Myši s modifikovaným genem Klotho však mohou být nevhodné pro výzkum stárnutí ledvin kvůli systémovému poškození těchto myší souvisejícím se stárnutím a skutečnosti, že funkce ledvin není ověřená (tj. hladiny kreatininu). Naproti tomu myší model AAN lze použít jako lékem indukovaný model stárnutí ledvin pro výzkumné účely, protože má několik výhod, jako je relativní snadnost implementace a schopnost odhadnout účinky intervencí na pokles funkce ledvin. .
Tato studie měla určitá omezení. Hodnotili jsme stárnutí ledvin se zaměřením především na buněčnou senescenci, mitochondriální morfologii a genovou expresi související se stárnutím. Mechanismy stárnutí jsou však složité a zůstávají špatně pochopeny. Kromě toho, ačkoli exprese genu Klotho byla snížena v reakci na AA, nemohli jsme prokázat kauzální vztah s patologickými změnami v AAN. K určení rolí různých molekul zapojených do vývoje AAN jsou zapotřebí další studie. Nicméně tato studie poskytuje nový pohled na použití Avan jako modelu stárnutí ledvin. Je důležité si uvědomit, že fenotypové změny vledvinajsou silně spojeny s životností. Ačkolivledvinaje snadno ovlivněn změnami souvisejícími se stárnutím, inhibice stárnutí ledvin může prodloužit celkovou délku života. Proto další výzkum stárnutí ledvin pomocí modelů AAN může v budoucnu vést ke zvýšení dlouhověkosti.
4. Materiály a metody4.1. ZvířataTato studie byla provedena v souladu s pokyny National Institute of Health pro použití pokusných zvířat. Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny Výborem pro studie zvířat Yokohamské městské univerzity (číslo schválení: FA20-027) a byly prováděny v souladu s pokyny ARRIVE. Bylo vynaloženo úsilí na minimalizaci počtu použitých zvířat a jejich utrpení. Myši byly umístěny v kontrolovaném prostředí v cyklu 12-h světlo/12-h tma při teplotě 25 stupňů C. Myši měly volný přístup k potravě a vodě.
CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCI LEDVIN/RENÁL
Osmitýdenní samci myší C57BL/6 byli zakoupeni od Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) a zařazeni do skupiny s vehikulem nebo AA po 1 týdnu aklimatizace, myším bylo intraperitoneálně podáváno vehikulum nebo AA (Sigma -Aldrich, St.Louis, MO, USA), který byl rozpuštěn v malém množství dimethylsulfoxidu. Před touto studií jsme provedli předběžnou studii pomocí několika protokolů. První protokol zahrnoval podávání AA (3 mg/kg) myším C57BL/6 intraperitoneálně dvakrát týdně po dobu 4 týdnů bez doby remodelace; v tomto protokolu způsobila AA zjevné akutní renální léze, jako jsou dilatované proximální tubuly se ztrátou kartáčkového lemu (doplňkový obrázek S1). Ve druhém protokolu byla myším C57BL/6 podávána AA (2,5 mg/kg) intraperitoneálně jednou týdně po dobu 4 týdnů s následnou dobou remodelace po dobu 4 týdnů; plazmatický kreatinin u těchto myší byl 0,19 ± {{20}}.080 mg/dl versus 0,18 ± 0,010 mg/dl (kontrola vehikula versus AA, v tomto pořadí; průměr ± standardní chyba průměru (SEM), p=0.86, nepárový Studentův t-test, n=4 na skupinu) a UN plazmy byly 31,3 ± 5,95 mg/dl oproti 30,4 ± 3,87 mg/dl (kontrola vehikula versus AA, v tomto pořadí; průměr ± SEM, p=0,90, nepárový Studentův t-test, n=4 na skupinu). Proto jsme zjistili, že tento protokol není vhodný pro model poškození ledvin, protože AA neindukuje významný pokles funkce ledvin. Ve třetím protokolu byla myším C57BL/6 podávána AA (3 mg/kg) intraperitoneálně dvakrát týdně po dobu 10 týdnů bez doby remodelace; u těchto myší byla úmrtnost ve skupině AA 83 procent (n=6), zatímco žádná z myší v kontrolní skupině s vehikulem nezemřela (n=4). V tomto protokolu jsme nemohli statisticky vyhodnotit renální fenotyp indukovaný AA kvůli vysoké mortalitě. Ve čtvrtém protokolu byla myším C57BL/6 podávána AA (3 mg/kg) intraperitoneálně dvakrát týdně po dobu 4 týdnů s následnou dobou remodelace po dobu 4 týdnů; u těchto myší byly pozorovány chronické renální léze, jako je tubulointersticiální fibróza, a renální funkční pokles [9]. Proto jsme na základě výsledků těchto předběžných výzkumů přijali čtvrtý protokol k provádění experimentů v této studii.
4.2.Měření TKSystolický TK a srdeční frekvence byly měřeny pomocí dříve popsané metody manžety na ocasu (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokio, Japonsko)[24,25]. Všechna měření byla provedena mezi 9:{6}} a 14:00. U každé myši bylo provedeno alespoň 10 měření a pro analýzu byla použita střední hodnota.
4.3. Kvantitativní analýza reverzní transkripce v reálném čase Celková RNA byla extrahována z ledvinových tkání pomocí ISOGEN (Nippon Gene, Tokio, Japonsko) a komplementární DNA (cDNA) byla syntetizována pomocí SuperScript IⅢFirst-Strand System (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Kvantitativní analýza PCR s reverzní transkripcí v reálném čase byla provedena pomocí detekčního systému CFX96 Touch Real-Time PCR (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) a produkty reverzní transkripce byly inkubovány s TaqMan PCR Master Mix a vlastní TaqMan sondou (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA), jak bylo popsáno dříve [26]. Byly použity sondy TaqMan proti následujícím genům: kolagen I(Mm00801666_g1), kolagen II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1),p53(Mm00441964 g1),p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1) a Nox2 (Mm00627011_m1). Hladiny mRNA byly normalizovány na hladiny 18S ribozomální RNA.
4.4. Analýza Western Blot Proteinová exprese byla analyzována analýzou western blot tkáňových homogenátů za použití dříve popsané metody [27,28]. Celkové proteinové extrakty byly připraveny z tkání za použití vzorkového pufru obsahujícího dodecylsulfát sodný. Koncentrace proteinu v každém vzorku byla měřena pomocí Detergent-Compatible Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) a NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), s hovězím sérovým albuminem jako Standard. Stejná množství proteinových extraktů ze vzorků tkáně byla frakcionována na 5-20 procentních polyakrylamidových gelech (ATTO Corp., Tokio, Japonsko). Separované proteiny pak byly přeneseny na polyvinylidendifluoridové membrány pomocí Semi-Dry Transfer System (ATTO Corp., Tokyo, Japonsko). Membrány byly blokovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem obsahujícím 5 procent sušeného odstředěného mléka. Membrány byly inkubovány s primárními protilátkami proti Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), NAMPT(sc-67020 1:5000; Abcam), SIRT1(07-131 1:1000, MilliporeSigma , Burlington, MA, USA), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Japonsko) a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Membrány byly promyty a inkubovány se sekundárními protilátkami po dobu 60 minut při teplotě místnosti. Místa pro reakce protilátka-antigen byla vizualizována pomocí zesíleného chemiluminiscenčního substrátu (Merck, Kenilworth, NJ, USA). Jako kontrola nanášení byl použit GAPDH. Obrázky byly analyzovány kvantitativně pomocí ChemiDoc Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
4.5. Histologická analýza byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve [29]. Renální tkáně myší byly fixovány 4% paraformaldehydem a následně zality v parafínu. Řezy (4 um silné) byly obarveny PAS a MT barvivy. Pro vyhodnocení glomerulární oblasti bylo změřeno a zprůměrováno 50 glomerulů na myš. Všechny snímky byly pořízeny pomocí mikroskopu BZ-9000 (Keyence Corp., Osaka, Japonsko).
CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU LEDVIN/RENÁL
4.6. Barvení SA- -al Renální tkáně z myší byly rychle zmraženy a upevněny ve směsi pro optimální řeznou teplotu (Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokio, Japonsko). Řezy (4 μm silné) byly připraveny pomocí kryostatu (HM550-VPD; Thermo Fisher Scientific) a připevněné na podložní sklíčka. Aktivita SA- -gal byla měřena pomocí soupravy pro detekci stárnutí (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, USA) podle protokolů výrobce. Vzorky byly pozorovány pod jasným polem při 100násobném zvětšení pomocí BZ-9000mikroskopu (Keyence Corp.. 4.7. Electron MicroscopyAnalýza elektronovou mikroskopií byla provedena, jak bylo popsáno dříve [30]. Myši byly anestetizovány isofluranem a perfundovány přes pravý aortální oblouk heparinizovaným (5 U/ml) fyziologickým roztokem a 2,5% glutaraldehydem v 0,1 mol/l fosfátovém pufru při pH 7,4. Vzorky pro transmisní elektronovou mikroskopii byly ponořeny do 1% oxidu osmičelého na 2 hodiny, sériově dehydratovány v ethanolu a uloženy do směsi Epon. Řezy UlItrathin byly obarveny acetátem uranyl a citrátem olovnatým a zkoumány pomocí transmisního elektronového mikroskopu Hitachi H-7500 provozovaného při 80 kV (Hitachi, Ltd., Tokio, Japonsko). Řezy byly pozorovány při 5000násobném zvětšení a fotografovány pomocí kamery zařízení s nábojovou vazbou.
4.8. Biochemická analýzaVzorky krve byly odebrány srdeční punkcí v nasyceném stavu. Vzorky plné krve byly centrifugovány při 3000 otáčkách za minutu (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokio, Japonsko) po dobu 10 minut při 4 stupních, aby se oddělila plazma. Výsledné vzorky plazmy byly skladovány při -80 stupních. Plazmatické hladiny kreatininu, UN a kreatininu v moči byly měřeny pomocí autoanalyzátoru Hitachi 7180 (Hitachi, Ltd., Tokio, Japonsko).
4.9. Statistická analýza Statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Data jsou uvedena jako průměr ± SEM. K porovnání rozdílů mezi skupinou vehikulum-kontrola a skupinou AA byl použit nepárový Studentův f-test.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. ZávěryPodávání AA způsobujeledvinastárnutí, spolu s tubulointersticiální fibrózou a renální atrofií. Výsledky naznačují, že renální fibróza úzce souvisí se stárnutím ledvin a že AAN může být užitečný jako aledvina- specifický model stárnutí.