Antioxidační účinek komplexního působení vitaminu E a ethylthiosulfanylátu v játrech a ledvinách potkanů ​​za podmínek oxidačního stresu vyvolaného chromem (VI)

Bohdan Kotyk^1,*, Ruslana Iskra¹, Vira Lubunets²

Abstraktní:Cílem naší studie bylo prozkoumat účinnost a přínosy komplexního účinku vitaminu E a ethylthiosulfanylátu (ETS) na stav pro/antioxidačního systému v játrech aledvinykrys ve stavu oxidačního stresu vyvolaného Cr(VI). Krysy byly rozděleny do 8 skupin.

Skupiny dostávaly: I (kontrola) - fyziologický roztok (150 ul) po dobu 7 dnů; II – olejový roztok (1 ml) po dobu 14 dnů; III, IV, VII, VIII - K2Cr2O7 (2,5 mg Cr(VI)/kg tělesné hmotnosti (bw)) pro 7 (III, IV) a pro 14 (VII, VIII); V - vitamín E (20 mg/kg ž.hm.) po dobu 14 dnů; VI, VII, VIII - vitamín E v komplexu s ETS (100 mg/kg ž.hm.) po dobu 14 dnů. Výsledky uvádějí, že K2Cr2O7 způsobil oxidační stres vyvolaný Cr(VI) v důsledku aktivace procesů peroxidace lipidů (LP). Působení Cr(VI) po dobu 7 dnů způsobilo kompenzační aktivaci antioxidačního obranného systému (AOS) v obou tkáních. Delší působení Cr(VI) však bylo doprovázeno vyčerpáním aktivity enzymu AOS a obsahu GSH. Komplexní účinek vitaminu E a ETS snížil intenzitu oxidačního stresu vyvolaného Cr(VI) v obou tkáních potkana. Naše výsledky naznačují pozitivní antioxidační vlastnosti vitaminu E a ETS za podmínek toxicity Cr(VI).

klíčová slova:krysy; antioxidační systém; oxidační stres; vitamín E; ethylthiosulfanylát; dvojchroman draselný; peroxidace.

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

Klikněte pro vstupUrdupro ledviny

1. Úvod

Aktivní používání chrómu pro průmyslové a zemědělské účely vedlo k významné akumulaci sloučenin obsahujících Cr v životním prostředí [1-3]. Sloučeniny chrómu jsou jednou z nejběžnějších znečišťujících látek ve vodních a suchozemských ekosystémech [4-6]. Hlavní průmyslová odvětví, která vyžadují aktivní používání sloučenin obsahujících Cr, jsou činění kůží, prostředky na ochranu dřeva, průmyslové svařování kovů, chromování, chromátování a výroba ferrochromátu [1]. Chrom je přírodní kov, který se vyskytuje většinou ve dvou různých formách: trojmocný chrom (Cr(III)) a šestimocný chrom (Cr(VI)). Cr(III) je posledním stupněm oxidace chrómu. Trojmocná forma chrómu je běžná ve všech biologických systémech, je termodynamicky stabilní a vykazuje silné vlastnosti pro tvorbu koordinačních sloučenin. Šestimocná forma (Cr(VI)) vykazuje silné toxické a karcinogenní vlastnosti a je obvykle prezentována jako kyslík obsahující sloučeniny chromanů (CrO42-) a dichromanů (Cr2O72-) ​​[1,7]. Vysoká toxicita sloučenin Cr(VI) je spojena se schopností snadno se absorbovat a rychle transportovat do buněk sulfátovými kanály [8,9]. Poté se Cr(VI) po průniku do buňky v několika fázích redukuje na Cr(III). Během procesu redukce Cr(VI) vzniká velké množství reaktivních forem kyslíku (ROS) [10,11]. Aktivace tvorby ROS vede následně k rozvoji oxidačního stresu a poškození tkání. Procesy redukce Cr(VI) jsou také doprovázeny cytotoxicitou, genotoxicitou, karcinogenitou a apoptózou prostřednictvím modulace regulačního genu p53 [12- 15]. Systém AOS je hlavní bariérou v boji proti oxidativnímu stresu vyvolanému Cr(VI) [9]. Enzymatické a neenzymatické složky systému AOS, jako jsou flavoenzymy závislé na GSH a NADPH, stimulují a urychlují redukci vysoce toxického Cr(VI) na mnohem méně toxický Cr(III). Enzymy jako SOD, CAT, GP a neenzymatický tripeptid GSH zase neutralizují mnoho ROS, které se tvoří při redukci Cr(VI) [16,17]. Avšak prodloužený oxidační stres vyvolaný Cr(VI) vede k vyčerpání zdrojů systému AOS a vyvolává poškození buněk, tkání a oxidačních orgánů v důsledku zvýšených prooxidačních procesů [9,18]. Sloučeniny obsahující Cr(VI), jako je dichroman draselný (K2Cr2O7) v dávce 8 mg/kg tělesné hmotnosti způsobuje akutní hepatotoxicitu u potkanů ​​v důsledku zvyšujících se nekrotických a zánětlivých procesů a vyčerpání systémových zdrojů AOS v jaterní tkáni zvířat [19 ]. Jednorázová subkutánní injekce K2Cr2O7 v dávce 10 mg/kg má rovněž za následek oxidační stres vyvolaný Cr(VI) a poškození jaterní tkáně potkana, následované degenerativními změnami v histoarchitektuře a dilatací jaterních sinusoid. Podobná dávka Cr(VI) způsobuje degenerativní změny tubulárních epiteliálních buněk, cystickou dilataci tubulů, kongesci krevních cév, hyalinní odlitky a dilataci Bowmanova prostoru vledvinykrys [14]. Hepato- a nefrotoxicita způsobená K2Cr2O7 je doprovázena akutním oxidačním stresem indukovaným Cr(VI). Toxicita vyvolaná Cr(VI) stimuluje zejména tvorbu ROS, hyperaktivaci peroxidačních procesů, inhibici aktivity antioxidačních enzymů, snížení buněčného GSH, jakož i depleci neproteinových sulfhydrylových skupin a akumulaci Cr(VI). játra aledvinykrys a myší [14,20,21]. Předpokládá se, že udržení antioxidačního stavu je důležitým faktorem pro snížení a prevenci negativních účinků oxidačního stresu vyvolaného Cr(VI) [14,22,23]. Neutralizace Cr(VI) se provádí enzymatickou redukcí na Cr(V) a následnou transformací na soli obsahující Cr za účasti GR a NADPH. Neenzymatické antioxidanty jako vitamin E, kyselina askorbová, N-acetylcystein, česnekový prášek a GSH mají schopnost snižovat oxidační poškození způsobené K2Cr2O7 [24,25]. Vitamin E je považován za nejúčinnější v tucích rozpustný neenzymatický antioxidant, který chrání buněčnou membránu před radikály indukovanou peroxidací, stimuluje aktivaci antioxidačních enzymů a snižuje intenzitu oxidačního stresu způsobeného toxicitou vyvolanou těžkými kovy. Působení vitaminu E v dávce 100 a 125 mg/kg tělesné hmotnosti po dobu 2 a 6 týdnů snižuje hladinu peroxidačních procesů vyvolaných K2Cr2O7- a obnovuje obsah GSH a aktivitu SOD v játrech aledvinykrys [14,19,22]. Vitamin E v dávce 125 mg/kg tělesné hmotnosti také vykazuje antioxidační a protizánětlivé vlastnosti a snižuje intenzitu toxicity vyvolané Cr(VI) v játrech aledvinykrys [22].

Ethylthiosulfanylát patří do třídy thiosulfonátových sloučenin. Thiosulfonáty jsou syntetické analogy přírodních biologicky aktivních organosírových sloučenin získaných z česneku, cibule, brokolice a květáku. Thiosulfonáty jsou stabilnější než jejich přírodní analogy, vykazují širokou škálu biologických vlastností a vyznačují se nízkou toxicitou. Mnoho výzkumníků v posledních letech studovalo protirakovinné, protizánětlivé, antifungální, antimikrobiální a imunomodulační vlastnosti thiosulfonátů. Neexistují však dostatečné studie o antioxidačních vlastnostech thiosulfonátů. Je známo, že thiosulfonáty jsou schopny modulovat transkripční faktory, které se podílejí na aktivaci genů systému AOS [26,27]. Antioxidační účinek těchto sloučenin se projevuje ve schopnosti snižovat intenzitu deplece GSH poolu a tvorby thiobarbiturových reaktivních látek (TBARS) v játrech potkana v podmínkách oxidačního stresu [28]. O antioxidačních vlastnostech thiosulfonátů při toxickém působení těžkých kovů je známo jen velmi málo. Přírodní organické sloučeniny síry však prokázaly pozitivní antioxidační účinek proti oxidačnímu stresu vyvolanému Cr(VI) [23, 29-31]. Naše předchozí studie také ukazují, že ethylthiosulfanylát vykazuje antioxidační vlastnosti a částečně eliminuje negativní účinky oxidačního stresu vyvolaného K2Cr2O7- v jaterní tkáni potkana [32].

Vzhledem k pozitivním antioxidačním vlastnostem vitaminu E, stejně jako thiosulfonátů a jejich přírodních analogů, se naše studie zaměřila na zkoumání účinnosti a přínosů komplexního účinku vitaminu E a ethylthiosulfanylátu na stav pro/antioxidačního systému v játrech. aledvinykrys ve stavu oxidačního stresu vyvolaného Cr(VI).

2. Materiály a metody

Část «Materiály a metody» byla připravena analogicky s naší předchozí publikací [32].

2.1. Experimentální design.

V naší práci jsme použili 40 samců potkanů ​​Wistar o hmotnosti 130- 140g. Vytvořili jsme 8 skupin zvířat (5 potkanů ​​na skupinu): 1 kontrolní skupina a 7 experimentálních skupin. Všechny krysy byly chovány ve standardních podmínkách a dostávaly standardní krmivo a pitnou vodu ad libitum.

Intaktní kontrolní potkani ve skupině I dostávali jednu intraperitoneální injekci fyziologického roztoku (150 ul) jednou denně po dobu 7 dnů. Zvířatům experimentálních skupin III a IV byl intraperitoneálně podáván K2Cr2O7 rozpuštěný ve 150 ul fyziologického roztoku (koncentrace Cr(VI) 2,5 mg/kg tělesné hmotnosti) po dobu 7, respektive 14 dnů.

Skupina II dostávala intragastricky 1000 ul roztoku slunečnicového oleje (ochranná známka «Oleina»; DSTU 4492: ISO 14024) jednou denně po dobu 14 dnů a bezprostředně poté byl intraperitoneálně podáván fyziologický roztok (150 µl) jednou denně po dobu 7 dnů.

Skupina V: dostávala denně intragastrickou injekci olejového roztoku vitaminu E v dávce 20 mg/kg tělesné hmotnosti po dobu 14 dnů a poté bezprostředně poté byl intraperitoneálně podáván fyziologický roztok (150 ul) jednou denně po dobu 7 dnů.

Skupina VI: dostávali denně intragastrickou injekci komplexu olejového roztoku vitaminu E [20 mg/kg tělesné hmotnosti] a ethylthiosulfanylátu (ETS) [100 mg/kg tělesné hmotnosti] po dobu 14 dnů a poté bezprostředně poté podávali denně intraperitoneální injekci 150 µl fyziologického roztoku po dobu 7 dnů.

Skupina VII/Skupina VIII: dostávala intragastricky komplexní olejový roztok vitaminu E [20 mg/kg tělesné hmotnosti] a ETS [100 mg/kg tělesné hmotnosti] po dobu 14 dnů a poté bezprostředně poté dostávala K2Cr2O7 intraperitoneálně denně v dávce 2,5 mg Cr(VI)/kg tělesné hmotnosti za den po dobu 7 dnů/14 dnů.

Veškeré manipulace se zvířaty v naší práci byly v souladu s ustanoveními Evropské úmluvy o ochraně obratlovců používaných pro experimentální a jiné vědecké účely (Štrasburk, 1986) a „Společnými etickými zásadami pro pokusy na zvířatech“ (Ukrajina, 2001). Povolení k provádění výzkumu bylo získáno od Výboru pro bioetiku Ústavu biologie zvířat NAAS ve Lvově (protokol č. 80).

Práce studovala účinky nově syntetizované sloučeniny ETS (ethyl 4- aminobenzenthiosulfonát) v komplexu s vitamínem E na tělo potkana. ETS byl syntetizován na katedře technologie biologicky aktivních látek, farmacie a biotechnologie Národní univerzity "Lviv Polytechnic" podle protokolu podrobně popsaného v článku [33, 34].

Po dekapitaci zvířat, ke které došlo v thiopentalové anestezii,ledvinybyly shromážděny. Všechny procedury zapnutyledvinybyly prováděny při 4 stupních. Výzkumným materiálem byly ledvinové homogenáty krys, které byly připraveny na 0,05 M Tris-HCl pufru o pH 7,4 v poměru 1 g tkáně a 9 ml pufru (1:9, hm./obj. ) a poté centrifugujte 15 minut při 1000 g. Po centrifugaci v získaných supernatantech byl stanoven obsah GSH, hladina produktů peroxidace a aktivita antioxidačních enzymů.

2.1.1. Skupiny zvířat.

Skupiny zvířat byly porovnány podle následujícího schématu (obrázek 1). Skupina I je intaktní kontrola ve vztahu k experimentálním skupinám III a IV, které nedostaly olejový roztok. Kontroly skupiny II ve vztahu k experimentálním skupinám V, VI, VII a VIII, které dostaly olejový roztok. Zaznamenali jsme procentuální (procentuální) změnu indikátorů pro III. a IV experimentální skupiny ve srovnání se skupinou I (intaktní kontrola). Zaznamenali jsme také procentuální změnu ukazatelů pro experimentální skupiny V, VI, VII a VIII ve srovnání se skupinou II (kontrola oleje). V závěrečné fázi jsme analyzovali procentuální změnu ukazatelů u experimentálních skupin III/IV vzhledem ke skupině I (intaktní kontrola) a porovnali ji s procentuální změnou ukazatelů u experimentálních skupin VII/VIII oproti skupině II (olejová kontrola).

2.2. Zpracovává se.

2.1.1. Koncentrace LHP.

Měření hladiny LHP (lipidových hydroperoxidů) bylo provedeno v rozporu s metodami srážení proteinů indukované kyselinou trichloroctovou a etanolem indukovaného lipidu.

extrakce [35]. Thiokyanatan amonný interaguje s lipidovými ethanolovými extrakty a iniciuje barevnou reakci. Záznam absorbance barevného produktu byl proveden spektrofotometricky (A 480 nm). Hladina LHP (SU/g tkáně) byla vypočtena jako rozdíl mezi kontrolními a experimentálními vzorky.

2.2.2 Koncentrace TBARS.

Hodnocení koncentrace TBARS (látky reaktivní s kyselinou thiobarbiturovou) je založeno na principu interakce malondialdehydu a kyseliny thiobarbiturové za podmínek kyselosti a vysoké teploty [35]. Výsledkem interakce malondialdehydu a kyseliny thiobarbiturové je barevná reakce. Barevný záznam absorbance produktu byl proveden spektrofotometricky (A 535 nm a A 580 nm) a hladina TBARS byla vypočtena jako nmol MDA/g tkáně.

2.2.3. Činnost praktického lékaře.

Měření enzymatické aktivity GP (glutathionperoxidázy) se provádí v přítomnosti GSH před a po přidání terciárního butylhydroperoxidu [35]. Vyhodnocování

aktivita GP je založena na principu rychlosti oxidace GSH. SH-skupiny molekuly GSH jsou oxidovány v přítomnosti kyseliny 2-nitrobenzoové. Dinitrofenyl anion se tvoří jako výsledek oxidace GSH. Záznam absorbance barevného produktu byl proveden spektrofotometricky (A 412 nm) a aktivita GP byla vypočtena v nmol GSH/min. × mg bílkovin.

2.2.4. Činnost GR.

Měření enzymatické aktivity GR (glutathionreduktázy) bylo provedeno v přítomnosti oxidovaného glutathionu a NADPH [35]. Hodnocení aktivity GR je založeno na principu rychlosti redukce oxidovaného glutathionu. Záznam absorbance byl prováděn spektrofotometricky (A 340 nm) po dobu 1 minuty při 37 stupních. Snižování rychlosti extinkce je indikátorem intenzity reakce. Aktivita GR byla vypočtena v umol NADPH/min. × mg bílkovin.

2.2.5. Koncentrace GSH.

Hodnocení hladiny GSH (redukovaný glutathion) je založeno na principu tvorby dinitrofenylového aniontu (barevného produktu) po navázání 2-kyseliny nitrobenzoové na SH-skupinu molekuly GSH [36]. Hodnota koncentrace GSH závisí na intenzitě barevné reakce. Barevný záznam absorbance produktu byl proveden spektrofotometricky (A 412 nm) a obsah GSH byl vypočten jako mmol GSH/g tkáně.

2.2.6. Činnost SOD.

Měření enzymatické aktivity SOD (superoxiddismutázy) bylo provedeno v přítomnosti NADH a fenazinmethosulfátu [36]. Hodnocení aktivity SOD je založeno na principu redukce nitrotetrazoliové modři. Intenzita inhibice procesu redukce nitrotetrazoliové modři indikuje intenzitu enzymové aktivity. Záznam absorbance byl proveden spektrofotometricky (A 540 nm) a aktivita SOD byla vypočtena ve standardních jednotkách na 1 mg proteinu.

2.2.7. Činnost CAT.

Měření enzymatické aktivity CAT (katalázy) bylo provedeno v přítomnosti molybdenových solí, které interagují s peroxidem vodíku [36]. V důsledku reakce se vytvořil barevný produkt. Barevný záznam absorbance produktu byl proveden spektrofotometricky (A 410 nm) a aktivita CAT byla vypočtena v mmol/minutu x 1 mg proteinu.

2.2.8. Koncentrace bílkovin.

Koncentrace celkového proteinu v tkáňových homogenátech byla měřena Lowryho metodou [37] s použitím souprav "Simko LTD" (Ukrajina, Lvov). Měření všech hodnot absorbance bylo provedeno na spektrofotometru "Unico" 1205 (USA).

2.3. Statistická analýza.

Všechna experimentální data byla statisticky analyzována softwarem Microsoft Excel s použitím jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA) a Tukey-Kramerova testu. Všechny experimentální hodnoty byly vypočteny jako střední hodnoty (M) ± standardní chyba (SEM) a byly považovány za statisticky významné při P <>

3. Výsledky a diskuse

Sekce «Výsledky a diskuse» byla připravena analogicky s naší předchozí publikací [32].

3.1. Markery oxidačního stresu.

Zjistili jsme, že intraperitoneální podávání dichromanu draselného po dobu 7 a 14 dnů vede ke zvýšení obsahu markerů oxidačního stresu v tkáni jater a ledvin potkaních samců. Expozice K2Cr2O7 v dávce 2,5 mg Cr(VI)/kg tělesné hmotnosti po dobu 7 (skupina III) a 14 dní (skupina IV) způsobila významné zvýšení obsahu TBARS v játrech zvířat ve srovnání se skupinou I (kontrola) o 69, respektive 75 procent (tabulka 1). Hladina TBARS byla také významně zvýšena v ledvinové tkáni krys III a IV experimentální skupiny ve srovnání s kontrolou o 41 a 46 procent, v daném pořadí. Podobná dávka Cr(VI) vedla k významnému zvýšení koncentrace LHP v krysích játrech pokusných skupin III a IV ve srovnání se skupinou I o 112 a 127 procent, v daném pořadí. Hladina LHP byla také významně zvýšena v tkáni ledvin potkanů ​​po 7 (skupina III) a 14 dnech (skupina IV) působení Cr(VI) ve srovnání s kontrolní skupinou o 39, respektive 56 procent.

Důvodem zvýšení intenzity procesu peroxidace v játrech a ledvinách potkanů ​​je Cr(VI)-indukovaná hyperaktivace tvorby hydroxylových a superoxidových radikálů. Tvorba ROS indukovaná Cr(VI) způsobuje poškození struktury lipidových složek buněčné membrány a v důsledku toho vyvolává zvýšení obsahu TBARS [19,20,38]. Meziprodukty redukce Cr(VI) vstupují do Fentonových reakcí, interagují s peroxidem vodíku a iniciují hydroxylové radikály [19]. Podle literatury Cr(VI) zvyšuje intenzitu tvorby superoxidových radikálů aktivací enzymatických komplexů NADPH-oxidázy [39] a xanthin-xanthinoxidázy [40].

Intragastrické podávání vitaminu E (skupina V) a vitaminu E v komplexu s ETS (skupina VI) během 14 dnů vedlo k významnému snížení obsahu TBARS v játrech zvířat ve srovnání se skupinou II o 13, respektive 16 procent (tab. 1). Mírný pokles hladiny TBARS byl také zaznamenán v ledvinové tkáni potkanů ​​V a VI experimentální skupiny ve srovnání se skupinou II o 5, respektive 3 procenta. Obsah LHP byl významně snížen v experimentálních skupinách V a VI v játrech potkanů ​​ve srovnání se skupinou II o 12 a 16 procent, v daném pořadí. Došlo také k významnému snížení hladiny LHP v tkáni ledvin potkanů ​​podobných experimentálních skupin ve srovnání se skupinou II o 10 a 8 procent, v daném pořadí.

Obsah TBARS v játrech potkana zůstal na úrovni ukazatelů skupiny II po 14 dnech komplexní předléčby vitaminem E a ETS dalším aktinem Cr(VI) po dobu 7 dnů (skupina VII). Předchozí komplexní účinek vitaminu E a ETS dalším působením Cr(VI) po dobu 14 dnů vedl ke zvýšení hladiny TBARS v jaterní tkáni skupiny VIII ve srovnání se skupinou II o 23 procent. Nicméně zvýšení obsahu TBARS v jaterní tkáni zvířat skupiny VIII (23 procent) ve srovnání se skupinou II bylo o 52 procent nižší než procentuální zvýšení obsahu TBARS v játrech potkanů ​​skupiny IV (75 procent) ve srovnání se skupinou I .

Koncentrace TBARS se ve tkáni ledvin potkana zvýšila po 14 dnech komplexní předléčby vitaminem E a ETS dalším působením Cr(VI) po dobu 7 (skupina VII) a 14 dnů (skupina VIII) oproti skupině II o 21 resp. 31 procent, resp. Intenzita zvýšení obsahu TBARS v ledvinách potkanů ​​skupin VII (21 procent) a VIII (31 procent) ve srovnání se skupinou II však byla o 25 a 21 procent nižší než procentuální zvýšení hladiny TBARS v ledvinových homogenátech skupin III (46 procent) a IV (52 procent) ve srovnání se skupinou I.

Komplexní předléčení vitamínem E a ETS dalším aktinem Cr(VI) po dobu 7 dnů (skupina VII) a 14 dnů (skupina VIII) způsobilo zvýšení obsahu LHP v jaterní tkáni potkanů ​​ve srovnání se skupinou II o 17 a 52 procent , resp. Zvýšení hladiny LHP v játrech potkanů ​​skupin VII (17 procent) a VIII (52 procent) ve srovnání se skupinou II však bylo o 97 a 75 procent nižší než procento zvýšení obsahu LHP v jaterních homogenátech skupiny III (114 procent). ) a IV (127 procent) ve srovnání se skupinou I.

Koncentrace LHP se zvýšila v ledvinách zvířat skupiny VII a VIII ve srovnání se skupinou II o 16 a 31 procent, v daném pořadí.

Nárůst obsahu LHP v ledvinách potkanů ​​skupin VII (16 procent) a VIII (31 procent) ve srovnání se skupinou II byl však o 23 a 25 procent nižší než procentuální zvýšení hladiny LHP v ledvinové tkáni skupiny III (39 procent). ) a IV (56 procent) vzhledem ke skupině I.

Literární údaje uvádějí, že vitamin E se vyznačuje účinnými antioxidačními vlastnostmi, inhibuje procesy peroxidace lipidů a snižuje hladiny ROS in vitro a in vivo [22]. Perorální podávání vitaminu E zmírňuje hepatotoxicitu indukovanou Cr(VI) a snižuje obsah TBARS v játrech potkanů ​​[19]. Důvodem poklesu intenzity peroxidačních procesů v jaterní tkáni potkana může být také antioxidační vlastnost sulfo jiné skupiny, která je strukturální složkou molekuly ETS [32,42,43]. Tato funkční skupina má vlastnosti pro snížení obsahu LHP [41]. S-alkylthiosulfonáty, které jsou syntetickými strukturními analogy ETS, inhibují aktivitu xanthin-xanthinoxidázového systému a tvorbu ROS [27]. Vitamin E je důležitou součástí cytoplazmy a buněčné membrány. Antioxidační účinek vitaminu E zabraňuje aktivaci řetězových reakcí autooxidace lipidů v důsledku neutralizace peroxylových a alkoxidových radikálů. Peroxylové radikály také reagují rychleji s vitaminem E než s lipidy buněčné membrány [14].

Toxický účinek Cr(VI) tedy vede ke zvýšení obsahu TBARS a LHP v jaterní a ledvinové tkáni zvířat. Předchozí vliv vitaminu E s ETS však snižuje intenzitu peroxidačních procesů v játrech a ledvinách potkanů ​​při působení oxidačního stresu vyvolaného Cr(VI).

3.2. Glutathionový antioxidační systém.

Došlo ke zvýšení aktivity GP v jaterní tkáni potkanů ​​působením Cr(VI) po dobu 7 (skupina III) a 14 dní (skupina IV) ve srovnání se skupinou I o 55 a 15 procent (tabulka 2).

Intraperitoneální podávání dichromanu draselného po dobu 7 dnů (skupina III) způsobilo zvýšení obsahu buněčného GSH v jaterní tkáni potkana o 12 procent ve srovnání s kontrolou (skupina I). Hladina GSH se nelišila od kontrolních hodnot v ledvinách zvířat skupiny III (K2Cr2O7 14 dní). Po 14 dnech působení Cr(VI) (skupina IV) ve srovnání se skupinou I však došlo ke snížení zásoby GSH v játrech a ledvinách krys o 34 procent, respektive o 36 procent. Vysoká citlivost ledvinové tkáně na toxicitu vyvolanou Cr(VI) může být zase důvodem inaktivace GP v ledvinách zvířat skupiny IV [1, 16].

Autoři také naznačují, že mechanismus inaktivace GP za podmínek toxicity Cr(VI) se provádí připojením Cr(VI) k aktivnímu místu enzymu a přímým vytěsněním kofaktorů-kovů z aktivního místa [25].

Aktivita GR se v játrech zvířat skupiny III ve srovnání s kontrolou nezměnila. Ale 14 dní expozice Cr(VI) vedlo ke snížení aktivity GR v krysí jaterní tkáni zvířat o 17 procent ve srovnání se skupinou I. Inhibice aktivity GR byla také pozorována v ledvinové tkáni zvířat po 7 (skupina III) a 14 dní (skupina IV) injekce K2Cr2O7 ve srovnání se skupinou I o 45 a 43 procent.

Předpokládáme, že Cr(VI)-indukovaný pokles obsahu GSH může být důvodem suprese GR v obou tkáních potkanů ​​[44-46]. Molekuly GSH zajišťují přímou neutralizaci volných radikálů, hrají klíčovou roli v mechanismech antioxidační ochrany buněk [47] a podílejí se na procesech redukce Cr(VI) [19]. Pokles obsahu GSH v játrech potkanů ​​postižených Cr(VI) může být tedy důsledkem intenzivního používání molekul GSH v procesech neutralizace ROS a volných radikálů za podmínek oxidačního stresu vyvolaného K2Cr2O7-.

Literární údaje také popisují přímý mechanismus inhibice aktivity GR v důsledku specifické vazby těžkého kovu na thiol/thiolátový redox pár a histidinový zbytek v katalytickém centru redukované formy enzymu. Pak vázaný kovový ion způsobuje změny v ohybu isoaloxazinového kruhu FAD a hydrofobnosti jeho mikroprostředí. V důsledku toho je inhibována enzymatická aktivita GR [48].

Podávání vitaminu E (skupina V) a vitaminu E v komplexu s ETS (skupina VI) způsobilo zvýšení hladiny GSH v játrech potkanů ​​ve srovnání se skupinou II o 15, respektive 21 procent. Předchozí komplexní účinek vitaminu E a ETS dalším působením Cr(VI) po dobu 7 (skupina VII) a 14 dní (skupina VIII) vedl ke zvýšení obsahu GSH v jaterní tkáni ve srovnání se skupinou II o 21 a 23 procent , resp.

Nezjistili jsme statisticky významný rozdíl ve změnách obsahu GSH v živočišných tkáních po podání vitaminu E a vitaminu E v komplexu s ETS. Pozorovali jsme pouze tendenci ke zvýšení hladin GSH v ledvinách zvířat po 14denní léčbě vitaminem E a vitaminem E v komplexu s ETS.

Vitamín E podle literatury vykazuje hepato- a nefroprotektivní vlastnosti proti toxicitě indukované Cr(VI), obnovuje obsah GSH a podporuje aktivitu enzymů AOS [14, 19]. Autoři také uvádějí, že thiosulfonáty jsou zodpovědné za Nrf2- dependentní aktivaci prvků citlivých na antioxidanty (ARE), které indukují aktivaci enzymů antioxidačního obranného systému a vychytávání volných radikálů. Aktivace ARE zprostředkovaná thiosulfonátem stimuluje aktivitu genů kódujících -GCS. Možná se podobné mechanismy podílejí na zvyšování obsahu GSH při působení ETS [26]. Literární údaje také naznačují, že stimulace ARE indukuje expresi genů GR a GS. Tyto enzymy hrají klíčovou roli v syntéze a redukci molekul GSH [49].

Molekuly thiosulfonátu mají také schopnost transformovat se na mono-, di- a trisulfidy. Je možné, že produkty transformace thiosulfonátů obsahující síru se mohou podílet na biosyntéze nových molekul GSH [29].

Komplexní předléčení vitamínem E a ETS dalším aktinem Cr(VI) po dobu 7 dnů (skupina VII) a 14 dnů (skupina VIII) vykazovalo pouze tendenci k obnovení aktivity GP a GR v játrech potkanů. Statisticky významný rozdíl jsme však v tomto případě nenašli.

Působení zejména vitaminu E (skupina V) a v kombinaci s ETS (skupina VI) po dobu 14 dnů vedlo k aktivaci GP v ledvinové tkáni zvířat ve srovnání se skupinou II o 19, respektive 22 procent. Předchozí komplexní účinek vitaminu E a ETS dalším působením Cr(VI) po dobu 7 dnů způsobil zvýšení aktivity GP u potkaních ledvin skupiny VII o 38 procent ve srovnání se skupinou II (tabulka 2). Nicméně zvýšení aktivity GP v ledvinách potkanů ​​skupiny VII (38 procent) ve srovnání se skupinou II bylo o 47 procent nižší než procento hyperaktivace GP v tkáni ledvin potkanů ​​skupiny III (85 procent) ve srovnání se skupinou I.

Aktivita GP byla naopak potlačena o 16 procent v ledvinové tkáni krys po předchozím působení vitaminu E v komplexu s ETS po dobu 14 dnů dalším působením Cr(VI) po dobu 14 dnů (skupina VIII) ve srovnání se skupinou II. Pokles aktivity GP v ledvinové tkáni zvířat skupiny VIII (16 procent) ve srovnání se skupinou II byl však o 11 procent nižší než procento inaktivace GP v ledvinách potkanů ​​skupiny III (27 procent) ve srovnání se skupinou I. zvýšení aktivity GR (8 procent) bylo pozorováno po 14 dnech komplexní expozice vitaminu E a ETS v ledvinové tkáni zvířat skupiny VI ve srovnání se skupinou II.

Předchozí komplexní působení vitaminu E a ETS dalším působením Cr(VI) po dobu 7 (skupina VII) a 14 dní (skupina VIII) způsobilo snížení aktivity GR v ledvinách potkana ve srovnání se skupinou II o 17 a 36 procent, respektive.

Intenzita poklesu aktivity GR v tkáni ledvin potkanů ​​skupin VII (17 procent) a VIII (36 procent) ve srovnání se skupinou II však byla o 28 a 7 procent nižší než procento inaktivace aktivity GR v homogenátech ledvin skupiny III. (45 procent) a IV (43 procent) ve srovnání se skupinou I.

Předpokládáme, že částečná stabilizace aktivity GP a snížení intenzity suprese GR v ledvinách potkana působením Cr(VI) bylo zprostředkováno antioxidačním účinkem komplexu vitaminu E a ETS. Výsledky výše popsaných studií ukázaly, že předchozí expozice vitaminu E a ETS zeslabila intenzitu LP procesů indukovaných Cr(VI) v ledvinách potkanů. Podle literatury je prudké zvýšení obsahu TBARS, LHP a produktů peroxidace proteinů doprovázeno narušením aktivity enzymů AOS souvisejících s GSH [50]. Je možné, že komplexní antioxidační účinek vitaminu E a ETS stabilizuje enzymatickou aktivitu GP a GR snížením obsahu LHP a TBARS v ledvinové tkáni zvířat.

Intraperitoneální injekce K2Cr2O7 po dobu 7 dnů tedy vede k mírné kompenzační aktivaci GP a zvýšení obsahu GSH v játrech potkanů. Mírná stimulace GP je také pozorována po 14 dnech působení Cr(VI). Nicméně 14denní expozice K2Cr2O7 způsobuje vyčerpání jaterního GSH poolu a inhibici GR aktivity. Cr(VI)-indukované vyčerpání obsahu GSH eliminuje v jaterní tkáni komplexní intragastrickou předléčbou vitaminu E a ETS. Působení Cr(VI) po dobu 7 dnů vede ke kompenzační aktivaci GP a supresi GR v ledvinách potkanů. Na druhé straně 14denní expozice K2Cr2O7 způsobí inaktivaci GP, GR a vyčerpání obsahu renálního GSH. Předchozí komplexní účinek vitaminu E a ETS zeslabuje intenzitu inaktivace GR a stabilizuje aktivitu GP v tkáni ledvin potkana v podmínkách oxidačního stresu vyvolaného K2Cr2O7-.

3.3. Antioxidační enzymy.

Intraperitoneální injekce dichromanu draselného po dobu 7 a 14 dnů vedla ke snížení aktivity SOD v jaterní tkáni zvířat skupiny III a IV vzhledem ke skupině I o 17 a 33 procent, v daném pořadí (tabulka 3). Aktivace SOD byla pozorována po 7 dnech léčby Cr(VI) v tkáni ledvin potkanů ​​skupiny III (21 procent), ale 14 dní působení Cr(VI) způsobilo potlačení enzymatické aktivity SOD v ledvinách zvířat skupiny IV (18 procent ) ve srovnání se skupinou I.

Aktivita CAT se zvýšila o 11 procent po 7 dnech expozice Cr(VI), ale 14 dní podávání K2Cr2O7 bylo doprovázeno poklesem aktivity CAT o 13 procent v jaterní tkáni potkanů ​​skupiny IV ve srovnání se skupinou I. Cr(VI ) toxicita po dobu 7 dnů vedla k aktivaci CAT (o 15 procent), ale toxicita K2Cr2O7 po dobu 14 dnů způsobila snížení enzymatické aktivity CAT v ledvinové tkáni zvířat skupiny IV ve srovnání se skupinou I.

Autoři uvádějí, že důvodem aktivace SOD (játra a ledviny) a CAT (játra) v potkaních tkáních skupiny III může být overexprese antioxidačních genů nebo kompenzační mechanismy systému AOS proti oxidačnímu stresu vyvolanému Cr(VI) [51 ,52].

Analýza údajů z literatury také ukazuje, že Cr(VI) je silným inhibitorem enzymatické aktivity SOD. Možná tato data mohou vysvětlit inhibici aktivity SOD po delším toxickém aktinu Cr(VI) v tkáních potkanů ​​skupiny IV (Cr(VI) po dobu 14 dnů). Toxické působení Cr(VI) vede k inhibici enzymatické aktivity SOD a narušení molekulární struktury SOD v důsledku zintenzivnění procesů peroxidace [53]. Těžké kovy, včetně Cr(VI), mají schopnost inaktivovat enzymy AOS po přímé vazbě na aktivní místo odpovídajících enzymů [54]. Po potlačení inaktivace SOD dochází k procesu dismutace O2- na H2O2. V důsledku toho může být Cr(VI) indukovaná stimulace tvorby O2- a inhibice procesů utilizace O2- příčinou inaktivace enzymu AOS, včetně CAT [55].

Zejména vitamín E (skupina V) a v kombinaci s ETS (skupina VI) stimulovaly aktivitu CAT v jaterní tkáni zvířat ve srovnání se skupinou I o 15, respektive 33 procent. Byla zde také pravděpodobná aktivace CAT v ledvinách krys experimentálních skupin V a VI ve srovnání se skupinou II o 23 a 28 procent (tabulka 3).

Komplexní předléčení vitamínem E a ETS dalším aktinem Cr(VI) po dobu 7 dnů (skupina VII) a 14 dnů (skupina VIII) způsobilo zvýšení aktivity CAT v jaterní tkáni potkana ve srovnání se skupinou II o 17 a 9 procent, respektive. Aktivace CAT byla také pozorována v ledvinách potkanů ​​skupiny VII (13 procent) ve srovnání se skupinou II. Enzymatická aktivita CAT v ledvinové tkáni zvířat skupiny VIII však zůstala na úrovni ukazatelů skupiny II.

Literární údaje uvádějí, že vitamin E zabraňuje vyčerpání enzymatické aktivity SOD, CAT a dalších enzymů AOS v tkáních myší a potkanů ​​v podmínkách oxidačního stresu [56,57]. Vitamin E také zmírňuje oxidační stres vyvolaný Cr(VI) ve varlatech potkana díky obnovení aktivity SOD a CAT a snížení intenzity LP procesů [58].

Thiosulfonáty se podílejí na Nrf2-závislé aktivaci stimulace genu AOS [26]. Stimulace Nrf2 vede zase ke zvýšené expresi genů kódujících CAT [59]. Allicin, jeden z přirozených analogů thiosulfonátů, se podílí na aktivaci genů odpovědných za expresi SOD, CAT a Nrf2 [60]. Je možné, že výše uvedené antioxidační vlastnosti vitaminu E, thiosulfonátů a jejich přírodních analogů mohou být důvodem pro obnovení enzymatické aktivity CAT při působení oxidačního stresu vyvolaného Cr(VI).

4. závěr

O antioxidačních vlastnostech thiosulfonátů je málo známo. Je také dostatek informací popisujících ochranné vlastnosti thiosulfonátů proti toxicitě vyvolané těžkými kovy v tkáních živočišného organismu. Naše předchozí studie naznačují, že předběžné ošetření ETS může být účinné při korekci jaterní toxicity vyvolané Cr(VI) u potkaních organismů. Předpokládáme, že další studie antioxidačních vlastností ETS v kombinaci s antioxidačními sloučeninami a buněčnými redukčními činidly jsou důležité pro lepší pochopení role thiosulfonátů v mechanismech prevence oxidačního stresu vyvolaného těžkými kovy.

Zobecnění získaných výsledků ukazuje, že působení K2Cr2O7 vede k Cr(VI)-indukované hepato- a nefrotoxicitě v důsledku intenzifikace LP procesů a elevace tvorby LHP a TBARS v obou zvířecích tkáních. Systém AOS zahrnuje kompenzační mechanismy, které působí proti oxidativnímu stresu vyvolanému Cr(VI). Tyto mechanismy jsou doprovázeny aktivací SOD, CAT a GP v ledvinové tkáni, stejně jako stimulací CAT, GP a akumulací GSH v játrech krys po 7 dnech expozice Cr(VI). Delší působení Cr(VI) po dobu 14 dnů však vede k vyčerpání zdrojů systému AOS v důsledku inaktivace antioxidačních enzymů (SOD, CAT, GR, GP) a vyčerpání zásoby GSH v jaterních a ledvinových tkáních zvířat. Komplex vitaminu E a ETS vykazuje antioxidační účinek proti toxicitě vyvolané Cr(VI). Intragastrické předléčení tohoto komplexu po dobu 14 dnů se projevuje snížením Cr(VI)-indukovaných LP procesů v játrech a ledvinách potkanů. Předchozí účinek vitaminu E a ETS také zabraňuje depleci CAT a GSH v játrech, stejně jako eliminuje intenzitu inaktivace CAT, stabilizuje aktivitu GP a GR v ledvinové tkáni zvířat v podmínkách oxidace vyvolané K2Cr2O7- stres. Zejména vitamín E a v komplexu s ETS potlačuje elevaci LHP a stimuluje CAT v obou tkáních potkana. Antioxidační účinek těchto sloučenin také vede k akumulaci GSH v játrech a aktivaci GP ledvin.

Získané výsledky ukazují, že premedikace vitaminem E a ETS částečně stabilizovala Cr(VI)-indukovanou poruchu v mechanismech působení antioxidačního obranného systému v ledvinách potkana. Výsledky naší studie se navíc mohou stát součástí pozadí pro vytvoření účinných metod prevence a korekce antioxidačních a prooxidačních stavů v ledvinách postižených působením oxidačního stresu indukovaného Сr(VI).

1 Ústav biochemie adaptace a ontogeneze živočichů; Ústav živočišné biologie NAAS; Lvov; Ukrajina

2 Ústav technologie biologicky aktivních látek; Farmacie a biotechnologie Lvovské polytechnické národní univerzity; Ukrajina

Reference

1. Sahar, HO; Sherif, MS Zlepšující účinky hroznového oleje na chromem indukovanou nefrotoxicitu a oxidační stres u potkanů. Slovinský veterinární výzkum Zbornik 2020, 57, 123- 131.

2. Husain, N.; Mahmood, R. Taurine zmírňuje poškození buněk a DNA vyvolané Cr(VI): studie in vitro s použitím lidských erytrocytů a lymfocytů. Aminokyseliny2020, 52, 35-53.

3. Tian-Guang, Z.; Ya-Li, Z.; Lei, Li.; Dong-Hai, Z. Antagonistické účinky nano-selenu na poškození jater brojlerů vyvolané otravou Cr(VI) v dráze AMPK. Environmental Science and Pollution Research International 2020, 27, 41585-41595.

4. Farag, AI; El-Sherry, ES Chromem indukovaná hepatotoxicita a potenciální ochranný účinek selenu u dospělých samců albinotických potkanů: histologická, imunohistochemická a molekulární studie. Med. Univerzita J. Cairo 2020, 88, 187- 196.

5. Shih-Chang, F.; Jui-Ming, L.; Kuan-I, L.; Feng-Cheng, T.; Kai-Min, F.; Ching-Yao, Y.; Chin-Chuan, S.; Hsin-Hung, C.; Ren-Jun, H.; Ya-Wen, C.Cr(VI) indukuje ROS-zprostředkovanou mitochondriálně dependentní apoptózu v neuronových buňkách prostřednictvím aktivace signální dráhy Akt/ERK/AMPK. Toxikologie in vitro 2020, 65, 1- 16.

6. Fedala, A.; Adjroud, O.; Abid-Essefi, S.; Timoumi, R. Ochranné účinky selenu a zinku proti narušení štítné žlázy vyvolanému dichromanem draselným, oxidačním stresem a poškozením DNA u březích potkanů ​​Wistar. Environ Sci Pollut Res Int 2021

7. On, X.; Li, P. Znečištění povrchových vod na středočínské sprašové plošině se zvláštním zaměřením na šestimocný chrom (Cr6 plus): výskyt, zdroje a zdravotní rizika. Expozice a zdraví 2020, 12, 1- 17, https://doi.org/10.1007/s12403-020-00344-x.

8. Chen, YQ; Murphy, A.; Sun H.; Costa M. Molekulární a epigenetické mechanismy karcinogeneze indukované Cr(VI). Toxikologie a aplikovaná farmakologie 2019, 377, 1-9,

https://doi.org/10.1016/j.taap.2019.114636.

9. Machado, AB; Caprara, JF; Diehl de Franceschi, I.; Linden, R.; Berlese, DB; Feksa, LR Účinky chronické expozice šestimocnému chrómu ve vodě na parametry oxidačního stresu u potkanů ​​Wistar. Acta Scientiarum Biological Sciences 2019, 41, 1- 10.

10. Fatma, M.; Raghda, A.; Mohamed, M. Hepatoprotektivní potenciál esenciálního oleje Rosmarinus officinalis proti hematotoxicitě vyvolané šestimocným chrómem, biochemickým, histologickým a imunohistochemickým změnám u samců potkanů. Environmental Science and Pollution Research 2021, 28, 17445–17456.

11. Wang, Y.; Wang, X.; Wang, L.; Cheng, G.; Zhang, M.; Xing, Y.; Zhao, X.; Liu, Y.; Liu, J. Mitofágie vyvolaná poškozením mitochondriální funkce u kuřecí ledviny vystavené Cr(VI). Výzkum biologických stopových prvků 2021, 199, 703-711.

12. Zheng, X.; Li, S.; Li, J.; Lv, Y.; Wang, X.; Wu, P.; Yang, Q.; Tang, Y.; Liu, Y.; Zhang, Z. Hexavalentní chrom indukuje renální apoptózu a autofagii prostřednictvím narušení rovnováhy mitochondriální dynamiky u potkanů. Ekotoxikologie a bezpečnost životního prostředí 2020, 204, 1-9.

13. Yang, D.; Yang, Q.; Fu, N.; Li, S.; Han, B.; Liu, Y.; Tang, Y.; Guo, X.; Lv, Z.; Zhang, Z. Srdeční dysfunkce vyvolaná šestimocným chromem prostřednictvím poruchy mitochondriální funkce a dodávky energie zprostředkované Sesn2-. Chemosphere 2021, 264, 1- 10.

14. Balakrishnan, R.; Satish Kumar, CS; Rani, MU; Srikanth, MK; Boobalan, G.; Reddy, AG Hodnocení ochranné role -tokoferolu na hepatotoxicitu a nefrotoxicitu způsobenou chrómem u krys vyvolanou volnými radikály. Indian Journal of Pharmacology 2013, 45, 490-495.

15. Zhang, Y.; Bian, H.; Smět.; Xiao, Y.; Xiao, F. Hyperaktivní mitofágie vyvolaná Cr(VI) přispívá k mitochondriální ztrátě a cytotoxicitě v hepatocytech L02. Biochemical Journal 2020, 477, 2607-2619.

16. Saidi, M.; Aouacheri, O.; Saka, S.; Tebboub, I.; Ailene, L. Nefronově ochranné účinky kurkumy na oxidační poškození a oxidační stres u potkanů ​​při subchronické otravě chrómem. Int. J. Biosci 2019, 15, 241-250.

17. Li, J.; Zheng, X.; Ma, X.; Xu, X.; Du, Y.; Lv, Q.; Li, X.; Wu, Y.; Sun, H.; Yu, L.; Zhang, Z. Melatonin chrání před poškozením srdce vyvolaným chrómem (VI) prostřednictvím aktivace dráhy AMPK/Nrf2. Journal of

Anorganická biochemie 2019, 197, 1- 10.

18. Science Direct.

19. Shati, AA Zlepšující účinek vitaminu E na hepatotoxicitu vyvolanou dvojchromanem draselným u potkanů. Časopis King Saud University - Science2014, 6, 181- 189.

20. Khalaf, AA;Hassanen, EI;Ibrahim, MA;Tohamy, AF;Aboseada, MA;Hassan, HM;Zaki, AR

Kyselina rozmarinová zmírňuje chrómem indukované oxidační poškození jater a ledvin a poškození DNA u potkanů. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology 2020, 34, 1- 12.