Účinky proti stárnutí extraktu z kalusové kultury Leontopodium Alpinum (protěže Edelweiss) prostřednictvím profilování transkriptomu, část 2
May 06, 2022
prosím klikněteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
2.9. Měření elasticity kůže
Elasticita kůže byla analyzována pomocí Cutometer MPA 580（Courage & Khazaka, Köln, Německo）. Na toto zařízení byla pro test namontována sonda o průměru 2 mm. Jako podmínka měření byl použit režim 1 nebo režim časového napětí. Čas zapnutí 2.0s a čas vypnutí 2,0 s byly poté aplikovány na specifikovaný podtlak v režimu 1 (450 bar) a měření byla provedena třikrát po sobě. Byly měřeny tři různé hodnoty parametrů, R2 (hrubá elasticita), R5 (čistá elasticita) a R7 (biologická elasticita).
2.10. Měření dermální hustoty a tloušťky kůže
Dermální hustota a tloušťka kůže na tváři byly analyzovány pomocí Dermascan-C (Cortex Technology, Hadsund, Dánsko), zobrazovacího zařízení s vysokým rozlišením využívajícím 20-MHz nadzvukové vlny, které je velmi užitečné při neinvazivním pozorování změn. do vnitřních vrstev kůže. V naší studii byl použit obraz skenování B.cistanche nzNejprve jsme nastavili rychlost nadzvukových vln na 20 MHz, pro zkoušku rozetřeli kontaktní želé, umístili sondu do pravého úhlu ke kůži a mírně ji přitlačili, abychom změřili oblast tváře. Tloušťka kůže a dermální hustota byly vypočteny softwarovým systémem Dermascan-C.
Cistanche může působit proti stárnutí
Snímky obličeje byly fotografovány za stejných fotografických podmínek, jako je stejné světlo, digitální fotoaparát s vysokým rozlišením a fotograf. Poté byl zkoumán lifting obličeje v koutku úst pomocí analýzy Moaré na základě snímků obličeje. Jako testovací oblast jsme vybrali ústní koutek, kde je výrazná ochablá kůže. Pomocí snímků byl pomocí softwaru pro analýzu obrazu (ImagePro Plus, Rockville, MD, USA) vypočítán úhel (R) mezi vodorovnou čarou a obrysovou čarou nakreslenou v koutku úst.
2.11.Statistický test
Provedli jsme jednocestný test ANOVA pro srovnání kontrolních a testovaných vzorků. Výsledky byly uvedeny s průměrem a standardní odchylkou (průměr ± SEM). P-hodnoty p<0.05 (*),=""><0.01(*), and=""><0.001 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" declared="" statistically="" significant="" at="" the="" 0.05="" level.="" we="" used="" ibm="" spss="" statistics="" version="" 21.0="" (spss,="" chicago,="" il,="" usa)="" for="" the="" statistical="">
2.12. Příprava knihoven pro RNA-Seq a sekvenování nové generace
Pro analýzu transkriptomu byly buňky HaCaT v hustotě 1 x 10 stupňů buněk na jamku inkubovány v šestijamkové destičce po dobu 24 hodin. Poté byly buňky lidských keratinocytů (léčba) ošetřeny konečnou koncentrací 1% extraktu LACCE po dobu 24 hodin, zatímco simulovaný stav (kontrola) byl ošetřen sterilní vodou. Pro každý stav byly odebrány tři různé biologické vzorky. Celková RNA byla extrahována pomocí RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Německo) podle pokynů výrobce. Po extrakci celkových RNA z každého vzorku bylo připraveno šest různých knihoven pro RNA-Seq pomocí soupravy TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit podle pokynů výrobce. Šest různých knihoven bylo spárováno a sekvenováno systémem NovaSeq 6000 společnosti Illumina (Macrogen, Soul, Korea). Získaná nezpracovaná sekvenční data byla uložena do databáze Sequence Read Archive (SRA) Národního centra pro biotechnologické informace (NCBI) s těmito příslušnými přístupovými čísly: SRR9127735, SRR9127736, SRR9127737, SRR9127738, SRR9127733 a SRR7349127.
2.13. Mapování, normalizace a identifikace diferencovaně vyjádřených genů
Mapovali jsme čtení nezpracovaných sekvencí z každé knihovny do lidských referenčních transkriptů verze GRCh38 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/) pomocí zarovnávače BBMap s výchozími parametry (https://sourceforge .net/projects/bbmap/). Pomocí bbmap. sh, vypočítali jsme fragmenty na kilobáze milión (FPKM) hodnot pro každý transkript. Získané hodnoty FPKM z každého stavu byly podrobeny programu DEBrowser pro normalizaci a analýzu odlišně exprimovaných genů (DEG)[19].velikost penisu cistancheHodnoty FPKM menší než 1 byly vymazány. Pomocí EdgeR s TMMnormalizační metodou a nejpřesnějším typem jsme identifikovali odlišně exprimované geny podle upravených p-hodnot nižších než 0.001 a log2 převedených násobných změn více než jedné.
2.14. Analýza obohacení termínů genové ontologie (GO).
Pro analýzu obohacení GO termínu jsme identifikovali DEG na základě upravených p-hodnot nižších než 0.05 a log2 převedených násobných změn vyšších než 0,5. Jako výsledek bylo identifikováno 22 up-regulovaných a 13 down-regulovaných genů. Každý soubor genů byl podroben analýze obohacení pomocí programu GORILLA s výchozími parametry (http:/cbl-gorilla.cs.Technion.ac.il/)[20]. Vybrali jsme dva neseřazené seznamy genů jako provozní režim s použitím 11 290 exprimovaných genů jako sady pozadí.
3. Výsledky
3.1. Příprava LACCE z Edeluweiss
LACCE byl získán, jak je znázorněno na obrázku 1. Stručně řečeno, semena protěže byla nejprve sterilizována a naklíčena (obrázek 1A). Kalus byl indukován z listů vyklíčených semen (obrázek 1B) a podroben suspenzní buněčné kultuře (obrázek 1C). Suspenzní buňky byly kultivovány v bioreaktorech pro produkci LACCE ve velkém měřítku (obrázek 1D).cistanche prášekKultivované buňky byly sklizeny a lyofilizovány pro další studium (obrázek 1E). LACCE byl připraven extrakcí teplem. Různé koncentrace LACCE byly použity pro více testů in vitro (0,1 procenta, 0,5 procenta a 1 procento), in vivo (1 procento) a transkriptomové (1 procento) analýzy.
Obrázek 1. Experimentální postup pro získání extraktu kultury kalusu Leontopodium Alpinum (LACCE) z kalusu protěže za použití bioreaktoru. (A) Semena protěže byla sterilizována a naklíčena. (B) Kalus byl indukován z tkáně listu protěže. (C) Indukovaný kalus byl kultivován v suspenzi. (D)Získané buňky byly kultivovány v bioreaktoru. (E) Buňky kalusu byly sklizeny a lyofilizovány ve velkém množství.
3.2. In vitro hodnocení LACCE jako činidla proti stárnutí
Provedli jsme test 3-(4,{2}}dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidu (MTT), abychom sledovali životaschopnost buněk po ošetření LACCE. V této studii jsme použili imortalizované buňky místo primárních lidských kožních buněk z následujících důvodů. Nesmrtelné buněčné linie mají mnoho výhod, včetně snadné práce, nízké ceny a neomezené dodávky materiálu.extrakt z cistanche salsyKromě toho můžeme přeskočit mnoho etických problémů souvisejících s používáním lidských tkání. Dále jsou imortalizované buněčné linie přednostně využívány pro studium základních biologických procesů, jako je RNA-sekvenování (RNA-Seq). Dvě různé buněčné linie, HaCaT a Detroit551, byly ošetřeny třemi různými koncentracemi LACCE (0,1 procenta, 0,5 procenta a 1 procento). Životaschopnost buněk HaCaT i Detroit551 buněk po ošetření LACCE byla srovnatelná s kontrolou (obrázek 2). Podrobně byla buněčná životaschopnost buněk HaCaT mírně snížena z 98,61 procenta (0,1 procenta LACCE ) na 94,72 procenta (1 procento LACCE), když se koncentrace LACCE zvýšila (obrázek 2A). Naproti tomu buněčná životaschopnost buněk Detroit551 se mírně zvýšila z 95,99 procent (0,1 procenta LACCE) na 99,95 procent (1 procento LACCE), když se koncentrace LACCE zvýšila (obrázek 2B).
Obrázek 2. In vitro hodnocení LACCE jako činidla proti stárnutí, včetně cytotoxicity a antioxidační aktivity. Životaschopnost buněk pro tři různé koncentrace (0,1 procenta, 0,5 procenta a 1 procenta) LACCE v buňkách HaCaT (A) a buňkách Detroib551 (B) testem MTT. Šedý pruh označuje buňky ošetřené destilovanou vodou. (C)HaCaT buňky byly ošetřeny peroxidem vodíku. Životaschopnost buněk pro tři různé koncentrace LACCE byla měřena pomocí 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromidu (MTT) testu. Jako pozitivní kontrola byl použit N-acetylcystein (NAC). (D) Antioxidační aktivita různých koncentrací LACCE byla měřena testem DPPH. Vitamin C (Vit. C) byl použit jako pozitivní kontrola.*a** indikují statistickou významnost s hodnotami p menšími než 0.05 a 0,01, v tomto pořadí.cistanche stonek(E) Buněčná morfologie v každém vzorku ošetřeném peroxidem vodíku byla vizualizována barvením methylenovou modří.
Kromě toho jsme provedli test MTT indukovaný peroxidem vodíku (H2O2). Obecně platí, že peroxid vodíku způsobil silnou cytotoxicitu (42,52 procenta buněčné životaschopnosti) ve srovnání s negativní kontrolou, zatímco přidání N-acetylcysteinu (NAC), antioxidantu v buňce, inhibovalo cytotoxicitu způsobenou peroxidem vodíku (6{{10 }}.24 procent buněčné životaschopnosti). Když se koncentrace LACCE zvýšila, životaschopnost buněk se zvýšila ze 45,54 procent (0,1 procenta LACCE) na 60,37 procent (1 procento LACCE) v reakci na peroxid vodíku (obrázek 2C). Zejména míra inhibice reaktivních forem kyslíku (ROS) pro 1% extrakt LACCE byla srovnatelná s mírou inhibice NAC. Kromě toho byla také pozorována buněčná morfologie po barvení methylenovou modří, což ukazuje zvýšení životaschopnosti buněk z LACCE (obrázek 2E).
Dále jsme provedli antioxidační test pomocí testu pohlcování 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylových (DPPH) radikálů (obrázek 2D). Aktivita vychytávání radikálů DPPH se zvýšila z 2,85 procenta (0,1 procenta LACCE) na 20,47 procenta (1 procento LACCE), když se zvýšila koncentrace extraktu LACCE. Ve srovnání s vitamínem C(14.05 procent) vykazovaly koncentrace 0,1 procenta i 0,5 procenta LACCE nižší aktivitu vychytávání radikálů, zatímco 1procentní koncentrace extraktu LACCE vykazovala vyšší aktivitu vychytávání radikálů.
3.3. In vitro hodnocení extraktu LACCE jako protizánětlivého činidla
Pro zkoumání protizánětlivého účinku LACCE byla pomocí RT-PCR v reálném čase kvantifikována exprese dvou genů zánětlivých markerů kódujících COX-2 a indukovatelnou syntázu oxidu dusnatého (iNOS) (obrázek 3A, B). . Obecně řečeno, UVB záření zvýšilo expresi genu COX-2 kódujícího protein, který vyvolává zánět (obrázek 3A). Ve srovnání s negativní kontrolou přidání LACCE k buňce HaCaT významně potlačilo expresi genu COX-2. Mezi různými koncentracemi LACCE však nebyly žádné významné rozdíly. Ve srovnání s pozitivní kontrolou obsahující dexamethason (Dex) vykazoval LACCE (0,1 procenta až 1 procento) velmi podobný protizánětlivý účinek. Exprese genu iNOS byla inhibována pozitivní kontrolou obsahující Dex a LACCE (obrázek 3B). Se zvyšováním koncentrace extraktu LACCE se postupně snižovala exprese genu iNOS.
Obrázek 3. In vitro hodnocení LACCE jako protizánětlivých, zvlhčujících a proti vráskám pomocí RT-PCR v reálném čase. Relativní exprese COX2(A) a iNOS (B), dvou zánětlivých markerových genů, v různých koncentracích LACCE v reakci na vzorky ošetřené UVB, byla měřena pomocí RT-PCR v reálném čase. Dexamethason (Dex) byl použit jako pozitivní kontrola. Šedé a modré sloupce označují buňky HaCaT bez a s UVB ošetřením. (C)Relativní exprese AOP3, pozitivního markeru pro zvlhčující účinek, v různých koncentracích LACCE. (D)Relativní exprese MMP{{10}}, markeru buněčného růstu, v různých koncentracích LACCE v reakci na UVB. Exprese jednotlivých genů byla normalizována na expresi genu GAPDH.* a* indikují statistickou významnost s hodnotami p menšími než 0,05 a 0,01, v daném pořadí.
Tento článek je převzat z Genes 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes
