Ethanolický extrakt z Cucurbita Pepo L. Semena modifikují neuroendokrinní narušení u chronicky stresovaných potkanů a nadledvin exprese zánětlivých markerů a HSP70

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Hailah M. Almohaimeed1, Shereen Hamed2, Hanan S. Seleem3,4, Ashwaq H. Batawi 5, Zuhair M. Mohammedsaleh6, Maha Jameal Balgoon7, Soad S. Ali 8,9, Soad Al Jaouni 9,10 a Nasra Ayuob11*

Pozadí: Dýně(Cucurbita pepo L.) bylo popsáno, žeantioxidantprotizánětlivé, protiúnavové a antidepresivní účinky. Nadledviny jsou důležitý orgán reagující na stres, který udržuje homeostázu během stresu.

Cíle:Cílem této studie bylo posoudit účinnost podávání přípravku Cucurbita extrakt pepo L. (CP) při zmírnění behaviorálních, biochemických a strukturálních změn v nadledviny vyvolané expozicí chronickému nepředvídatelnému mírnému stresu (CUMS) a prozkoumat mechanismus, který stojí za tímto dopadem.

Materiály a metody:Čtyřicet samců albínských potkanů bylo rozděleno do 4 skupin (n = 10): kontrolní, CUMS, fluoxetinem ošetřené a CP-léčené skupiny. Změny chování, hladina kortikosteronu, prozánětlivé cytokiny TNF-α a IL-6 a oxidanty/antioxidantprofil byl hodnocen v séru na konci experimentu. Nadledvina žlázy byly zpracovány pro histopatologické a imunohistochemické hodnocení. Genová exprese kaspázy-3 a Ki67 a proteinu tepelného šoku 70 (HSP70) byla hodnocené u nadledvin pomocí RT-PCR.

Výsledky:Extrakt CP významně snížil hladinu kortikosteronu (p< 0.001),="" immobility="" time="" (p="">< 0.001),="" and="" inflammatory="" and="" oxidative="" changes="" associated="" with="" cums-induced="" depression="" compared="" to="" the="" untreated="" group.="" the="" cp="" extract="" alleviated="" cums-induced="" adrenal="" histopathological="" changes="" and="" significantly="" reduced="">apoptóza(p< 0.001)="" and="" significantly="" upregulated="">antioxidantv séru.

Závěr:Cucurbita pepo L. účinně zlepšila chronický stres vyvolaný behaviorální, biochemické a adrenální strukturální změny většinou prostřednictvímantioxidanta protizánětlivé účinky.

Klíčová slova: dýně, stres, deprese, kaspáza-3, ki67, Hsp70,apoptóza

Cistanche, čínská bylina, má antioxidační funkci.

ÚVOD

Více než 264 milionů lidí všech věkových kategorií trpí depresí po celém světě svět (WHO, 2020). Výkon depresivních člověk je obecně chudý ve škole, v práci a v rodině. Deprese může vést k sebevraždě; takže je považován za druhý hlavní příčina úmrtí u osob ve věku 15 až 29 let (WHO, 2020). Savci mohou přežít stresující události aktivací vhodných fyziologické reakce na tyto události. Nadledviny jsou součástí osy hypotalamus-hypofýza-adrenokortikální (HPA) a sympatie – adrenomedulární osa, která udržuje homeostázu během stresu (Ulrich-Lai et al., 2006). Bylo oznámeno, že vystavení tepelnému namáhání má za následek rychlé vyjádření HSP70 v kůře nadledvin (Huang et al., 2001). Tyto proteiny sdílejí intracelulární obchodování, prezentaci antigenu,apoptózaa mnoho dalších akcí (Khar et al., 2001). Má bylo popsáno, že exogenní hormony nebo interference s endogenní hormony během kritických období vývoj, může mít trvalé účinky na fyziologické a behaviorální cesty regulované hypotalamickým neuroendokrinní obvody (Gore a Patisaul, 2010). Neuroendokrinní narušení bylo také popsáno k prodloužení koncept endokrinní poruchy tak, aby zahrnoval celou šíři integrativní fyziologie; proto je to více než hormonální rozrušení (Waye a Trudeau, 2011).

Změny v neuroendokrinní regulaci, metabolismu a stravě / mikrobiota je považována za spouštěče zánětu a předispozice k rozvoji deprese (Huang et al., 2019). Ono byla postulována tato deprese - jedna z neuropsychiatrických poruchy - a zánět mají obousměrný vztah. Zatímco deprese podporuje zánětlivé reakce, zánět podporuje neuropsychiatrické poruchy včetně deprese (Bauer a Teixeira, 2019).

Fluoxetin, klasické antidepresivum, patří mezi léky dostupné na trhu pro léčbu deprese. Nyní je považován za vznikající neuroendokrinní disruptor. Tento efekt fluoxetinu je spíše vedlejším účinkem než hlavním terapeutickým cílem u savců (León-Olea et al., 2014). Proto je potřeba pro bezpečnější antidepresiva bez vedlejších účinků na neuroendokrinní stav.

Dýně(Cucurbita pepo L.) jsou hospodářsky významné druhy pěstované po celém světě. Mají výživu a zdraví výhody, protože jsou bohaté na fenoly, flavonoidy, aminokyseliny, sacharidy a vitamíny (Wang et al., 2002). Několik výzkumů studie ukázaly, že dýně mají rozsáhlé bioaktivity, jako je jako antidiabetikum, protinádorové,antioxidant, protizánětlivé, protiúnavové a antidepresivní účinky (Wang et al., 2012; Zhang et al., 2012; Nawirska-Olszańska et al., 2013; Kim Nr et al., 2016). Tradiční medicína především ajurvédské systémy a čínština medicína používala různé části dýně, včetně masa plodů a semen (Perez Gutierrez, 2016). Ten antidepresivní účinnost Sweetme Sweet Pumpkin (SSP) a Cucurbita moschata Duch byla dříve testována in vivo studie na zvířecím modelu vyvolaném testem nuceného plavání (FST) deprese a byl srovnáván s fluoxetinem (Kim Nr et al., 2016). V jedné z relativně nedávných recenzí shrnuto že antidepresivní potraviny, jako jsou dýňová semínka, byly popsané s antidepresivním potravinovým skóre 47%, poskytující svůj antidepresivní účinek (Lachance a Ramsey, 2018). Nedávno Dotto a Chacha schválili více výzkumné studie na zvířatech a klinické studie s cílem potvrdit zlepšující účinek dýňových semen na deprese (Dotto a Chacha, 2020).

Tyto zprávy byly povzbudivé pro testování účinnostiDýněpři zmírňování dopadu chronického stresu na Nadledvinek. Proto byla tato studie provedena za účelem posouzení účinek perorálního podání Cucurbita pepo L. (CP) extrakt na zmírnění chronického nepředvídatelného mírného stresu (CUMS) - indukované behaviorální, biochemické a nadledvinové strukturovat a prozkoumat mechanismus, který stojí za tímto dopadem.

pouštní extrakt z cistanche: Antioxidace

MATERIÁLY A METODY

Extrakce a dávkování dýně

Cucurbita pepo L. (vzor poukazu: AQJ_95) byl zakoupeno na místním trhu v Džiddě v Saúdské Arábii. Byli identifikováni na Univerzitě krále Abdulazize herbář používající vzorky herbáře a flóry KSA (Chaudhary, 2001). Vzorky poukázek byly uloženy v herbáři. CP byl identifikován autory a byl ověřeno botanikem z Přírodovědecké fakulty King Abdulazizova univerzita.

Extrakce CP byla provedena podle předchozích studií (Wang a kol., 2012). Surové ovoce se slupkou bylo nakrájeno pomocí kráječ a sušení pomocí lyofilizátoru (FD5508; ilShinBioBase Co., Ltd., Korea) a poté rozdrcena elektrickým broušením stroj. Prášek prošel sítem o 40 okech, aby se získal jemný prášek a skladuje se ve vzduchotěsné nádobě. Sušený prášek (50 g) byl smíchán se 450 ml 80% ethanolu a ponechán po dobu 1 dne při 37° C v třepačce (JSSI-100T; JS Research Inc., Kompaktní třepání Inkubátor., Korea) a poté byl filtrován bavlnou a filtrem papír druhý den. Tento proces extrakce byl opakován dvakrát při teplotě 37 °C, aby se získal ethanolový extrakt.

Identifikace složek KP

Chemické složení PE bylo analyzováno pomocí stopového plynu chromatografie GC-TSQ evo 8000 hmotnostní spektrometr (Thermo Scientific, Austin, TX, Spojené státy) s přímou kapilárou kolona TG–5MS (30 m × 0,25 mm × tloušťkou filmu 0,25 μm). Teplota kolonové pece byla původně nastavena na 50 °C a poté zvýšena o 5° C/min až 250° C a držené po dobu 2 minut a poté zvýšena na konečnou teplotu 300 °C o 25 °C/min a udržována po dobu 2 min. Teploty injektoru a přenosové linky MS byly udržovány na 270 a 260° C; helium bylo použito jako nosič plyn při konstantním průtoku 1 ml/min. Zpoždění rozpouštědla bylo 4 min a zředěné vzorky o objemu 3 μl byly injikovány automaticky použití automatického podavače vzorků AS1300 ve spojení s GC v bezbostrovém v PTV injektoru. Hmotnostní spektra EI byla shromážděna při 70 eV ionizační napětí v rozsahu m/z 50–650 v plném skenování režim. Teplota iontového zdroje byla nastavena na 250°C. Ten komponenty byly identifikovány porovnáním jejich hmotnosti spektra s hmotnostními spektry WILEY 09 a NIST 14 databáze, která se používá k identifikaci a studiu chemické látky složení neznámých složek v jakémkoli extraktu (Wiley, 2006; Mikaia et al., 2014). Analýza byla provedena v kvalitativní typ pomocí Thermo Scientific™ Xcalibur™ 2.2 a všechny hodnoty byly hlášeny v relativním procentu (Abd El-Kareem et al., 2016).

Experimentální design

Tato studie byla schválena Etikou biomedicínského výzkumu Výbor na Lékařské fakultě krále Abdulazize Univerzita, Džidda, KSA (referenční číslo 45-20). V tomto studie, čtyřicet samců albínských potkanů o hmotnosti 150–200 g a ve věku 2-3 měsíce byly získány od King Fahd Medical Výzkumné centrum (KFMRC). Před zahájením experimentu potkani byli ponecháni, aby se aklimatizovali na laboratorní podmínky pro 1 týden. Deset krys bylo přiděleno jako kontrolní skupina, která byla ponechány nevystavené CUMS. Zbylých třicet krys bylo podrobeno k postupu CUMS po dobu 4 týdnů, který zahrnoval různé typy stresorů v různých časech během dne, aby se zabránit návyku na stres. Postup CUMS byl plně popsané v předchozích pracích (Ayuob et al., 2016; Ali et al., 2017) a byla uvedena v tabulce 1. Krysy vystavené CUMS byly rozděleny do 3 skupin (n 10). Neléčená skupina (CUMS) obdržel vozidlo 0,03% karboxymethylcelulózy (CMC-Na) gavage po dobu 2 týdnů. Skupina léčená chřipkou obdržel FLU (Dar Al Dawa Pharmaceuticals Co., Ltd., Ammán, Jordánsko), antidepresivum používané pro farmakologická validace, rozpuštěná v CMC-Na 0,03 % při dávka 20 mg/kg žaludeční gavage (Li et al., 2014). Skupina ošetřená CP obdržela extrakt CP rozpuštěný v destilované voda v dávce 100 mg/kg gavage po dobu 2 týdnů podle Wang a kol. (2012).

Hodnocení změn chování

FST byl proveden po 4 týdnech k potvrzení účinku CUMS na krysách (Ali et al., 2017). Během tohoto testu byla každá krysa umístěné ve skleněné válcové nádobě (výška 20 cm, průměr 14 cm) s 15 cm vody při 25 ± 2° C. Krysa byla natočena na video. po dobu 6 minut používání softwaru pro chování (Noldus Information) Technologie, EthoVision XT®) a celkový strávený čas imobil během 6 minut byl měřen technikem slepý k experimentálním skupinám. Celkový čas v sekundách, utracené potkany bez pohybu končetin, s výjimkou drobný pohyb nezbytný k udržení myši nad vodou, "Doba nehybnosti" během 6 minut byla stanovena.

Biochemické techniky

Dvacet čtyři hodin po dokončení testu chování, vzorky krve byly odebrány z intraorbitálního sinusu potkanů poté, co byly anestetizován 4% isofluranem (SEDICO Pharmaceuticals Společnost, Káhira, Egypt) ve 100% kyslíku. Poté krysy byly utraceny cervikální dislokací. Vzorky krve byly odstřeďované při 3 000 ot./min po dobu 15 minut při 4° C k získání séra a byly udržovány na −18° C pro biochemické hodnocení.

Hladina kortikosteronu (ALPCO Diagnostics, Orangeburg, NY, Spojené státy) byl hodnocen pomocí enzymově vázaných soupravy pro imunosorbentní testy podle výrobce instrukce. Podle pokynů výrobce, TNF-α a IL-6 (Quantakin R&D system, USA Kit) byly hodnoceno pomocí enzymově vázaného imunosorbentního testu. Ten optická hustota každého vzorku byla stanovena duplicitně s čtečkou mikrodestiček ELISA nastavenou na 450 nm.

Souprava pro stanovení reaktivních látek kyseliny thiobarbiturové (TBARS) (Biodiagnostika; Egypt) byl použit k měření úrovně malondialdehyd (MDA) spektrofotometricky při 535 nm (Gamal et al., 2018). Hladina superoxiddismutázy (SOD) byl měřen pomocí soupravy pro stanovení SOD (biodiagnostický; Egypt) (Packer, 2002). Posouzení glutathionperoxidázy Úroveň (GPX) byla provedena pomocí sady GPX (Randox Labs, Crumlin, Spojené království). Kvantifikovat aktivitu katalázy (CAT), byla vygenerována kalibrační křivka pro zkoušku a všechny vzorky, s použitím zkušebních souprav (biodiagnostika; Egypt). Metoda je dříve popsané (Gamal et al., 2018).

pouštní cistanche extrakt výhody:anti-zánět

Kvantitativní PCR v reálném čase

Extrakce RNA ze vzorků tkáně byla provedena pomocí TriFast™ činidlo (PeqLab, Německo, kat. č.: 30-2010), jako popsané v protokolu výrobce. Koncentrace čištěné RNA byla odhadnuta pomocí NanoDrop 2000c spektrofotometr (Thermo Scientific, Spojené státy). Ten extrahovaná RNA z každého vzorku byla reverzně přepsána použití sady pro syntézu SensiFAST™ cDNA pro RT-qPCR (Bioline USA Inc., Spojené státy, kat. č.: BIO-65053), podle pokynů výrobce. Syntetizovaný cDNA byla uložena při -80° C až do využití pro qRT-PCR.

Reakce qRT-PCR byly provedeny pomocí Sada SensiFAST™ SYBR Lo-ROX (Bioline USA Inc., United Státy, kat. č.: BIO-94002) na Applied Biosystems 7500 real-time PCR detekční systém (Life technology, Spojené státy). Byly navrženy genově specifické primery pro potkany, použité v této studii. softwarem Primer3 (v.0.4.0) a jejich specifičnost byla zkontrolována pomocí programu NCBI/Primer-BLAST. Primery byly pak zakoupeno od Willowfort™ (Spojené království). Základní nátěry byly GAPDH (5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′, 5′-GGC ATGGACTGTGGTCATGAG-3′), kaspáza-3 (vpřed 5- TGT ATGCTTACTCTACCGCACCCG-3, reverzní 5-GCGCAAAGT GACTGGATGAACC-3), HSP70 (5′-ACGAGGGTCTCAAGG GCAAG-3′, 5′-CTCTTTCTCAGCCAGCGTGTTAG-3′).

Ki67 (vpřed 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA-3, reverzní 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA 3). The PCR směs byla připravena takto: 10 μl SensiFASTTM SYBR Lo-ROX mix, 0,8 μl dopředný primer, 0,8 μl reverzní primer, 2 μl šablona cDNA a 6,4 μl vody bez nukleázy. Reakční směs byl převeden na tepelný cyklovač, který byl dříve naprogramováno tak, aby drželo v úhlu 95° C po dobu 2 minut, následovaná 40 cykly 95° C po dobu 15 s a poté 60° C na 30 s. Negativní kontrola reakce neobsahující žádnou šablonu byla spuštěna v každém experimentu.

Byla provedena analýza křivky tání, aby se prokázala specifičnost PCR a byla získána hodnota Ct pro každou reakci ze zesilovacích grafů. Relativní kvantifikace pro každý gen exprese ve vzorcích tkání byla vypočtena pomocí srovnávací prahová metoda (ΔΔCt) s GAPDH jako gen vnitřní kontroly. Pro celkovou změnu složení to bylo vypočteno a linearizováno aritmetickým vzorcem 2−ΔΔCt.

Histologické techniky

Na konci experimentu a poté, co byly krysy anestetizováno, břicho bylo otevřeno a pravá nadledviny byly rozpitvány. Chcete-li získat parafínové bloky, fixace nadledvin v 10% neutrálním pufrovaném formalinu a byly provedeny další procesy. Parafínové sekce Tloušťka 4-μm byla připravena a obarvena hematoxylinem a eosin (H&E). Kromě toho byly další parafínové sekce imunohistochemicky obarvené pomocí technika streptavidin-biotin-peroxidáza. Diapozitivy byly inkubovány přes noc při teplotě 4 °C a poté byly inkubovány s monoklonálním anti-Ki67 (Dako Cytomation, Spojené státy, při zředění 1:1 000) pro demonstraci buňky šíření. Kromě toho polyklonální protilátka proti kaspáze-3 (Santa Cruz Biotechnology, Spojené státy, při zředění 1:1 000) byl použit pro detekciapoptóza. Polyklonální protilátka proti tepelnému šoku protein-70 (HSP70) (Dako, Carpinteria, CA, Spojené státy, při zředění 1:1 000) byla také použil. Odpovídající biotinylované konjugované sekundární byla použita protilátka z barvicího systému Dako. Byly použity preparáty obarvené pouze sekundární protilátkou jako negativní kontroly.

Jádra byla obarvena hematoxylinem. Hnědý cytoplazmatické barvení bylo považováno za pozitivní reakci. Ten obarvené části byly zkoumány a fotografovány pomocí Mikroskop Olympus BX-51 (Olympus) připojený k digitálnímu fotoaparát a počítač. Semikvantitativní analýza protilátek imunoreaktivita byla provedena softwarem pro analýzu obrazu Pro Plus. Byla hodnocena procentuální plocha imunopozitivní reakce ve 30 polích při zvětšení ×400. Pozitivní buňky byly započítány na ploše 1,0 mm2, jak ji popsali Zhou et al. (2016). Alespoň bylo zkoumáno pět polí z každého snímku a průměr byl vypočítané pro každé zvíře.

Pro morfometrickou analýzu byly zkoumány čtyři části v každé zvíře (zvětšení ×100). Tloušťka různých zóny nadledvin byly měřeny v mikrometrech. Ten tloušťka kůry nadledvin byla získána měřením vzdálenosti mezi dření a nadledvinovou kapslí v přímce, v každém kvadrantu nadledvin se provede jedno měření kůra.

Statistická analýza

Behaviorální, biochemické a imunohistochemické údaje byly analyzovány statistickým balíčkem pro společenské vědy (SPSS) verze 16. Proměnné studie byly ovlivněny dvěma nezávislé faktory: vystavení stresu a léčba. Proto analýza pomocí obousměrné ANOVA se smíšeným modelem na základě Bonferroni post hoc byl proveden. Statistická významnost byla zvažováno na p<>

pouštní cistanche výhody:anti-stárnutí

VÝSLEDKY

Výsledky chování

Doba nehybnosti během FST byla významně vyšší (p = 0,03) ve skupině CUMS než kontrola, zatímco byla signifikantně nižší (p=0,01, p=0,001) ve skupinách léčených CHŘIPKOU a CP než ve skupině léčené CUMS (obrázek 1A).

Výsledky analýzy extraktu CP pomocí GC-ČS

Mezi hlavní sloučeniny zjištěné v CP patří hlavně kyselina olejová (asi 56%), kyselina palmitová (asi 8,9%), kyselina linolenová 3,5% a kyselina linolová 2,8% kromě mnoha dalších sloučenin (tabulka 2; Obrázek 2). Mezi sloučeninami CP, které byly hlášeny mají protizánětlivý účinek, jsou zde kyselina olejová, kyselina palmitová, kyselina linolenová, betulin a kyselina linolová, zatímco ty, které majíantioxidantúčinek je kyselina palmitová, kyselina 10-oktadecenová a methylester.

Biochemické hodnocení

Hladina kortikosteronu v séru

Hladina kortikosteronu se významně zvýšila (p< 0.001)="" in="" untreated="" rats="" exposed="" to="" cums="" compared="" to="" that="" in="" the="" control="" rats,="" while="" those="" treated="" with="" flu="" and="" cp="" showed="" a="" significant="" reduction="" (p="">< 0.001)="" in="" serum="" corticosterone="" level="" compared="" to="" that="" in="" the="" untreated="" rats="" exposed="" to="" cums="" (figure="">

Hladiny TNF-α a IL-6 v séru

Na konci experimentu hodnocení sérových TNF-α a IL-6 ukázalo, že jsou signifikantně zvýšené (p< 0.001)="" in="" the="" cums="" group,="" whereas="" they="" showed="" a="" significant="" reduction="" (p="">< 0.001)="" in="" flu-="" and="" cp-treated="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" rats="" exposed="" to="" cums="" (figures="" 1c,="">

Úrovně MDA, SOD, GPX a CAT v Sérum

Bylo zjištěno, že hladina MDA v séru byla významně vyšší (p< 0.001)="" in="" the="" cums="" group="" than="" in="" the="" control="" rats,="" while="" that="" in="" cp-treated="" groups="" was="" significantly="" lower="" (p=""
="" 0.003)="" than="" that="" in="" untreated="" rats="" exposed="" to="" cums.="" flu="" administration="" could="" not="" significantly="" reduce="" the="" mda="" level="" in="" rats="" exposed="" to="" cums="" (figure="">

Naproti tomu hladiny SOD, GPX a CAT v séru Skupina CUMS byla významně nižší (p< 0.001,="" p="">< 0.001,="" p="0.002)" than="" those="" in="" the="" serum="" of="" the="" control="" group,="" while="" their="" levels="" showed="" a="" significant="" increase="" (p="0.01," p="0.003," p=""
="" 0.03)="" in="" the="" cp-treated="" group="" compared="" to="" those="" in="" the="" cums-exposed="" group.="" flu="" administration="" could="" not="" significantly="" increase="" sod,="" gpx,="" and="" cat="" in="" rats="" exposed="" to="" cums="" (figures="">

Genová exprese Ki67, kaspázy-3 a HSP70

RT-PCR odhalila nevýznamně vysokou genovou expresi Ki67 (p = 0,14) v nadledvinách skupiny CUMS ve srovnání s kontrolní skupina, zatímco skupina léčená CHŘIPKOU a CP vykazovala výrazně vysoký výraz (p 0,02, p 0,01) ve srovnání s tím skupiny vystavené CUMS (obrázek 3E). Pokud jde o kaspázu-3, její genová exprese byla významně zvýšený (p< 0.001)="" in="" the="" adrenal="" glands="" of="" the="" cums="" group="" compared="" to="" the="" control="" group,="" while="" that="" of="" flu-="" and="" cp-treated="" groups="" showed="" a="" significant="" decrease="" (p="0.03," p="0.04)" compared="" to="" that="" of="" the="" cums-exposed="" group="" (figure="" 3f).="" when="" it="" came="" to="" hsp70="" gene="" expression,="" it="" recorded="" significantly="" higher="" (p="">< 0.001)="" levels="" in="" the="" adrenal="" glands="" of="" the="" cums="" group="" than="" in="" the="" control="" group,="" while="" that="" of="" fluand="" cp-treated="" groups="" showed="" an="" insignificant="" decrease="" (p="0.07," p="0.08)" compared="" to="" that="" of="" the="" cums-exposed="" group="" (figure="">

Histopatologické hodnocení

Nadledviny kontrolních potkanů mají neporušenou strukturu s zachovalá architektura kůry včetně zona glomerulosa, zona fasciculata a zona reticularis, stejně jako medulla (Obrázek 4). Nadledviny potkanů vystavených CUMS ukázaly mnoho buněk v ZG, ZF a ZR se zřejmou vakuolací a degenerovaná jádra a někdy hluboce obarvená jádra s mírným zesílením v kapsli a pojivové tkáni trabekuly. Mnoho buněk ZR se zdálo tmavých s hnědou lipofuscinové pigmenty. Na druhou stranu nadledviny potkanů léčených CP vykazovaly méně zjevně vakuolizovaných buněk a hluboce obarvená jádra v ZG a ZF a ZR odhalily několik tmavých buněk.

Morfometrická měření ukázala, že tloušťka ZG a ZR vykazovaly nevýznamný nárůst po expozici CUMS, zatímco u FLU- byly významně zvýšeny (s. 0,01, p 0,02) a cp- léčené skupiny (p = 0,02, p = 0,001), v pořadí. Pokud jde o tloušťku ZF, byla významně zvýšené (p 0,02) ve skupině exponované CUMS, a byla dále zvýšena, ale nevýznamně, ve skupinách léčených chřipkou a CP ve srovnání s skupinou neléčenou CUMS.

Aby bylo možné určit, zda buněčná hyperplazie byla omezeno na určitou podoblast nadledvin, imunohistochemické značení pro Ki67 (marker dělící buňka) byla použita. Počet Ki67-pozitivních proliferující buňky byly signifikantně zvýšeny (p< 0.001)="" in="" the="" zf="" after="" exposure="" to="" cums,="" while="" treatment="" with="" flu="" and="" cp="" insignificantly="" increased="" compared="" to="" the="" untreated="" cums="" group.="" although="" the="" number="" of="" proliferating="" cells="" was="" insignificantly="" increased="" in="" the="" zg="" and="" zr="" and="" insignificantly="" decreased="" in="" the="" medulla="" of="" the="" cums="" group="" compared="" to="" the="" control="" group,="" treatment="" with="" flu="" and="" cp="" significantly="" increased="" the="" number="" of="" proliferating="" cells="" in="" the="" zg="" (p="0.001," p="0.003)," zr="" (p="">< 0.001)="" and="" medulla="" (p="0.004," p="0.003)" compared="" to="" the="" untreated="" cums="" group="" (figures="" 4,="">

Imunohistochemické barvení pomocí kaspázy-3 bylo provedené za účelem posouzeníapoptóza(Obrázek 6). Bylo zjištěno, že procentuální plocha exprese kaspázy-3 se významně zvýšila (p< 0.001)="" in="" all="" zones="" of="" the="" gland="" following="" exposure="" to="" cums="" for="" 4="" weeks="" in="" comparison="" to="" that="" of="" the="" control="" group.="" the="" cptreated="" group="" showed="" a="" significant="" reduction="" in="" caspase-3="" expression="" in="" the="" zg="" (p="">< 0.001),="" zf="" (p="">< 0.001),="" zr="" (p="">< 0.001,="" p=""
="" 0.005),="" and="" medulla="" (p="0.004," p="0.001)," in="" comparison="" to="" that="" of="" the="" cums="" group="" (figures="">

Procento plochy exprese HSP70 se výrazně zvýšilo (p< 0.001)="" in="" all="" zones="" of="" the="" cortex="" as="" well="" as="" in="" the="" medulla="" of="" the="" adrenal="" gland="" of="" the="" cums="" group="" compared="" to="" that="" of="" the="" control="" group,="" whereas="" it="" was="" insignificantly="" reduced="" in="" all="" zones="" and="" medulla="" of="" flu-="" and="" cp-treated="" groups="" compared="" to="" that="" of="" the="" cums="" group="" (figures="">

Sušené plátky Cistanche tubulosa

DISKUSE

Moderní společnost je samozřejmě plná stresu, který může vzniknout z každodenního života. problémy, zdravotní péče a problémy související s prací. Tyto stresory mohou způsobují tzv. poruchy související se stresem (Clayton a Mccance, 2014). V této studii, ethanolový extrakt z maso a kůra Cucurbita pepo L. byla použita k vyšetření jeho potenciál při zmírňování depresivního chování vyvolaného CUMS a jeho dopad na nadledviny. To bylo prokázáno významným zvýšením hladiny kortikosteronu v séru a ověřeno prodlouženou dobou nehybnosti během FST. Tato zjištění byly v souladu s těmi, které byly dříve hlášeny (Tang et al., 2015).

Jak TNF-α, tak IL-6 se údajně podílejí na patogenezi deprese (Taraz et al., 2015; Pedraz-Petrozzi et al., 2020). Bylo hlášeno, že myši s nedostatkem IL-6 nebo TNF-α receptory jsou rezistentní na depresivní chování (Viana et al., 2010). Proto byly v této studii hodnoceny a bylo pozorováno. že jak TNF-α, tak IL-6 byly významně zvýšeny v sérum potkanů vystavených CUMS po dobu 4 týdnů, což naznačuje, že byli v depresi. Toto zjištění bylo podpořeno Numakawa et al. (2014) u myší s behaviorálním zoufalstvím a Taraz et al. (2015) u pacientů s depresí.

V této studii bylo podávání dýňového extraktu spojené se zlepšením depresivního chování, patrné z výrazného zkrácení doby nehybnosti FST a potvrzeno významným snížením kortikosteron a zánětlivé cytokiny TNF-α a IL-6 u sérum. Tato zjištění podpořili Kim Nr et al. (2016) kteří uvedli, že SSP po dobu 28 dnů snížil hladinu zánětlivé cytokiny u depresivních potkanů. Protizánětlivá aktivitadýnělze připsat aktivní sloučeniny dýně, jako je olejová a palmitická kyseliny a estradiol.

Downregulace kyseliny olejové, palmitové a kyseliny linolové byl popsán v depresi (Conklin et al., 2010; Martín et al., 2010). Bylo hlášeno, že neuroprotekce zprostředkovaná kyselinou olejovou je spojena s jeho protizánětlivým účinkem zprostředkovaným peroxisomem aktivace gama receptoru aktivovaného proliferátorem (PPAR-γ) (Píseň a kol., 2019). Kromě toho byla hlášena kyselina palmitová inhibovat fosfolipázu A(2), a proto. považován za protizánětlivá sloučenina (Aparna et al., 2012). Estradiol byl jedna ze sloučenin dýně zjištěných v této studii. Bylo hlášeno, že estradiol vyvolává protizánětlivý účinek a následně zmírnit depresivní chování (Xu et al., 2015). Další mechanismus, kterým může estradiol indukovat antidepresivní účinek je upregulace exprese neurotrofického faktoru odvozeného z mozku (BDNF) a fosforylace ERK aktivací ER-β v mozku (Yang et al., 2010).

V této studii byla sérová hladina MDA zvýšena, zatímco Hladiny SOD, GPX a CAT byly sníženy u CUMS exponovaných krysy. Podobné změny byly zdokumentovány po expozici CUMS v předchozích studiích a dodali, že tyto biochemické změny vedly k oxidačnímu stresu a poškození HPA (Nabavi et al., 2015). Liu T. et al. (2015) také uvedl, že vývoj deprese může být přičítán nízké obsah antioxidantů v těle. Antioxidant vlastnostidýněextrakt z ovoce byl často hlášeno (Bahramsoltani et al., 2017). Kromě toho, maso a kůra Cucurbita pepo L. byla hlášena ke zpracování vyšší antioxidační aktivita než ostatní části, například, semena (Oyeleke et al., 2019). Podávání dýňového extraktu, v mnoho předchozích studií výrazně zvýšilo hladiny SOD a GPX a snížená MDA v séru myší (Guo-Hua et al., 2000; Dang, 2004) a tento efekt byl také zdokumentován v tato studie. Proto seantioxidantaktivita dýní by mohla být za jeho antidepresivním účinkem patrným v této studii. To je v souladu s pozorováními Kim Nr et al. (2016). Bylo to uvedl, že přírodní produkty s protizánětlivými,antioxidanta účinky proti únavě mají také antidepresivní účinek (Jeong et al., 2015). Všechny tyto předchozí aktivity byly prokázány vDýně.

Cistanche má účinek proti stárnutí

Zvýšená cytoplazmatická vakuolizace buněk kůry nadledvin, pozorované ve skupině CUMS v této studii lze připsat rostoucí poptávce po lipidech, které tvoří základní kámen pro syntéza kortizolu. Cigankova et al. (2005) pozorovali, že dlouhotrvající experimentální hyperdynamika vedla ke koalenci více cytoplazmatických lipidových kapiček kortikálních buněk. Tyto lipidy kapičky obsahují cholesterol, který je hlavním prekurzorem v syntéza steroidních hormonů. Nicméně, Koldysheva a Lushnikova (2008) uvedla, že stres vedl k významnému snížení lipidových kapiček v buňkách kůry nadledvin, zejména ZF (Koldysheva a Lushnikova, 2008). Bylo popsáno, že při vystavení fyzickému stresu jsou bolestivé podněty přenášeny na hypotalamus, což vede k sekreci CRH do hypofyzární portální systém, který zvyšuje sekreci ACTH a stimuluje jeho receptory v ZF a ZR ke zvýšení sekrece kortizolu (Patti et al., 2018). Zesílené nadledviny tobolky a trabekuly pozorované u potkanů vystavených CUMS byly dříve hlášené (El-Desouki et al., 2011; Altayeb a Salem, 2017) v důsledku zvýšené syntézy kolagenu fibroblasty na vystavení imobilizačnímu stresu.

Mnoho buněk v nadledvinách potkanů vystavených CUMS vykazovaly hluboce zbarvená jádra, což naznačuje, že podstoupila apoptóza, která byla potvrzena imunohistochemickou kaspázou-3 rezavění. Podobné pozorování hlásili Altayeb a Salem, (2017), zatímco studovali účinek imobilizace stres na nadledvinách potkanů. Liu Q. et al. (2015) uvedli, že nadměrný oxidační stres, patrný po expozici CUMS u v této studii upravte úrovně exprese "apoptóza-související genů" a indukuje buněčnou apoptózu a degeneraci prostřednictvím signální dráhy Bcl-2, Bax a kaspázy-3. Toto mechanismus byl v této studii potvrzen RT-PCR, který odhalila významnou upregulaci genové exprese kaspázy-3. Při recenzování literatury nedošlo k přímému účinku Cucurbita pepo na kaspáze-3-zprostředkované apoptóze v různých papírové kapesníky. Zdá se, že snížení kaspázy-3-pozitivní apoptotiky buňky detekované v nadledvinách byly připsányantioxidantúčinek Cucurbita pepo zdokumentovaný v této studii. To je podpořeno mnoha předchozími studiemi provedenými na jiných rostliny a byliny s významnou antioxidační aktivitou (Banagozar Mohammadi a kol., 2019; Ghazizadeh et al., 2020).

Tato studie ukázala, že expozice CUMS zvýšila Ki67- pozitivní buňky v kůře nadledvin, které byly významně patrné u ZF, což naznačuje zvýšený počet proliferujících buněk, a v důsledku toho byla tloušťka této vrstvy výrazně zvýšena. Na druhou stranu, počet Ki67-pozitivních proliferujících buněk nevýznamně snížená medulla v reakci na CUMS. Tato pozorování byla v souladu s pozorováními Ulrich-Lai et al. (2006), kteří hlásili nárůst pouze Ki67 pozitivních buněčných jader ve vnějším ZF po vystavení chronickému proměnlivému namáhání, zatímco dřeň vykazovala buněčnou hypertrofii a ne hyperplazii. Navíc Laborie et al., (2003) uvedli generalizovanou zvýšení medulární funkce po vystavení chronickému stresu, což naznačuje, že chronický stres může vést k medulární hypertrofii. V této studii je podávánídýněextrakt významně zvýšená proliferace buněk, patrná z upregulace Gen Ki67 a imunoexprese téměř ve všech zónách a dřeň nadledvin ve srovnání s CUMS. To vysvětlovalo zvýšenou tloušťku zón žláz zaznamenaných v této studii. Ono může také kompenzovat apoptotický účinek vyvolaný expozicí CUMS. Toto zjištění podporuje Kim Hy et al. (2016), kteří hlášena významná upregulace exprese mRNA Ki67 a proliferace splenocytů izolovaných ze sleziny BalB/c myši ošetřené SSP, streamované, a Cucurbita moschata Duch a jeho hlavní složka, β-karoten.

V této studii byla expozice CUMS významně zvýšená genová exprese a imunoexprese HSP70 ve všech zónách nadledvin. V souladu s tím, Zheng et al. (2008) také dokázali, že rozšířený HSP70 exprese po vystavení stresovým podmínkám moduluje zánětlivé reakce inhibicí aktivace zánětlivý transkripční faktor, jaderný faktor kappa B (NF-kappaB). Kromě toho může HSP70 přímo zasahovat do apoptóza a nekróza (Yenari et al., 2005). Nedávno Li et al. (2019) vykázal upregulaci exprese HSP70 v prasečí tkáň nadledvin po vystavení tepelnému stresu, což naznačuje úlohu HSP70 při poranění nadledvin a zdůrazňuje jeho význam pro zánětlivé reakce. Rychlý indukce HSP70 v reakci na stres je považována za nezbytnou pro proces buněčné ochrany.

V naší studii léčba potkanů vystavených CUMSDýněbyl spojené s nevýznamným snížením exprese HSP70 který byl spojen se sníženou apoptózou a zánětlivými odpovědi. To by mohlo poukazovat na příznivý účinek relativně vysoká hladina HSP70 vyvolaná jak FLU, tak CP jako to vedlo ke snížení kaspázy-3-zprostředkovanéapoptózaa uvolňování zánětlivých cytokinů. Ačkoli účinek dýní na rodinu proteinů tepelného šoku nebyl dříve popsaná kyselina olejová, která představuje hlavní složky zDýněpoužitý v této studii, byl popsán k downregulaci exprese HSP60 v buněčné linii lidských T lymfocytů (Martins De Lima et al., 2004), která podporuje naši studii nález. Navrhovaný mechanismus účinku Cucurbita pepo jako látka podobná antidepresivu je shrnuta na obrázku 7. Mezi omezení této studie patřila neschopnost dále zkoumat hloubkový mechanismus antidepresivní účinek CP, a proto je další studium povzbuzován k tomu, aby tak učinil.

Závěrem lze říci, že tato studie poskytuje vědecky podložené důkazy o účinnost extraktu Cucurbita pepo L. pro zmírnění behaviorálních a biochemických změn vyvolaných CUMS, jakož i histopatologický dopad na nadledviny. Tyto účinky byly patrné prostřednictvím downregulaceapoptózaa HSP70 a zdálo se, že je zprostředkován prostřednictvímantioxidanta protizánětlivý účinek Cucurbita pepo L. extrakt. Ačkoli tato studie a některé další nedávné studie mají dokumentoval antidepresivní účinek Cucurbita pepo a prozkoumala jeho mechanismus, další studie včetně klinických studií jsou potřebné k potvrzení tohoto účinku u lidí.

Cistanche Granule