Účinná metoda k léčbě fibrózy ledvin

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Část Ⅰ: Protein endoplazmatického retikula TXNDC5 podporuje renální fibrózu vynucením signalizace TGF ve fibroblastech ledvin

Yen-Ting Chen, Pei-Yu Jhao a kol.

Úvod

Renální fibróza, vyznačující se tubulointersticiálnímfibrózaa glomerulární skleróza, je běžným patologickým projevem většiny, ne-li všech typůchronickýledvinanemocí(CKD) (1). Progreseledvinovéfibrózau pacientů s CKD vede k postupné ztrátěledvinafunkce, což by v konečném důsledku mohlo vyústit v konečné stádium renálního onemocnění (ESRD), které vyžaduje dialýzu respledvinatransplantace (2). I když se ukázalo, že k procesu přispívají četné molekulární determinanty a dráhyfibróza ledvintransformující růstový faktor-beta (TGF-) je obecně považován za hlavní regulátor renální fibrogeneze (3). Po zraněníledvinapoškozené tubulární epiteliální buňky (TEC) jsou zastaveny ve fázi G2/M a vylučují velké množství TGF-, čímž spouští aktivaci a transformaci sousedních renálních fibroblastů na myofibroblasty (4-6). Aktivované myofibroblasty, vyznačující se expresí a-aktinu hladkého svalstva (SMA), jsou vysoce proliferativní a produkují proteiny extracelulární matrice (ECM), jako je fibrilární kolagen, elastin, fibronektin a CCN2 (běžně známý jako růstový faktor pojivové tkáně, CTGF)(7,8). Během raných fází poškození ledvin,fibrózabyla zahájena jako adaptivní a sebeomezená fyziologická reakce, která pomáhá opravovat tkáň a udržovat strukturální integritu(9). Po chronickém, opakovaném poškození ledvin však aktivace a proliferace myofibroblastů přetrvává, což vede k nadměrné produkci a akumulaci ECM, což vede ke ztrátě funkčního parenchymu ledvin a nakonec k selhání ledvin (10,11).

Klikněte pro Cistanche para que sirve pro onemocnění ledvin

Navzdory pokrokům v moderní medicíně je jen málo klinických terapií prokázáno, že jsou účinné protifibróza ledvin. Inhibitory angiotenzin-konvertujícího enzymu (ACEI) a blokátory receptorů pro angiotenzin (ARB) například prokazatelně snižují proteinurii, zlepšujíledvinovéfibrózaa zpomalit progresi CKD (12,13). Na druhé straně pentoxifylin, nespecifický inhibitor fosfodiesterázy, inhibuje expresi ECM a CCN2 indukovanou TGF{2}}, což vede k oslabení tubulointersticiálníchfibróza(14). Použití ACEI a ARB je však omezeno jejich hypotenzními účinky a potenciálními nežádoucími účinky, jako je hyperkalémie. Navíc ani léčba ACEl/ARB, ani léčba pentoxifylinem nemohla zastavit progresiledvinovéfibrózaa CKD(15,16). Je proto nezbytné identifikovat nové mediátory nebo cesty, které jsou kritické pro patogeneziledvinovéfibrózavyvinout účinná terapeutika proti CKD (chronická onemocnění ledvin).

Nedávno jsme identifikovali thioredoxinovou doménu obsahující 5 (TXNDC5), ER-rezidentní, fibroblasty obohacený protein s enzymatickou aktivitou protein disulfidizomerázy (PDI), jako kritického mediátoru srdečního onemocnění.fibróza(17). Ukázali jsme, že nadměrný TXNDC5 podporuje rozvoj srdcefibrózaprostřednictvím redox-dependentní aktivace srdečních fibroblastů a produkce ECM. Genetická delece Txndc5 zlepšuje srdeční činnostfibrózaa kontraktilní dysfunkce indukovaná agonistou u myší (17). Na základě pozorované zásadní role TXNDC5 v myokardiální fibrogenezi jsme předpokládali, že TXNDC5 by také mohl kriticky přispět k rozvoji tkáněfibrózazejména v nekardiálních orgánechfibróza ledvin.

V této studii jsme ukázali, že TXNDC5 byl vysoce upregulován v lidských i myších fibrotických ledvinách, konkrétně v renálních fibroblastech vylučujících kolagen. Globální odstranění Txndc5 výrazně zeslabilo rozsahledvinovéfibrózana více myších modelech poškození ledvin. Mechanicky jsme prokázali, že nadměrné množství TXNDC5, vyvolané TGF- 1 prostřednictvím ATF6-závislé ER stresové dráhy, zvyšujeledvinovéfibrózapodporou aktivace/proliferace fibroblastů ledvin a produkce ECM prostřednictvím posttranslační stabilizace a upregulace TGF-receptoru typu I (TGFBR1). Důležité je, že jsme ukázali, že indukce fibroblastově specifické delece Txndc5 účinně zlepšila vývoj a progresifibróza ledvinvyvolané různými typy zranění u myší, což naznačuje, že zacílení TXNDC5 by mohlo být novým a účinným přístupem k léčběledvinovéfibrózaa zachovatledvinafunkce.

Obrázek 1. TXNDC5 byl významně upregulován v myších fibrotických ledvinách a ve vzorcích ledvin od pacientů s CKD( chronická onemocnění ledvin).

(A) IHC barvení (n=3) a (B) imunobloty (n=6) ukázaly, že proteinová exprese TXNDC5 byla upregulována v myších fibrotických ledvinách indukovaných UUO nebo uIRI ve srovnání s kontralaterálními ledvinami (CL) . Měřítko: 50 μm.

(C) Kvantitativní RT-PCR ukázala, že transkript Txndc5 byl upregulován v myších fibrotických ledvinách indukovaných UUO a uIRI (n=4–7).

(D) Reanalýzy dat z mikročipů na vzorcích lidských ledvin od pacientů s CKD (GSE66494) ukázaly, že TXNDC5, COL3A1 a FN1 byly významně upregulovány v ledvinových tkáních pacientů s CKD (zdravá kontrola n=8, CKD n {{ 6}}). Pro A–C jsou data reprezentativní pro 3 nebo více nezávislých experimentálních replikátů.

Pro všechny panely jsou data prezentována jako průměr ± SEM. *P < {{0}}.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" podle="" 2-stranného="" t-testu="" (a–c)="" nebo="" mann-="" whitneyho="" test="">

Výsledek

TXNDC5 byl významně upregulován v lidských a myších fibrotických ledvinách. Prozkoumat potenciální zapojení TXNDC5 do patogenezefibróza ledvinjsme nejprve stanovili jeho hladiny proteinové exprese ve fibrotických myších ledvinových tkáních indukovaných unilaterální obstrukcí močovodu (UUO), jednostranným ischemicko-reperfuzním poškozením (uIRI) nebo podáváním kyseliny listové (FA). Imunohistochemické studie odhalily výrazné zvýšení intenzity barvení TXNDC5 v řezech ledvin ze všech 3 myších modelůledvinovéfibróza(Obrázek 1A a Doplňkový obrázek 1A; doplňkový materiál dostupný online v tomto článku; https://doi.org/10.1172/JCI143645DS1). Imunoblotting a kvantitativní reverzní transkripční PCR (RT-PCR) také ukázaly významnou upregulaci hladiny exprese proteinu (obrázek 1B) a transkriptu (obrázek 1C a doplňkový obrázek 1B) TXNDC5 ve fibrotických myších ledvinách. V souladu s těmito výsledky, reanalýza dat z mikročipů získaných ze vzorků renální biopsie pacientů s CKD (GSE66494)(18) ukázala, že hladiny exprese TXNDC5 (2,24krát, P<0.001), as="" well="" as="" of="" markers="" for="">fibróza ledvinjako COL3A1 a FN, byly také významně zvýšeny ve vzorcích ledvin od pacientů s CKD ve srovnání s těmi od zdravých kontrol (obrázek 1D a doplňkový obrázek 1C). Celkově vzato, pozorovaná upregulace exprese TXNDC5/Txndc5 ve fibrotických lidských/myších ledvinách a její pozitivní korelace s geny fibrogenního proteinu ECM naznačují potenciální roli TXNDC5 v patogenezifibróza ledvin.

Obrázek 2. TXNDC5 byl vysoce upregulován v renálních fibroblastech, ale ne v TEC, endoteliálních buňkách nebo podocytech fibrotických ledvin.

(A a C) IF barvení TXNDC5 (červeně) na řezech fibrotických ledvin indukovaných UUO u myší Col1a1-GFPTg ukázalo, že TXNDC5 byl exprimován hlavně v ledvinových fibroblastech secernujících kolagen (zelená), a to jak v kůře ledvin, tak v dřeni (n=6). Buněčná jádra byla obarvena DAPI (modrá). Měřítko: 100 μm.

(B) IF barvení TXNDC5 (zelená) na řezu fibrotických ledvin vyvolaných UUO u myší Cdh16-Cre, NPHS2-Cre a Tie2-Cre/ERT2 tdTomato. Buněčná jádra byla obarvena DAPI (modrá). Měřítko: 100 μm.

(D) Výsečový graf pro ilustraci podílu TXNDC5 plus buněk v různých typech ledvinových buněk ve fibrotických ledvinách indukovaných UUO.

Data jsou reprezentativní pro 3 nebo více nezávislých experimentálních replikací. Údaje v C jsou uvedeny jako průměr ± SEM.

TXNDC5 byl vysoce obohacen o renální fibroblasty vylučující kolagen ve fibrotických ledvinách. Na procesu fibrogeneze ledvin se podílí více typů ledvinových buněk. Po poranění ledvin bylo prokázáno, že rezidentní (19) a perivaskulární (20) renální fibroblasty se diferencují na aktivní myofibroblasty a vedou k akumulaci ECM. Bylo také uvedeno, že TEC a endoteliální buňky přispívají k rozvojifibróza ledvinpřes epiteliální a endoteliální přechod na mezenchymální (10,21). K určení typů buněk, kde byl TXNDC5 exprimován během procesu ledvinfibróza, vícenásobné reportérové ​​myší linie, které umožňují fluorescenční značení renálních fibroblastů (Colla1-GFP', GFP řízená Collal enhancerem/promotorem, ref.22), TECs(Cdh16-Cre ROSA26- tdTomato), endoteliální buňky (Tie2-Cre/ERT2 ROSA26-tdTomato) a podocyty (NPHS2-Cre ROSA26-tdTomato) byly podrobeny UUO, uIRI nebo Léčba FA k vyvolánífibróza ledvin. Imunofluorescenční (IF) barvení řezů ledvin z těchto zvířat odhalilo, že TXNDC5 byl výrazně upregulován a vysoce kolokalizován s GFP-pozitivními, kolagen vylučujícími renálními fibroblasty ve fibrotických myších ledvinách indukovaných UUO (81 procent) (obrázek 2, A a C) , uIRI (76,8 procenta) a léčba FA (73,4 procenta) (doplňkový obrázek 2, A a B). Ve fibrotických ledvinách indukovaných UUO byl TXNDC5 exprimován pouze sporadicky v TEC (5,94 procenta), podocytech (0,63 procenta) a endoteliálních buněk (2,05 procenta) (obrázek 2, B a D). Analýza průtokovou cytometrií fibroblastů izolovaných z myších ledvin vystavených UUO odhalila výraznou expanzi v ledvinových fibroblastech TXNDC5* a také významnou upregulaci TXNDC5 v těchto buňkách, ve srovnání s těmi z kontralaterálních kontrolních ledvin (doplňkový obrázek 2C). Pozorované silné obohacení TXNDC5 v renálních fibroblastech u fibrotických naznačuje, že TXNDC5 by mohl přispět kfibróza ledvinregulací aktivity/chování těchto fibrogenních buněk vylučujících kolagen.

TXNDC5 byl nezbytný i dostatečný k indukci aktivace, proliferace a produkce ECM ledvinových fibroblastů. Dále jsme určili funkční roli TXNDC5 v ledvinových fibroblastech. Primární lidské ledvinové fibroblasty (HKF) stimulované TGF- 1 (10 ng/ml) vykazovaly silnou upregulaci v hladinách exprese proteinu (obrázek 3A) a transkriptu (obrázek 3B) TXNDC5, stejně jako markeru aktivace fibroblastů periostinu a ECM proteiny (COL1Al, fibronektin a CCN2). Knockdown TXNDC5 pomocí shRNA významně zeslabil TGF{10}}indukovanou protein/mRNA upregulaci periostinu a více ECM proteinů v HKF (obrázek 3, A a B). Kromě toho léčba TGF1 zvýšila proliferační aktivitu HKF, která byla zcela zrušena knockdownem TXNDC5 (obrázek 3D). Tyto výsledky naznačují, že TXNDC5 je nezbytný pro TGF- 1-indukovanou aktivaci HKF, proliferaci a produkci ECM. Nadměrná exprese TXNDC5 na druhé straně vedla k výrazné upregulaci periostinu, COL1A1 a fibronektinu (obrázek 3C) a také ke zvýšené proliferativní aktivitě (obrázek 3E) v HKF. Souhrnně tyto výsledky ukazují, že TXNDC5, downstream od TGF- 1, je nezbytný a dostatečný k podpoře aktivace, proliferace a produkce ECM ledvinových fibroblastů.

Obrázek 3. Knockdown aktivace HKF a produkce ECM zeslabené TGF- 1 indukovanou TXNDC5; nadměrná exprese TXNDC5 byla dostatečná ke spuštění aktivace HKF a produkce ECM.

(A) Hladiny exprese proteinu a (B) transkriptu aktivačního markeru fibroblastů (periostinu) a ECM proteinů (COL1A1, fibronektin a CCN2) byly zvýšeny v kontrolních (Scramble) HKF po TGF- 1 (10 ng/ml) léčba. Knockdown TXNDC5 zeslabil upregulaci těchto fibrogenních markerů indukovanou TGF- 1 v HKF (n=5–10).

(C) Nadměrná exprese TXNDC5 byla dostatečná k indukci upregulace aktivačního markeru fibroblastů (Periostin) a ECM proteinů (COL1A1, fibronektin) v HKF (n=3–10).

(D) Léčba TGF- 1 (10 ng/ml) zvýšila aktivitu buněčné proliferace HKF, která byla zrušena knockdownem TXNDC5.

(E) Nadměrná exprese TXNDC5 zvýšila aktivitu buněčné proliferace HKF. V D a E, n=10. Data jsou reprezentativní pro 3 nebo více nezávislých experimentálních replikací.

Pro všechny panely jsou data prezentována jako průměr ± SEM. Statistická významnost rozdílů pro 2 skupiny byla stanovena 2-stranným t-testem a mezi 3 nebo více skupinami byla stanovena pomocí 1-way ANOVA, následovaného Sidakovým post hoc testy. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

Globální delece Txndc5 chráněná proti ledvinám b. Pro stanovení požadavku TXNDC5 při vývojifibróza ledvinin vivo byly WT a Tndc5-/myši podrobeny léčbě UUO, uIRI a FA. Picrosirius red a Massonovo trichromové barvení na řezech ledvin ukázaly rozsáhléledvinovéfibrózau WT myší po UUO (obrázek 4A), uIRI (obrázek 5A) a podání FA (doplňkový obrázek 3A). Globální odstranění Txndc5 významně snížilo rozsahledvinovéfibrózave všech 3 modelech poškození ledvin (obrázek 4A, obrázek 5A a doplňkový obrázek 3A).

Obrázek 4. Delece Txndc5 atenuované renální fibrózy indukované UUO.

(A) Barvení červení Picrosirius (horní 2 panely) a Massonovo trichromové barvení (spodní 2 panely) řezů ledvin z myší WT a Txndc5-7 10 dní po UUO. Sloupcové grafy kvantitativních výsledků červeně Picrosirius a oblastí barvení Massonovým trichromem jsou uvedeny vpravo (n=5-10). Sloupec∶ 100 μm.

(B)Snímky SHG řezů ledvin od WT a Txndc5-/myši 10 dní po UUO. Kvantitativní výsledky SHG-pozitivních oblastí ukázaly zvýšenou akumulaci fibrilárního kolagenu (zelená) v WT, ale ne v ledvinách myší Txndc5 po poranění.

Pro každý z řezů ledvin zobrazovaných pro SHG bylo získáno zobrazení TPEF, aby se zobrazil profil snímané tkáně (červená barva na spodních panelech) (n=3). Měřítko: 50 um. (C) Imunobloty ukázaly hladiny proteinové exprese markeru aktivace fibroblastů (Periostin) a ECM (COL1A1) v extraktu celých ledvin z WT a Txndc5-/myši 10 dní po UUO (n= 3-6). Data jsou reprezentativní pro 3 nebo více nezávislých experimentálních replikací.

Pro všechny panely jsou data prezentována jako průměr ± SEM. Statistická významnost rozdílů mezi 3 nebo více skupinami byla stanovena pomocí 1-way ANOVA, po které následovaly Sidakovo post hoc testy.**P<><>

Aby bylo možné specificky kvantifikovat patogenní fibrilární kolagen (typ I a II) a vyhnout se nadhodnocování fibrotických oblastí tradičními metodami barvení, mikroskopie druhé harmonické generace (SHG), nový optický systém zobrazování tkání, který umožňuje vizualizaci fibrilárních, ale nikoli nefibrilárních, kolagenu ve fibrotických orgánech(23,24), byl použit k posouzení rozsahufibrózau WT a Tndc5 plus myších ledvin po poranění. V souladu s výše uvedenými výsledky mikroskopie SHG ukázala výrazné zvýšení ukládání fibrilárního kolagenu v ledvinách WT po léčbě UUO (obrázek 4B), uIRI (obrázek 5B) a FA (doplňkový obrázek 3B), jehož rozsah byl významně snížen u Txndc{{ 4}}/ myši (obrázek 4B, obrázek 5B a doplňkový obrázek 3B).

V souladu s oslabenou fibrotickou odpovědí po poranění v ledvinách myší Txndc5 pozorovanou zobrazovacími studiemi, delece Tendc5 také zmírnila upregulaci proteinových genů ECM, včetně Collar, Eln, Fnl a Ccn2 v myších ledvinách po poranění (doplňkový obrázek 3, CE). Imunobloty lyzátů celé ledvinové tkáně také ukázaly sníženou hladinu proteinu ECM (COLIA1) a fibroblastového aktivačního markeru (periostinu) u Txndc5-/myši ve srovnání s WT myšmi po UUO a uIRI (obrázek 4C a obrázek 5C).

Obrázek 5. Delece Txndc5 zlepšené renální fibrózy indukované ulRI.

(A) Barvení červení Picrosirius (horní 2 panely) a Massonovo trichromové barvení (spodní 2 panely) řezů ledvin z myší WT a Txndc5-7 28 dní po ulRI. Sloupcové grafy kvantitativních výsledků červeně Picrosirius a Massonova trichromu oblasti barvení jsou zobrazeny vpravo (n=6). Měřítko∶ 100 μm.

(B) SHG snímky řezů ledvin od myší WT a Txndc5-28 dní po ulRI. Kvantitativní výsledky SHG-pozitivních oblastí ukázaly zvýšenou akumulaci fibrilárního kolagenu (zelená) v WT, ale ne v ledvinách myší Txndc5 po poranění. Pro každý z řezů ledvin zobrazovaných pro SHG bylo získáno zobrazení TPEF, aby se zobrazil profil skenované tkáně (červená barva na spodních panelech) (n=3). Měřítko∶50 μm.

(C) Imunobloty ukázaly hladiny proteinové exprese markeru aktivace fibroblastů (Periostin) a ECM (COL1A1) v extraktu celých ledvin z WT a Txndc5/myši 28 dní po ulRI (n=5-9). Data jsou reprezentativní pro 3 nebo více nezávislých experimentálních replikací.

Pro všechny panely jsou data prezentována jako průměr ± SEM. Statistická významnost rozdílů mezi 3 nebo více skupinami byla stanovena pomocí1-způsobu ANOVA, po kterém následovaly Sidakovy post hoc testy.*P<><><>

Aby se vyloučila možnost, že TXNDC5 exprimovaný v jiných typech renálních buněk, jako jsou TEC, podocyty a endoteliální buňky, může stále přispívat k rozvojiledvinovéfibrózajsme vygenerovali Txndc5 podmíněně knockoutované myši specifické pro TEC (Cdh16-cre*Txcndc5i nebo Txndc5Epeko), podocyty (NPHS2-cre*Txndc5/n nebo Tendc5Podxko) a endoteliální buňky (Tie{{ 7}}cre/ERT2*Tendc5/ nebo Txndc5Endo.eko). V experimentech s myší Txndc5Pieko a Txndc5 Poio-cko byly jako kontroly použity myši Txndc5W; v experimentech na myších Txndc5EMio-eko byla delece Txndc5 indukována pomocí tamoxifenu, jak je popsáno na obrázku 9A, kde byly myši Tie2-Cre/ERT2 léčené tamoxifenem použity jako kontroly. Cílená delece Txndc5 v TEC, podocytech nebo endoteliálních buňkách však neovlivnila rozsahfibróza ledvinindukované UUO nebo FA (doplňkový obrázek 6, BE). Tyto výsledky naznačují, že TXNDC5 exprimovaný v TEC, podocytech a endoteliálních buňkách přispívá jen málo, pokud vůbec, k patogeneziledvinafibróza.

Delece Txndc5 v ledvinových fibroblastech chrání před apoptózou TEC v reakci na poškození ledvin. V procesuledvinovéfibrózazraněné TEC ztrácejí mitochondriální funkci a apikobazální polaritu, následuje apoptóza a buněčná smrt(30). Abychom zjistili, zda delece Txndc5 ovlivňuje apoptózu TEC v reakci na poranění, provedli jsme TUNEL barvení na WT a Txndc5-myší ledvině sekce 10 dní po UUO. Počet apoptotických TEC se významně zvýšil ve fibrotických ledvinách WT myší indukovaných UUO, zatímco delece Txndc5 zmírnila rozsah TECapoptózy. Bylo publikováno, že aktivované ledvinové fibroblasty mohou indukovat TEC apoptózu prostřednictvím parakrinních účinků (31). Protože Tendc5 je v TEC sotva exprimován, je pravděpodobné, že snížená apoptóza TEC pozorovaná u Txndc5-7 myší po UUO nebyla buněčně autonomním efektem, ale spíše sekundární k redukované intersticiálnífibrózaa tudíž méně proapoptotických signálů z okolních ledvinových fibroblastů. V souladu s touto hypotézou delece Txndc5 (Tendc5kO) specifická pro fibroblasty zeslabila apoptózu TEC v rozsahu podobném tomu, který byl pozorován u Txndc5-/myši 10 dní po UUO (doplňkové). Na rozdíl od pozorovaného snížení TECapoptózy, počet F4/80-pozitivních makrofágů a CD{8}}pozitivních endoteliálních buněk byl srovnatelný v ledvinách myší WT a Txndc5-, s nebo bez UUO, což naznačuje, že delece Txndc5 neovlivňuje infiltraci makrofágů nebo peritubulární kapilární hustota v myších ledvinách. Celkově vzato tato data naznačují, že renoprotektivní účinky delece Txndc5 jsou výsledkem snížené tubulární intersticiálnífibrózaa TEC apoptóza, bez ovlivnění hustoty renálních kapilár nebo makrofágů.

Indukovaná delece Tendc5 v renálních fibroblastech snížila progresi zavedenéhofibróza ledvin. Stanovit, zda cílení Txndc5 v ledvinách může být prospěšnéledvinovéfibróza, delece Txndc5 v renálních fibroblastech byla indukována u myší Txndc5eko 10 dní po UUO, což je časový bod, kdy došlo k rozsáhléledvinovéfibrózalze pozorovat. V těchto experimentech byly jako kontroly použity myši Colla2-Cre léčené tamoxifenem. Jak je ukázáno, myši Colla{2}}Cre a Tcndc5eko měly podobný rozsahledvinovéfibróza10 dní po UUO před léčbou tamoxifenem. Jedenáct dní po injekci tamoxifenu však rozsah renální fibrózy u kontrolních myší nadále progredoval (fibrotická plocha se zvýšila z 5,1 procenta na 10,6 procenta), zatímco progreseledvinafibrózabyl téměř zastaven (fibrotická oblast se změnila z 5,3 procenta na 6,9 procenta) u myší Txndc5eko. Imunoblotting také ukázal výrazně oslabenou upregulaci CCN2, periostinu a TGFBR1 u myší Txndc5eko ve srovnání s kontrolními myšmi mezi D10 a D21 po UUO. Tyto výsledky ukazují, že intervenční delece Txndc5 v renálních fibroblastech významně snižuje progresifibróza ledvin, což naznačuje, že in vivo cílení TXNDC5 by mohlo být novým a účinným terapeutickým přístupem ke zlepšeníledvinafibrózaa ke zpomalení progrese CKD.

PRO ČÁST KLIKNĚTE ZDE Ⅱ