SNP Rs708727 spojený s Alzheimerovou chorobou v SLC41A1 může zvýšit riziko Parkinsonovy choroby: Zpráva z rozšířené slovenské studie, část 2

2.2. Genetické analýzy

Genetické analýzy byly provedeny na A1 SNP rs11240569, rs708727 a rs823156 v kohortě 508 pacientů s PD (vs. 150 pacientů v pilotní studii) a kohortě 472 kontrol (vs. 120 kontrol v pilotní studii) [37]. Počet pacientů s PD a kontrolních probandů se tedy v této studii zvýšil 3{10}}krát a 3,9krát v porovnání s pilotní studií.

Mnoho lidí pociťuje ztrátu paměti, jak stárnou, ale u lidí s Parkinsonovou chorobou mohou být změny paměti výraznější. Neměli bychom si však myslet, že lidé s Parkinsonovou nemocí musí trpět poklesem paměti, protože existují věci, které jim můžeme pomoci udržet si paměť.

Za prvé, důsledné provádění některých činností pro trénink mozku může lidem s Parkinsonovou chorobou pomoci zlepšit jejich paměť. Tyto aktivity mohou zahrnovat: hraní sudoku, hraní deskových her, řešení hádanek a další. Prostřednictvím těchto aktivit si mohou procvičit paměť, zlepšit funkci mozku a pomoci jim udržet si duševní stav.

Za druhé, strava má také velmi důležitý dopad na paměť pacientů s Parkinsonovou chorobou. Ve stravě můžeme přidat některé potraviny bohaté na bílkoviny a živiny, jako jsou ryby, fazole, ořechy atd. Tyto potraviny nám mohou pomoci zůstat zdravými a zlepšit paměť.

A konečně, pravidelné cvičení může také pomoci lidem s Parkinsonovou chorobou zlepšit paměť. Cvičení nám pomáhá nejen zůstat fyzicky zdraví, ale co je důležitější, zlepšuje funkci našeho mozku. Pravidelným cvičením mohou zvýšit svou kardiopulmonální funkci, zvýšit elasticitu svalů a kostí a zlepšit paměť.

Celkově vzato, to, zda lidé s Parkinsonovou chorobou zaznamenají pokles paměti, závisí na jejich životním stylu a stravovacích návycích a také na tom, zda věnují pozornost věcem, jako je trénink mozku a cvičení. Dokud budeme věnovat pozornost těmto aspektům, věřím, že paměť pacientů s Parkinsonovou nemocí lze účinně zlepšit. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť. Cistanche deserticola může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola je tradiční čínský léčivý materiál s mnoha unikátními účinky, z nichž jedním je zlepšení paměti. Účinnost mletého masa vychází z různých účinných látek, které obsahuje, včetně karboxylové kyseliny, polysacharidů, flavonoidů atd. Tyto složky mohou různými kanály podporovat zdraví mozku.

Klikněte na možnost poznat způsoby, jak zlepšit funkci mozku

In the sub-cohort of 96 PD patients and 100 controls, we also examined A1 SNPs rs9438393, rs56152218, and rs61822602 (first identified in the PD sub-cohort by the Sanger sequencing and afterward by RFLP analysis of the sub-cohort of controls). They were not analyzed in the pilot study (37]. The allele and genotype count and frequencies (fq) for each particular A1 SNP in the PD and the control cohorts are summarized in Table 3. The minor allele fa was, for rs11240569 (C>A) v naší celkové kohortě (případy PD + kontrolní probandi), zhruba srovnatelné s rozsahem fq celkové populace minoritních alel (MATPFR) hlášeným databázemi gnomAD a ExAC, takto: fqo (pozorováno) vs. pro (uvedeno) {{1 }} % vs. 29-30 %.

Vedlejší alela fq pro rs708727 (G > A) v naší celkové kohortě byla vyšší než MATPFR v databázích gnomAD a ExAC (fq, vs. pro=40% vs. 29-30%), ale byla srovnatelná s minoritní alela rs708727 fq hlášená pro evropskou populaci v databázi ALFA (41 %). rs823156 (A > G) minoritní alela fq v naší celkové kohortě byla 17 % a byla tedy nižší než MATPFR v databázích gnomAD a ExAC (23–30 %), ale byla srovnatelná s rs823156 minoritní alelou fq hlášenou pro evropskou populaci v roce databáze ALFA (18 %).

Frekvence minoritní alely rs9438393 (A > G) v celkové kohortě byla 40 %, a byla tedy výrazně vyšší než MATPFR 26–29 % uváděná v databázích gnomAD a TOPMED, ale byla srovnatelná s rs9438393 minor. frekvence alel uváděná v databázi ALFA pro evropskou populaci (41 %). Vedlejší alela rs56152218 (T > C) v celé kohortě byla přítomna s fq 38 %, což je v rámci MATPFR 32–46 % uváděných databázemi ALSPAC, TOPMED a ALFA (evropská populace).

Zajímavé je, že ve vietnamské, korejské a katarské populaci je minoritní alela T a nikoli C, jak bylo pozorováno u evropské populace [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term{0} }rs56152218, přístup 2. srpna 2021)]. Bylo zjištěno, že fq minoritní alely v rs61822602 (G > T) je 12 %. To je srovnatelné s frekvencemi alely T uváděnými databázemi ALSPAC a TWINSUK (12 % a 13 %), ale je mnohem vyšší než fq alely T uváděné v evropské populaci v databázi ALFA (6 %).

Všechny testované A1 SNP v našich PD a kontrolních kohortách byly v Hardy-Weinbergově rovnováze (HWE; tabulka 4).

Dále jsme vypočítali poměry šancí (OR) minoritní alely a genotypů obsahujících minoritní alelu pro každý testovaný SNP. Tyto výsledky jsou shrnuty v tabulce 5. Genotyp GA v rs708727 byl spojen s PD (OR=1.42 (1.08–1.87), p=0.01) v naší populaci. Dále jsme testovali asociaci konkrétních genotypových kombinací pro každý testovaný SNP s PD v recesivních, dominantních a zcela převládajícím genetickém modelu (tabulka 6). V souladu s předchozími údaji jsme identifikovali asociaci minoritní alely rs708727 (A) s PD v dominantních (GG vs. GA + AA) a zcela předominantních (GG + AA vs. GA) genetických modelech (ORD {{16} },36 (1,05–1,77), p=0,02 a ORCOD=1,34 (1,04–1,72), p=0,02, v tomto pořadí). Zbývající SNP nevykazovaly žádnou asociaci s PD v testovaných genetických modelech (tabulka 6).

Testovali jsme také rovnost populačních proporcí jakékoli genotypové kombinace složené z dupletů, tripletů, čtveřic, kvintupletů nebo šestinedělí testovaných SNP v kohortě PD (N {{0}}) a v kohortě kontrol ( N=100), abychom prozkoumali velikost účinku interakcí mezi testovanými A1 SNP na náchylnost k rozvoji PD v naší populaci. Celkem celkem 12 genotypových kombinací (dva duplety, sedm tripletů a tři čtveřice, tabulka 7) s významně (p < 0.05, 10 genotypů; p < 0,06, dva genotypy ) byly identifikovány různé počty v PD a kontrolní kohortě (tabulka 7). Podle Cohenových kritérií [39], která popisují rozdíly v proporcích, pouze triplet GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) z 12 genotypů vykázal "střední" velikostní rozdíl definovaný Cohenovým h(2arcsin√ prp1 –2arcsin√ prp2) Větší nebo rovno 0,5.

Hodnota h pro zbývajících 11 genotypů se pohybovala mezi 0,32 a 0,46 a byla tedy v intervalu h od 0,2 do 0,5, což definuje malé rozdíly v proporcích (tab. 7) [39]. Proto by triplet GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) mohl být klinicky významný a budoucí vyšetření tohoto genotypu ohledně citlivosti na PD by měla být provedena. Pro rs11240569, rs708727 a rs823156 jsme provedli stejný typ analýzy se zdrojovými daty z kohorty 508 pacientů s PD a kohorty 472 kontrol. Čtyři genotypy, dva duplety (GG(rs11240569) + AG(rs708727), GG(rs708727) + AG(rs823156)) a dva triplety (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + 1145 AA(rs823),615Grs823 + GG(rs708727) + AG(rs823156)), se signifikantně (p < 0,05) rozdílnými počty v PD a kontrolní kohortě. Cohenovo h vypočtené pro každý ze čtyř genotypů bylo pod prahem 0,2 [39], a tedy rozdíl mezi populačními proporcemi mezi testovanými skupinami byl ve všech čtyřech případech zanedbatelný.

Stárnutí následované mužským pohlavím je považováno za nejvýznamnější rizikový faktor pro vznik idiopatické PD [37]. V naší pilotní studii věk nástupu idiopatické PD v kohortě 150 pacientů s PD nekoreloval s přítomností žádné genotypové kombinace pro SNP rs11240569, rs708727 a rs823156 [37]. Zde jsme korelovali věk nástupu PD s (1) přítomností každé genotypové kombinace pro SNP rs11240569, rs708727 a rs823156 ve skupině 508 pacientů s PD (obrázek 2) a (2) s přítomností každého genotypová kombinace pro SNP rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218 a rs61822602, v podskupině pacientů s PD, náhodně vybraných z kohorty promotoru PD pro A1 sekvenování (obr.3). Přibližně ve věku nástupu jednosměrná analýza ANOVA odhalila, že neexistuje žádný významný (p < 0,05) rozdíl mezi genotypovými subpopulacemi pro každý z testovaných SNP jak ve velké kohortě PD, tak v subkohortě PD. pacientů. Žádný konkrétní genotyp v testovaných SNP tedy neovlivňuje věk nástupu idiopatické formy PD. To je v plném souladu se závěrem naší pilotní studie [37].

Provedli jsme také stejný typ analýzy pro každý z testovaných SNP v subpopulacích žen a mužů, které byly odvozeny z velké kohorty (N=508) a subkohorty (N=96 ) pacientů s PD. Jak je ukázáno v doplňkových obrázcích S1–S3, žádná významná (p < 0.05) souvislost mezi věkem nástupu a přítomností jakékoli konkrétní kombinace genotypů v testovaných SNP rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs86152 a rs61822602 v podskupinách rozdělených podle pohlaví byl odvozen buď z velké kohorty PD (NM=306, NF=202) nebo podkohorty PD vybrané pro sekvenování promotoru A1 (NM {{20} }, NF=42).

2.3. RandomForest Machine Learning (RF-ML)

Všechny A1 SNP byly testovány na jejich schopnost rozlišovat mezi pacienty s PD a kontrolami s RF-ML. Algoritmus RF-ML byl natrénován pomocí našich dat a byla vyhodnocena diskriminační důležitost jednotlivých SNP pomocí technického konstruktu, známého jako hloubka grafu [37,40]. Stejně jako v naší pilotní studii [37] byla prediktivní schopnost testovaných SNP vizualizována a kvantifikována pomocí křivek ROC (receiver Operating Charakteristika) a AUC (area under ROC curve). Rozlišovací schopnost prediktorů je dána v intervalu AUC od 100 % (maximální rozlišovací schopnost) do 50 % (minimální rozlišovací schopnost); AUC < 50 % odpovídá žádné rozlišovací schopnosti.

RF algoritmus byl trénován v následujících režimech: (1) se třemi nebo šesti (tabulka 8) konkrétními A1 SNP (každý SNP, tři genotypy (AMAM/AMAm/AmAm, kde AM znamená hlavní alelu a Am vedlejší alelu), jako prediktor (tři nebo šest RF modelů, jeden pro každý SNP), (2) s genotypovými duplety spárovaných SNP jako prediktory (tři RF modely (tři SNP) nebo 15 RF modely (šest SNP), jeden pro každý pár SNP; Tabulka 8), (3) s genotypovými triplety tří SNP jako prediktory (jeden RF model (tři SNP) nebo 20 RF modelů (šest SNP), jeden pro každý triplet SNP; Tabulka 8), (4) s genotypové čtveřice šesti SNP jako prediktory (15 RF modelů, jeden pro každý čtveřici; Tabulka 8), (5) s genotypovými kvintuplety šesti SNP jako prediktory (šest RF modelů, jeden pro každý kvintuplet; Tabulka 8) a ( 6) s genotypovým šestinedělím (jeden RF model, tabulka 8).

Když tedy byly jako prediktory použity singletony, duplety, triplety, čtyřčata, kvintuplety a šestinedělí A1 SNP, neměly žádnou schopnost rozlišovat mezi pacienty s PD a kontrolami (tabulka 8). Proto podle analýzy RF-ML a v souladu s pilotní studií [37] nemají A1 SNP potenciál sloužit jako diskriminátory mezi kontrolami a pacienty s PD a pokud jde o PD, nemají ve slovenské populaci žádnou prediktivní ani diagnostickou hodnotu. .

3. Diskuse

Lokus PARK16 si získal pozornost vědecké komunity díky svému spojení s PD a jeho diskutované roli při definování náchylnosti k tomuto komplexnímu onemocnění. V roce 2019 jsme ohlásili pilotní studii, ve které jsme analyzovali spojení tří A1 SNP, konkrétně rs11240569, rs708727 a rs823156, s idiopatickou formou PD ve slovenské populaci (západních Slovanů). Hlášená asociace rs11240569 a rs823156 s náchylností k PD hlavně u asijských/orientálních populací nebyla v naší studii nalezena [37]. Žádná asociace nemohla být potvrzena pomocí frekventistických statistik (konzervativní genetické analýzy) nebo RF-ML analýzy [37].

Hlavním omezením naší pilotní studie však byl relativně nízký počet pacientů/probandů v PD a kontrolní kohortě (150, resp. 120). Zdůraznili jsme, že ze statistického hlediska je nutné data interpretovat obezřetně kvůli malé velikosti vzorku v obou kohortách a kvůli nízké statistické síle provedených analýz [37]. Nicméně použitím přístupu ML, který vyžaduje podstatně menší velikosti vzorků než konvenční frekventistická statistika nebo přibližné Bayesovské výpočty, jsme byli schopni s jistotou prozkoumat schopnost konkrétních A1 SNP rozlišovat mezi pacienty s PD a kontrolami. Ve všech případech odhalil přístup ML v podstatě nulovou diagnostickou a prediktivní relevanci SNP rs11240569, rs708727 a rs823156 ve slovenské populaci [37].

V této studii jsme zkoumali nejen tři výše uvedené SNP, ale také tři SNP (rs9438393, rs56152218 a rs61822602) lokalizované v promotorové oblasti A1. Tyto SNP byly identifikovány sekvenováním 96 PD vzorků následovaným RFLP analýzou kontrolních vzorků a RFLP ověřením sekvenovaných PD vzorků. Naše genetické analýzy neodhalily v podstatě žádnou asociaci žádného ze tří nově studovaných SNP s PD. Totéž platí pro rs11240569 a rs823156, které byly analyzovány v PD a kontrolních podskupinách (96/100) a také v kohortách 508 pacientů s PD a 472 kontrol. Tyto výsledky jsou v naprosté shodě s výsledkem pilotní studie [37]. Ve velkých kohortách je však rs708727 spojen se zvýšeným rizikem PD ve slovenské populaci.

Pokud je nám známo, žádná studie dosud přímo nespojovala A1 SNP rs708727 se změněným rizikem rozvoje PD [19,37]. V naší rozšířené studii (ve srovnání s pilotní studií [37]) je vedlejší alela A v rs708727 spojena se zvýšeným rizikem nástupu PD při testování v dominantním [40] (ORD=1,36 (1,05– 1,77), p=0,02) nebo zcela převládající [41] (ORCOD=1,34 (1,04–1,72), p=0,02) modely (tabulka 5). Přítomnost minoritní alely (A) v rs708727 tedy může být spojena se zvýšeným rizikem rozvoje PD. Zatímco Sanchez-Mut a kol. [27] a Wang a kol. [42] jasně prokázali, že přítomnost minoritní alely A v rs708727 mění methylaci promotoru PM20D1 (a tím i jeho expresi) v závislosti na dávce (kvantitativně), což jsou v naší studii nejvhodnější genetické modely. ukazují, že přítomnost jedné alely rs708727 A je dostatečná ke změně náchylnosti k nástupu PD. Citlivost na PD (fenotyp), o tom, zda jsou v rs708727 (genotyp) přítomny jedna nebo dvě kopie minoritní alely, musí být dále podrobně objasněna.
Sanchez-Mut a kol. identifikovali PM20D1 (lokalizovaný v lokusu PARK16 a kódující enzym peptidázu M20- obsahující protein jeden enzym s hydrolázovou i peptidázovou aktivitou; syntáza/hydroláza N-mastných acylaminokyselin) jako kvantitativní znak methylace a exprese lokus (mQTL) spojený s haplotypem spojeným s AD, který vykazuje charakteristiky podobné zesilovači a kontaktuje promotor PM20D1 prostřednictvím chromatinové smyčky zprostředkované transkripčním faktorem zprostředkované na haplotypu CTCF (CCCTC-binding-) [27]. Porovnáním vzorků od zdravých kontrol a pacientů s pokročilým stadiem AD zjistili, že PM20D1 trvale vykazuje hypermetylaci promotoru u pacientů s AD [27]. A1 SNP rs708727 koreluje s hladinami methylace DNA PM20D1 v lidském frontálním kortexu a hippocampu [27], stejně jako SNP rs960603 [27]. Wang a kolegové ve své práci na periferní krvi získali data potvrzující, že PM20D1 je mQTL zprostředkovaný primárně A1 SNP rs708727 spojeným s AD-rizikem [42].

Jejich longitudinální data navíc ukazují, že k hypomethylaci dochází před symptomatickým nástupem AD, pravděpodobně k usnadnění rostoucí exprese PM20D1 k aktivaci jeho ochranné funkce [42]. Progrese AD je charakteristická zvyšující se úrovní metylace v CpG ostrůvcích v DMR (diferenciálně methylované oblasti) promotoru PM20D1 u pacientů s AD, což nakonec vede k inhibici genové transkripce a exprese [27,42,43]. PM20D1 je také spojován s diabetem [44], obezitou [45] a roztroušenou sklerózou [46], a jelikož je lokalizován v lokusu PARK16, předpokládá se jeho možné zapojení/souvislost s PD [47].

Navzdory nedostatku molekulárně mechanistických analýz ve světle našich současných údajů spekulujeme, že AD a PD (a další méně častá neurodegenerativní onemocnění) sdílejí nejen „dobře známé“ patofyziologické mechanismy (např. narušená mitofagie, retromer a proteazom). funkce), ale také epigenetické mechanismy, jako je A1 rs708727-závislá regulace exprese PM20D1 [27,42]. Naše práce nepřímo přispívá k potřebě podrobného objasnění úlohy endogenních N-acylaminokyselin (NAA), které jsou metabolizovány PM20D1 v patobiologii PD a dalších neurodegenerativních poruch. Nyní je známo, že NAA a N-acylové konjugáty neurotransmiterů (NAAN) hrají důležitou roli v neuromodulaci [48,49]. Důkaz spojující expresi PM20D1 s N-acyl dopaminem (NADA) poskytla nedávná práce Songa et al. Tito autoři prokázali, že delece kir6.2 (podjednotka tvořící póry ATP-senzitivních K+ kanálů) vede ke snížení počtu mitochondrií a snížení produkce ATP prostřednictvím zvýšení hladin PM20D1 a látek rozpojujících mitochondriální dýchání. , včetně NADA, v myším středním mozku [49].

NADA je silný inhibitor 5-lipoxygenázy (5-LOX) a má distribuci omezenou na mozek, přičemž hladiny jsou nejvyšší ve striatu a velmi nízké jinde [48,50,51]. 5-LOX katalyzuje syntézu leukotrienu nebo 5-HpETE (5-hydroperoxyeikosatetraenová kyselina) z kyseliny arachidonové a je spojován s neurodegenerací (AD a PD) prostřednictvím svého zapojení do neurozánětu [51, 52]. Domníváme se proto, že snížená exprese PM20D1, následně nižší abundance NADA a zvýšená aktivita 5-LOX významně přispívají k patologii PD (a dalších neurodegenerativních onemocnění).

Sanchez-Mut a spolupracovníci prokázali, že nadměrná exprese PM20D1 v myším AD hippocampu vede ke zlepšení učení, zatímco jeho knock-down zvyšuje zátěž amyloidním plakem [27]. Patologie Lewyho i Alzheimerova typu jsou důležité u demence související s PD [53]. Významná skupina pacientů s PD trpí během onemocnění zhoršující se demencí [54]. Vezmeme-li v úvahu tato pozorování, spekulujeme, zda aktivita spojená s rs{10}}, která umlčuje PM20D1, přispívá k nástupu PD-demence a zda sledování aktivity PM20D1 může sloužit jako prognostický parametr pro nástup PD-demence.

Dříve publikované práce naznačovaly zapojení Mg2+ transportérů do patobiologie PD [18–22,55]. A1, který je klíčovým hráčem v homeostáze Mg somatických buněk, je přímo spojen s PD [20–22]. Bodové mutace v A1 vedoucí k substitucím p.A350V, p.R244H a p.R285Q byly domněle spojeny s PD a předpokládá se, že jak nedostatek funkce, tak ztráta funkčních mutací v A1 mají škodlivé důsledky v neuronech, a proto přispívající k fenotypu PD [20–22]. Tato práce nepřímo poukazuje na možnost, že nejen poruchy funkce jádra A1 (výměna Na+/Mg2+), ale také epigenetická regulace exprese (a aktivity) PM20D1 spojená s A1-(rs708727) patobiologie PD.

V této studii jsme identifikovali genotypový triplet GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) jako potenciálně klinicky významný (h větší nebo rovný 0,5). Zajímavé je, že rs708727 s genotypem GG je součástí tripletu. Nicméně ve světle předchozího výzkumu by se dalo očekávat, že genotyp obsahující minoritní alelu A v rs708727 bude spojen s potenciálním rizikem PD spojeným s tímto tripletem. V současné době nejsme schopni komentovat žádné molekulární/genetické/epigenetické interakce zahrnující SNP v tripletu GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602), a tedy ani žádný předpokládaný příspěvek tohoto tripletu k součtu rizika vzniku PD.

V naší pilotní studii jsme použili RF-ML k vyhodnocení a interpretaci našich dat [37]. Hlavní výhoda analýzy dat RF-ML je dvojí: (1) umožňuje kvantifikovat rozlišovací schopnost SNP mezi pacienty s PD a kontrolami [37] a (2) vyžaduje menší velikosti vzorků pro hodnocení diskriminační význam jednotlivých SNP nebo jejich kombinací [37]. Kromě toho RF-ML obchází problém p-hodnoty často spojený s většími vzorky, i když jsou dostupné [56]. Stejně jako v naší předchozí zprávě se v naší kohortě neprokázalo, že by žádný z testovaných A1 SNP měl schopnost rozlišovat mezi pacienty s PD a probandy bez PD (tabulka 8). Můžeme tedy předpokládat, že žádný z testovaných A1 SNP není vhodný k tomu, aby sloužil jako PD/non-PD diskriminátor ve slovenské populaci.

Pokud jde o asociaci A1 rs708727 se změněným rizikem PD, výsledek naší analýzy RF-ML se zdá být na první pohled rozporuplný (tab. 5 a 6 vs. tabulka 8). Jakobsdottir a kol. v jejich logistické regresi a analýze ROC křivky ukázaly, že ani silné genetické asociace automaticky nezaručují efektivní rozlišení mezi případy a kontrolami [57]. Navzdory tomu, že se jedná o špatné klasifikátory, mohou být SNP s významným OR velmi cenné pro stanovení etiologických hypotéz [57]. V našem případě A1 SNP rs708727 nemá žádnou klasifikační schopnost týkající se PD, takže nemá žádný klinický význam. Jeho slabá, ale významná asociace se změněným rizikem pro PD nám však umožnila spekulovat o zapojení rs708727 do patobiologie PD podobným nebo stejným způsobem, jako se podílí na AD [27].

4. Materiály a metody

4.1. Účastníci studie (základní charakteristiky)

Celkem bylo do studie zařazeno 980 probandů (508 pacientů s PD a 472 kontrol, splňujících inkluzivní kritéria). Idiopatickou formu PD diagnostikovali neurologové v pěti diagnostických centrech PD (Martin, Bratislava, Trenčín, Zvolen a Košice) podle diagnostických kritérií PD MDS (Movement Disorder Society). Všichni pacienti byli léčeni standardní anti-PD terapií. Průměrný věk pacientů s PD byl 68,4 ± 9,6 let. Průměrný věk nástupu onemocnění byl 61,7 ± 10,7 let. Nejmladší případ byl diagnostikován ve věku 34 let a nejstarší případ v 89 letech. PD skupina sestávala z 202 žen (F) a 306 mužů (M), takže poměr F:M byl 1:1,5.

Kontrolní soubor probandů tvořili externí a interní pacienti z Kliniky pracovního lékařství a toxikologie (FN Martin (FN) a Neurologické kliniky (FN). Do kontrolní studijní skupiny byli zařazeni pouze ti pacienti, u kterých nebylo dříve diagnostikováno žádné neurodegenerativní a neuropsychiatrické onemocnění, jako je diabetes mellitus nebo osteoporóza (všechny choroby domněle spojené se změněnou expresí A1 a deregulací funkce A1). Průměrný věk kontrolních probandů byl 68,3 ± 11,6 let. Kontrolní skupinu tvořilo 208 žen a 264 mužů, takže poměr F:M byl v kontrolní skupině 1:1,3.

Podskupina pacientů s PD, ve které byla sekvenována oblast promotoru A1, sestávala z 96 náhodně vybraných subjektů. Poměr F:M byl 1:1,3 (42 žen a 54 mužů). Průměrný věk pacientů v podskupině PD byl 67.{{10}} ± 9,5 let. Kontrolní podskupinu tvořilo 41 žen a 59 mužů, poměr F:M byl tedy 1:1,4. Průměrný věk probandů v kontrolní subkohortě byl 59,8 ± 5,0 let.

Tato studie byla schválena Etickou komisí Jesseniovy lékařské fakulty Univerzity Komenského (JLF UK). Kolaudace byla zaznamenána pod IČ: EK 66/2019. Všichni účastníci studie podepsali informovaný souhlas.

4.2. Zpracování vzorku

Vzorky krve byly odebrány do zkumavek BD Vacutainer® ošetřených EDTA (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ USA). Genomová DNA byla izolována z čerstvých (UHM) nebo zmrazených vzorků krve (jiná PD centra) pomocí Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation, Maddison, WI, USA) podle protokolu výrobce. Izolované vzorky DNA byly skladovány při -80 ◦C.

4.3. Genotypizace

Genotypizace byla provedena na 358 PD vzorcích a 352 kontrolních vzorcích. Výsledky z těchto experimentů byly analyzovány společně s výsledky dříve publikovanými Cibulkou et al. [37]. SNP rs11240569, rs708727 a rs823156 byly analyzovány pomocí genotypizačních sond TaqMan® C_34251_20/rs11240569, C_375742_10/rs823156 a C_9238453_10/rs708727, Waltham, ThermoScientific,all MA USA) stejným způsobem, jak bylo uvedeno dříve [37].

4.4. Sangerovo sekvenování

Oblast promotoru byla rozdělena do čtyř překrývajících se fragmentů/amplikonů, protože byla příliš dlouhá pro jeden běh sekvenování. Před sekvenováním byly cílové oblasti amplifikovány. Primery byly navrženy pomocí online nástroje Primer3Plus [https://primer3plus.com/cgi--bin/dev/primer3plus.cgi (přístup 3. května 2018)]. Každý pár primerů byl zkontrolován na přítomnost více amplifikačních produktů pomocí online nástroje PCR UCSC [http://www.genome.ucsc.edu/cgi--bin/hgPcr (přístup 3. května 2018)].

Primery a programy PCR použité pro amplifikaci čtyř fragmentů jsou shrnuty v doplňkových tabulkách S1 a S2. Složení hlavních směsí pro každý fragment je shrnuto v SA3. Fragmenty 3 a 4 mají vysoký obsah nukleotidů G a C (67,4 %, resp. 71,9 %). Výtěžek reakce byl zvýšen přidáním 10x GC Rich Enhancer (Solis Biodyne, Tartu, Estonsko). PCR produkt byl purifikován pomocí NucleoSpinTM Gel a PCR Clean-up kit (Macherey-Nagel GmbH&Co. KG, Düren, Německo). V dalším kroku byl purifikovaný PCR produkt zředěn na vhodnou koncentraci pro pre-sekvenační PCR (SA4, SA5). V pre-sekvenační PCR byly použity pouze dopředné (fw) primery. Reakční směs také obsahovala BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) a dideoxynukleotidy.

Ve výsledku jsme získali směs produktů různých velikostí zakončených fluorescenčně značenými dideoxynukleotidy. Produkty byly následně purifikovány pomocí soupravy SigmaSpin Sequencing Reaction Clean-Up kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) podle protokolu výrobce. Objem 3 ul purifikovaného produktu byl přenesen do 96-jamkové destičky společně s 12 ul vysoce kvalitního deionizovaného formamidu (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Směs byla denaturována po dobu 5 minut při 95 °C v termocykleru. Fragmenty byly separovány na 8-mikrokapilárním zařízení ABI 3500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Sekvence byly exportovány a vizualizovány softwarem Chromas (Technelysium Pty Ltd., South Brisbane, Austrálie). Soubory FASTA byly nahrány do BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) a zarovnány s referenčním lidským genomem (verze GRCh38.p12).

Predikce vazebných míst transkripčních faktorů a jejich změn byla provedena online nástrojem ConSite [dostupný na: http://consite.genereg.net/ (přístup 3. září 2020)] [38]. Byly nahrány sekvence s hlavní alelou a vedlejší alelou a byla vytvořena spektra transkripčních faktorů (TF). Analýza byla prováděna bez přednastavení minimální specificity. Změny v profilech vazby TF na základě přítomnosti variant jsou shrnuty v tabulce 2.

4.5. Analýza RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).

Složky reakční směsi a podmínky PCR amplifikované PCR jsou shrnuty v SA6 a SA7. K návrhu omezení amplikonů byl použit online in silico nástroj NEBCutter 2.{3}} [http://nc2.neb.com/NEBcutter2 / (přístup 14. února 2020)]. Pro RFLP analýzu byly vybrány následující restrikční enzymy: Hpy166II (detekce rs9438393), NIaIII (detekce rs56152218) a BmrI (detekce rs61822602). Všechny enzymy byly zakoupeny od New England Biolabs. Pro variantu rs144056491 jsme nebyli schopni navrhnout experiment RFLP, protože nebyl dostupný žádný vhodný enzym. Po restrikci jsme očekávali, že fragmenty shrnuté v SA8 vytvoří výtěžek. Po restrikci byly produkty separovány elektroforézou na agarózovém gelu (NIaIII a Hpy166II 1% gel; Bmrl 2% gel) a poté vizualizovány na přístroji PharosFX (Bio-Rad Laboratories). Byly stanoveny genotypy pro každou SNV.

4.6. Analýza dat

Data byla zkoumána a analyzována pomocí R [R Core Team (2021); R: jazyk a prostředí pro statistické výpočty. R Foundation for Statistical Computing, Vídeň, Rakousko. URL https://www.R-project.org/, ver. 4.{13}}.5 (2021-03-31)]. Genetická asociační studie (GAS) a analýza výkonu byly provedeny pomocí R knihoven HardyWeinberg [Jan Graffelman (2015); Zkoumání dialelických genetických markerů: balíček HardyWeinberg. Journal of Statistical Software, 64(3), 1-23. URL https://www.jstatsoft.org/v64/i03/], DescTools [Andri Signorelli et al. (2021); DescTools: Nástroje pro popisnou statistiku. R verze balíčku 0.99.41.], epitools [Tomas J. Aragon (2020); epitools: Epidemiology Tools. Verze balíčku R 0.{18}}.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=epitools], pwr [Stephane Champely (2020); pwr: Základní funkce pro analýzu výkonu. Verze balíčku R 1.{24}}. URL https://CRAN.R-project.org/package=pwr] a vlastní vyvinutý kód. Prediktivní modelování RandomForest bylo provedeno pomocí knihovny R randomForestSRC [Ishwaran H. a Kogalur UB (2021); Rychlé Unified RandomForests pro přežití, regresi a klasifikaci (RF-SRC), balíček R verze 2.11.0.]. Data byla vizualizována pomocí R knihovny včelího roje [Aron Eklund (2021); beeswarm: The Bee Swarm Plot, alternativa k Stripchart. Verze R balíčku 0.3.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=beeswarm]. Jednosměrná ANOVA byla použita k testování nulové hypotézy o rovnosti průměrného věku nástupu populace pro tři genotypové subpopulace pro každý SNP. Nálezy s p-hodnotou pod 0,05 byly považovány za statisticky významné.

5. Závěry

Stručně řečeno, naše data naznačují slabou, ale významnou asociaci A1 SNP rs708727 s PD v dominantních a nadměrně dominantních genetických modelech ve slovenské populaci. Žádný z dalších testovaných A1 SNP (rs11240569, rs823156, rs9438393, rs56152218 a rs61822602) nebyl spojen s onemocněním v žádném z testovaných genetických modelů. Analýzy RF-ML identifikovaly všechny testované A1 SNP jako špatné klasifikátory/prediktory PD, takže jejich použití v klinické praxi jako diagnostických nebo prognostických markerů zůstává zanedbatelné. Spojení rs708727 s PD nám však umožnilo spekulovat, že minoritní alela spojená s rizikem PD (G > A) v rs708727 přispívá k nástupu a progresi onemocnění prostřednictvím narušení epigenetické regulace exprese PM20D1, mechanismu, o kterém je známo, že hraje roli v patobiologii AD. Tato hypotéza by měla být dále prozkoumána, aby bylo možné učinit přesvědčivé prohlášení. Dále by měla být objasněna možná souvislost mezi demencí spojenou s PD a rs708727.

Příspěvky autora:

Konceptualizace, MK; metodika, MK, MC, MG (Marian Grendar) a MB; software, MG (Marian Grendar); validace, MC, MB a MK; formální analýza, MK, MG (Marian Grendar), MC, AS, ZL, ZP, TS, SS a MG (Milan Grofik); vyšetřování, MC a MB; zpracování dat, MC, MB, MG (Marian Grendar), MG (Milan Grofik), JN, VN a EK; psaní – příprava původního návrhu, MK; psaní—recenze a redakce, MC, MG (Marian Grendar) a ZP; vizualizace, MK, MC a MG (Marian Grendar); supervize, MK; administrace projektu, MC, MK, MG (Milan Grofik), JN, JB, VH, VN, EK, MS a BV; získání finančních prostředků, MK Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasili s ní.

Financování:

Tato práce vznikla za podpory Slovenské agentury pro výzkum a vývoj, číslo grantu APVV-19-0222, a Vědecké grantové agentury Ministerstva školství, vědy, výzkumu a športu Slovenské republiky a Slovenské akademie věd, číslo grantu VEGA 1/0554/19, oba na MK

Prohlášení institucionální revizní komise:

Studie byla schválena Etickou komisí Jesseniovy lékařské fakulty Univerzity Komenského (JLF UK). Souhlas byl zaznamenán pod IČ: EK 66/2019.

Prohlášení o informovaném souhlasu:

Informovaný souhlas byl získán od všech subjektů zapojených do studie.

Prohlášení o dostupnosti dat:

Kompletní dataset je obsažen v článku. Povaha a rozsah zahrnutých dat umožňuje další metaanalýzu. Veškeré informace týkající se studie jsou k dispozici na vyžádání u příslušného autora.

Poděkování:

Děkujeme všem účastníkům studie a jejich rodinným příslušníkům. Děkujeme také Martinu Mařákovi (JFM UK) za kompetentní technickou podporu projektu, Janu Radvanszkému a Rastislavu Hekelovi (oba GENETON sro) za užitečné rady při analýzách promotéra A1 a Therese Jonesové za jazykovou úpravu rukopis.

Střet zájmů:

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Reference

1. Tatarková, Z.; de Baaij, JHF; Grendar, M.; Aschenbach, JR; Racay, P.; Bos, C.; Sponder, G.; Hoenrop, JGJ; Röntgen, M.; Turčanová Koprušáková, M.; a kol. Dietní příjem Mg2+ a Na+/Mg2+ výměník SLC41A1 ovlivňují složky mitochondriální energetiky v myších kardiomyocytech. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 8221. [CrossRef] [PubMed]

2. Yamanaka, R.; Tabata, S.; Shindo, Y.; Hotta, K.; Suzuki, K.; Soga, T.; Oka, K. Mitochondriální homeostáza Mg2+ rozhoduje o buněčném energetickém metabolismu a o zranitelnosti vůči stresu. Sci. Rep. 2016, 6, 30027. [CrossRef] [PubMed]

3. Dudev, T.; Grauffel, C.; Lim, C. Jak původní a cizí kationty kovů vážou ATP: Důsledky pro Lithium jako terapeutické činidlo. Sci. Rep. 2017, 7, 42377. [CrossRef] [PubMed]

4. Kolíšek, M.; Zsurka, G.; Samaj, J.; Weghuber, J.; Schweyen, RJ; Schweigel, M. Mrs2p je základní složkou hlavního elektroforetického systému přítoku Mg2+ v mitochondriích. EMBO J. 2003, 22, 1235–1244. [CrossRef] [PubMed]

5. Schindl, R.; Weghuber, J.; Romanin, C.; Schweyen, RJ Mrs2p tvoří v mitochondriích vysoce vodivý Mg2+ selektivní kanál. Biophys. J. 2007, 93, 3872–3883. [CrossRef] [PubMed]

6. Kolíšek, M.; Sponder, G.; Pilchová, I.; Cibulka, M.; Tatarková, Z.; Werner, T.; Racay, P. Magnesium Extravaganza: A Critical Compendium of Current Research in Cellular Mg2+ Transporters other than TRPM6/7. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2019, 176, 65–105. [CrossRef]

7. Kubota, T.; Shindo, Y.; Tokuno, K.; Komatsu, H.; Ogawa, H.; Kudo, S.; Kitamura, Y.; Suzuki, K.; Oka, K. Mitochondrie jsou intracelulární zásoby hořčíku: Vyšetřování simultánním fluorescenčním zobrazováním v buňkách PC12. Biochim. Biophys. Acta 2005, 1744, 19–28. [CrossRef]

8. Sponder, G.; Abdulhanan, N.; Fröhlich, N.; Mastrototaro, L.; Aschenbach, JR; Röntgen, M.; Pilchová, I.; Cibulka, M.; Racay, P.; Kolíšek, M. Nadměrná exprese Na+/Mg2+ výměníku SLC41A1 zeslabuje signalizaci pro přežití. Oncotarget 2017, 9, 5084–5104. [CrossRef] [PubMed]

9. Yamaguchi, H.; Wang, HG Proteinová kináza PKB/Akt reguluje přežití buněk a apoptózu inhibicí Baxových konformačních změn. Oncogene 2001, 20, 7779-7786. [CrossRef]

10. Vauzour, D.; Vafeiadou, K.; Rice-Evans, C.; Williams, RJ; Spencer, JP Aktivace pro-přežití signálních drah Akt a ERK1/2 je základem antiapoptotických účinků flavanonů v kortikálních neuronech. J. Neurochem. 2007, 103, 1355–1367. [CrossRef]

11. Muddapu, VR; Dharshini, SAP; Chakravarthy, VS; Gromiha, MM Neurodegenerativní choroby – je metabolický deficit hlavní příčinou? Přední. Neurosci. 2020, 14, 213. [CrossRef] [PubMed]

12. Pathák, D.; Berthet, A.; Nakamura, K. Energetické selhání: Přispívá k neurodegeneraci? Ann. Neurol. 2013, 74, 506–516. [CrossRef] [PubMed]

13. Dharshini, SAP; Taguchi, YH; Gromiha, MM Vyšetřování energetické krize u Alzheimerovy choroby pomocí transkriptomové studie. Sci. Rep. 2019, 9, 18509. [CrossRef] [PubMed]

14. Větvička, G.; Shirihai, OS Souhra mezi mitochondriální dynamikou a mitofágií. Antioxid. Redoxní signál. 2011, 14, 1939–1951. [CrossRef] [PubMed]

15. Zhao, W.; Zhang, W.; Ma, H.; Yang, M. NIPA2 reguluje funkci osteoblastů modulací mitofágie u osteoporózy diabetu 2. typu. Sci. Rep. 2020, 10, 3078. [CrossRef]
16. Nadler, MJ; Hermosura, MC; Inabe, K.; Perraud, AL; Zhu, Q.; Stokes, AJ; Kurosaki, T.; Kinet, JP; Penner, R.; Scharenberg, AM; a kol. LTRPC7 je Mg. ATP-regulovaný divalentní kationtový kanál potřebný pro životaschopnost buněk. Příroda 2001, 411, 590–595. [CrossRef]

17. Kolíšek, M.; Nestler, A.; Vormann, J.; Schweigel-Röntgen, M. Lidský gen SLC41A1 kóduje Na+/Mg2+ výměník. Dopoledne. J. Physiol. Cell Physiol. 2012, 302, C318–C326. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com