Akteosid jako potenciální terapeutická možnost pro primární hepatocelulární karcinom: Preklinická studie

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Di Ma, Juan Wang, Lu Liu, Meiqi Chen a Zhiyong Wang

Abstraktní

Východiska: Hepatocelulární karcinom (HCC) je běžný maligní nádor s charakteristikou špatné prognózy, vysoké morbidity a mortality na celém světě. Zejména pro pokročilé pacienty s HCC je k dispozici pouze několik možností systémové léčby a zahrnují sorafenib a nedávno popsaný režim atezolizumab plus bevacizumab jako možnou léčbu první volby. Zde navrhujeme akteosid, fenylethanoidní glykosid široce distribuovaný v mnoha léčivých rostlinách jako potenciálního kandidáta proti pokročilé HCC.

Metody: Buněčná proliferace, tvorba kolonií a migrace byly analyzovány ve třech lidských HCC buněčných liniích BEL7404, HLF a JHH-7. Test angiogeneze byl proveden pomocí HUVES. Model nahých myší s xenograftem BEL7404 nebo JHH-7 byl vytvořen pro analýzu možných protinádorových účinků akteosidu. qRT-PCR a western blotting byly použity k odhalení potenciálních protinádorových mechanismů akteosidu.

Výsledek:Akteosid z cistancheinhibovala buněčnou proliferaci, tvorbu kolonií a migraci ve všech třech lidských HCC buněčných liniích BEL7404, HLF a JHH-7. Zákaz angiogeneze akteosidem byl odhalen inhibicí tvorby trubic a migrace buněk HUVEC. Kombinace akteosidu a sorafenibu produkovala silnější inhibici tvorby buněčných kolonií a migrace buněk HCC a také angiogenezi HUVEC. In vivo protinádorová účinnost akteosidu byla dále demonstrována na modelu nahých myší s xenoimplantátem BEL7404 nebo JHH-7, se zlepšením v kombinaci se sorafenibem při inhibici růstu xenograftu JHH-7. Další ošetření buněk JHH-7 akteosidem odhalilo zvýšení hladiny tumor supresorového proteinu p53 a také snížení hladiny genu pro peptidázu související s kallikreinem (KLK1, 2, 4, 9 a 10) bez významné změny zbytku KLK1–15 genů.

Závěry:Akteosid z cistanchevykazuje protinádorový účinek pravděpodobně prostřednictvím up-regulace hladin p53, stejně jako inhibice exprese KLK a angiogeneze. Akteosid by mohl být užitečný jako doplněk při léčbě pokročilého HCC na klinice.

Klíčová slova: Akteosid, Hepatocelulární karcinom, Sorafenib, Xenograft, p53, Kallikrein

Pozadí

Hepatocelulární karcinom (HCC) je běžný maligní nádor s charakteristikou špatné prognózy a vysokou morbiditou a mortalitou na celém světě [1, 2]. Byly identifikovány různé faktory, které přispívají k výskytu a progresi HCC, včetně infekce virem hepatitidy B nebo C, inaktivace tumor supresorových genů, jako je p53, abnormální aktivace onkogenů, jako je K-ras, a některých signálních molekul. jako je PI3K, ERK/MAPK a Wnt/-catenin, stejně jako únik imunitního systému hostitele [3, 4]. Pro léčbu HCC jsou pro pacienty s HCC v časném stadiu možností resekce, transplantace jater a radiofrekvenční ablace, avšak s vysokou mírou recidivy a metastáz [3, 5, 6]. Kromě toho je pro pokročilé pacienty s HCC k dispozici pouze několik možností systémové léčby a zahrnují sorafenib a nedávno popsaný režim atezolizumab plus bevacizumab jako možnou léčbu první volby [7]. V této souvislosti je důležité a zajímavé buď vyvinout nová činidla zaměřující se na více molekulárních cílů, nebo nastavit novou strategii, jako je aplikace kombinované terapie v léčbě pokročilého HCC.

Akteosid z cistancheje fenylethanoidní glykosid široce distribuovaný v mnoha léčivých rostlinách, včetně Ligustrum purpurascens [8], Rehmannia glutinosa [9] a Ligustrum purpurascens [10]. Rostoucí důkazy ukázaly, že akteosid může vykazovat různé biologické aktivity, včetně své protinádorové aktivity. Například akteosid vykazoval silné antiproliferativní účinky na buňky rakoviny prostaty [11]. Intraperitoneální podání akteosidu potlačilo růst nádoru u myšího modelu s melanomem pravděpodobně prostřednictvím inhibice proteinkinázy C [12]. Kromě toho akteosid zesiloval senzibilizaci buněk kolorektálního karcinomu na 5- fluorouracil prostřednictvím cílení na signalizaci PI3K/Akt [13]. Naše předchozí údaje také ukázaly inhibici melanogeneze akteosidem v buňkách melanomu B16 [14]. Navzdory tomu je k dispozici málo informací o možné účinnosti akteosidu v léčbě HCC a potenciálních základních mechanismech.

V této studii jsme to ukázaliAkteosid z cistancheinhibuje buněčnou proliferaci, tvorbu kolonií a migraci ve všech třech lidských HCC buněčných liniích BEL7404, HLF a JHH7. Angiogeneze je také inhibována po léčbě akteosidem, jak ukazuje inhibice tvorby trubic a migrace buněk HUVEC. In vivo protinádorová účinnost akteosidu je dále demonstrována na modelu nahých myší s xenoimplantátem BEL7404 nebo JHH-7, se zlepšením v kombinaci se sorafenibem při inhibici růstu xenograftu JHH-7. Protinádorové účinky akteosidu lze připsat jeho up-regulaci p53, stejně jako supresi KLK a angiogenezi.

Metody

Buněčná kultura

Buněčné linie lidského hepatocelulárního karcinomu (HCC) BEL7404, HLF a JHH7 byly získány z American Type Culture Collection a byly rutinně kultivovány v médiu DMEM obsahujícím 10 procent fetálního bovinního séra doplněného 100 jednotkami/ml penicilinu G a 100 ug/ml streptomycinu. ve zvlhčeném inkubátoru při 37 stupních s 5 procenty oxidu uhličitého. Endoteliální buňky lidské pupeční žíly (HUVEC) byly izolovány z lidských pupečníkových žil (poskytnuté společností ScienCell Research Laboratories, San Diego, USA) a udržovány v médiu endoteliálních buněk, jak bylo popsáno dříve [15].

ReagencieAkteosid z cistanche (A01) byl zakoupen od Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, Čína; šarže č. 100581; čistota větší nebo rovna 99 procent podle HPLC). Sorafenib byl získán od Selleck Chemicals (Houston, USA). Akteosid jsme rozpustili v 0,9% fyziologickém roztoku. Zásobní roztok sorafenibu byl připraven v dimethylsulfoxidu (DMSO; 10 mM), rozdělen na alikvoty a skladován při -20 stupních.

Zvířata

Ve studii byli použiti samci myší BALB/c (Nu/Nu) (18-20 g, 6–8 týdnů v době příjmu) (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., Shanghai, Čína). Zvířata byla umístěna v individuálně větraných polysulfonových klecích v místnosti s řízenou teplotou a světlem (12h světlo- 12h cyklus tmy, světla zapnutá v 7:00 ráno) s volným přístupem k potravě a vodě . Všechny experimentální protokoly byly schváleny Institutional Animal Care and Use Committee a prováděny podle pokynů Mezinárodní asociace pro studium bolesti týkající se použití laboratorních zvířat.

Test buněčné proliferace Antiproliferativní aktivita byla provedena za použití MTT testu. Stručně řečeno, buňky byly naneseny v hustotě 4–5 × 103 buněk na jamku na 96-jamkové destičky. Po připojení přes noc byly buňky ošetřeny řadou koncentrací akteosidu. Po ošetření léky v uvedeném časovém bodě byly buňky inkubovány s 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromidem (MTT Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN, USA. Konečná koncentrace: 5 ug/ml) po dobu 3–4 hodin při 37 stupních. Formazanový produkt byl rozpuštěn v DMSO pro kvantifikaci při vlnové délce 570 nm.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>10 buněk bylo spočítáno pod světelným mikroskopem (zvětšení x 100; Olympus, Tokio, Japonsko).

Test hojení ran Buňky byly nasazeny do {{0}}jamkových destiček (1 x 105 buněk na jamku) a kultivovány do 90% konfluence. Buněčná vrstva byla poškrábána sterilní 200 ul špičkou pipety, aby se vytvořila mezera v ráně. Buněčná migrace do poraněné oblasti byla vizualizována v uvedených časových bodech (0, 10 a 24 h) pod inverzním světelným mikroskopem při zvětšení x 100. Každý experiment byl proveden trojmo.

Test tvorby zkumavek HUVEC byly kultivovány, jak bylo popsáno dříve [15]. Stručně řečeno, 96-jamkové destičky byly potaženy Matrigelem (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) podle pokynů výrobce a poté vráceny do inkubátoru k polymeraci po dobu 30–40 minut. HUVEC pak byly nasazeny v hustotě 2 x 105 buněk/ml a ošetřeny různými danými léky po dobu 8 hodin. Tvorba trubek byla fotografována inverzním mikroskopem v uvedených časových bodech a analyzována pomocí softwaru ImageJ.

Western blotting analýza

Celkové buněčné lyzáty byly připraveny pomocí radioimunoprecipitačního testovacího pufru (RIPA) (50 mM Tris HCl při pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 procento NP40, 1 procento deoxycholátu sodného, ​​0,1 procenta SDS, 10 ug/ml leupeptinu, 10 ug/ml aprotininu a 2 mM PMSF). Vzorky proteinů se stejným množstvím (20 ug/dráhu) byly separovány na SDS-PAGE gelu a přeneseny na PVDF membrány (Bio-Rad, Hercules, CA). Membrány byly přes noc inkubovány s protilátkou p53 (Cell Signaling Technology, Boston, MA). Pro kontroly nanášení byly membrány opláchnuty stripovacím pufrem a znovu zkoušeny protilátkou -aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Proteiny byly detekovány pomocí detekčního systému ECL (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, USA).

qRT-PCR

Celková RNA byla extrahována z buněčných linií pomocí činidla Trizol (Invitrogen, USA) a podstoupila reverzní transkripci-polymerázovou řetězovou reakci (RT-PCR) za účelem syntézy cDNA pomocí komerčně dostupné soupravy. qRT-PCR v reálném čase pomocí 2xSYBR zelené qPCR Supermix byla provedena na stroji Stratagene Mx3000P PRC (Agilent Technologies, USA). Sekvence primerů jsou uvedeny níže: sense 5'-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3' a anti-sense 5'- CAAACAAGTT GTGGCGACCC-3′ pro KLK1; smysl 5′-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3′ a protismyslný 5′-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3′ pro KLK2; smysl 5′- CCACACCC GCTCTACGATATGA-3′ a protismyslný 5′-CCC AGA ATCACCCGAGCAG-3′ pro KLK3; smysl 5′-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3′ a protismyslný 5′- GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT-3′ pro KLK4; smysl 5′-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3′ a protismyslný 5′- GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3′ pro KLK5; smysl 5′- CTCTCTCCTGGGGACACAGA-3′ a protismyslný 5′- TCCGCCATGCACCAACTTAT-3′ pro KLK6; smysl 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3′ a protismyslný 5′- GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3′ pro KLK7; smysl 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG-3′ a protismyslný 5′- ACACCGCCACAGAGTAGTTG-3′ pro KLK8; smysl 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3′ a protismyslný 5′- CGGTGACGTCATAGAGACGG-3′ pro KLK9; sense 5′-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3′ a anti-sense 5′- CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3′ pro KLK10; smysl 5′-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3′ a protismyslný 5′-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3′ pro KLK11; smysl 5′-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3′ a protismyslný 5′-GGATCCAGTCCACATACTTGC-3′ pro KLK12; smysl 5′-CCTGAACCACGACCATGACA{104}}′ a protismyslný 5′-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3′ pro KLK13; smysl 5′-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3′ a protismyslný 5′-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA-3′ pro KLK14; smysl 5′-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3′ a antisense 5′-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3′ pro KLK15; sense 5′-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3′ a anti-sense 5′- GCGCCCAATACGACCAAA TC-3′ pro GAPDH. Hodnoty prahu cyklu (Ct) každého genu KLK byly normalizovány na hodnoty GAPDH a analyzovány pomocí softwaru MxPro.

In vivo protinádorová aktivita A01 samostatně nebo v kombinaci se sorafenibem Byly připraveny suspenze BEL7404 buněk (3 × 106 buněk) a injikovány subkutánně do pravého boku athymické nahé myši. Deset dní po inokulaci byly myši s nádorem (tělesná hmotnost (g): 22–26; průměr ± SEM: 23,8 ± 0.14) podrobeny screeningu a vybrány pro randomizaci do 7 léčebných skupin podle objemu nádoru ({ {12}} mm3). Celkem 38 myší bylo přiřazeno do různých léčebných skupin (n=5 na skupinu kromě modelové skupiny (n=8)). Zvířata byla poté léčena orální sondou akteosidem (A01; 12,5, 25 a 50 mg/kg), samotným sorafenibem (50 mg/kg) nebo v kombinaci s A01 (50 mg/kg) jednou denně po dobu 14 dnů. Kromě toho byla intravenózně podána také dávka 20 mg/kg A01. Dávky byly vybrány na základě předchozích studií a našich předběžných údajů [15]. Růst nádoru byl monitorován každé 3 nebo 4 dny pomocí elektronického posuvného měřítka, s objemem vypočítaným jako 0,5 x délka x šířka (mm3). Kromě toho byl zahrnut paralelní experiment využívající očkování JHH-7. Sedm dní po inokulaci byly myši s nádorem (tělesná hmotnost (g): 20–26; průměr ± SEM: 24,0 ± 0,20) vyšetřeny a vybrány pro randomizaci do léčebných skupin podle objemu nádoru (80-130 mm3 ). Celkem 23 myší bylo přiřazeno do 4 léčebných skupin (n=5 na skupinu kromě modelové skupiny (n=8)). Zvířata pak dostávala A01 (20 mg/kg, iv), samotný sorafenib (50 mg/kg, ig) nebo kombinaci s A01 (20 mg/kg, iv) jednou denně po dobu 14 po sobě jdoucích dnů. Všechny myši byly anestetizovány chloralhydrátem (350 mg/kg) a utraceny dislokací krku na konci období pozorování. A nádorová hmota byla odstraněna a zobrazena digitálním fotoaparátem.

Statistická analýza

Všechna data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (SD). Pokud není uvedeno jinak, statistické analýzy byly provedeny za použití analýzy rozptylu (ANOVA) následované posthoc Tukey testem. Hodnoty objemu nádoru jsou uvedeny jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM). K analýze dat objemu nádoru byla použita dvoucestná ANOVA následovaná Tukeyho testy. Pro statistické analýzy byl použit software GraphPad Prism. Hodnota p < 0,05="" byla="" považována="" za="" statisticky="">

Výsledek

Účinky A01 na proliferaci a tvorbu kolonií HCC in vitro

Pro test buněčné proliferace byly použity tři buněčné linie HCC (BEL7404, HLF a JHH7). Jak je ukázáno na obr. 1, MTT test odhalil, že A01 inhiboval proliferaci všech tří HCC buněk. Pro další otázku, zda antiproliferativní aktivita A01 byla způsobena jeho schopností inhibovat buněčnou klonogenicitu, byl proveden test tvorby kolonií. A01 při 100 uM vykazoval silnou inhibici tvorby kolonií v buňkách BEL7404 (obr. 2a a b). V kombinaci se sorafenibem (2 μM) byla inhibiční síla silnější než u A01 nebo samotného sorafenibu. Podobné výsledky byly také pozorovány u dalších dvou buněk HCC, HLF a JHH-7 (obr. 2c a d).

Účinky A01 samotného nebo v kombinaci se sorafenibem na buněčnou migraci HCC in vitro

Dále jsme hodnotili migraci buněk pomocí testu poškrábání ran. Jak je znázorněno na obr. 3, kombinace A01 (100 nebo 500 μM) a sorafenibu (10 μM) významně zabránila hojení ran u všech tří buněk HCC ve srovnání s kontrolní skupinou. U buněk BEL7404 A01 (100 nebo 500 μM) i sorafenib (10 μM) vyvolaly pouze tendenci k prevenci hojení ran bez statistické významnosti (obr. 3a a d). U HLF buněk A01 v 500 μM a sorafenib v 10 μM inhibovaly hojení ran. Zejména A01 (500 μM) v kombinaci se sorafenibem (10 μM) produkoval silnější inhibici hojení ran než samotný sorafenib (obr. 3b a e). U buněk JHH bránilo hojení ran A01 (500 μM) a sorafenib (10 μM). Kombinace A01 (100 μM) a sorafenibu (10 μM) vyvolala silnější inhibici hojení ran než samotný A01 (100 μM) nebo sorafenib (10 μM). Navíc A01 v 500 μM v kombinaci se sorafenibem (10 μM) vykazoval silnější inhibici hojení ran než samotný A01 (500 μM) nebo sorafenib (10 μM) (obr. 3c a f).

Účinky A01 samostatně nebo v kombinaci se sorafenibem na angiogenezi in vitro

Angiogeneze je úzce spojena s růstem, progresí a metastázami nádoru [16], a je tedy považována za jeden z intervenujících cílů léčby rakoviny. Nejprve jsme provedli test tvorby trubic, abychom analyzovali potenciální angiogenezi in vitro. Jak ukazuje obr. 4, léčba po dobu 3 hodin samotným sorafenibem (10 μM) nebo kombinací A01 (100 a 500 μM) a sorafenibem (10 μM) začala vykazovat inhibiční účinky na tvorbu struktur podobných cévám, tzn. prodloužení a vyrovnání HUVEC (obr. 4a a c). Po ošetření po dobu 8 hodin A01 (100 a 500 μM), sorafenib (10 μM), stejně jako kombinace A01 a sorafenibu, všechny významně inhibovaly tvorbu struktur podobných cévám, se silnější inhibicí kombinací A01 a sorafenibu než A01 nebo samotný sorafenib (obr. 4a a c). Kromě toho je buněčná migrace HUVEC klíčovým krokem k vytvoření nových cév během angiogeneze a je proto zkoumána. Jak je znázorněno na obr. 4b a d, A01 (500 μM), sorafenib (10 μM), stejně jako kombinace A01 (100 a 500 μM) a sorafenib (10 μM), všechny významně inhibovaly migraci buněk HUVEC. A01 (500 μM) v kombinaci se sorafenibem (10 μM) produkoval silnější inhibici než samotný A01 (500 μM) nebo sorafenib (10 μM).

Účinky A01 samostatně nebo v kombinaci se sorafenibem na in vivo růst nádoru BEL7404 a xenograftů JHH-7 HCC

Abychom dále vyhodnotili účinnost A01 samotného nebo v kombinaci se sorafenibem na in vivo nádorový růst HCC, vytvořili jsme model subkutánního xenograftu nahé myši pomocí BEL7404 nebo JHH-7 buňky. Jak je znázorněno na obr. 5, objem nádoru se výrazně snížil po léčbě A01 (25 a 50 mg/kg, orální sondou; 20 mg/kg, přes ocasní žílu, všechny p < 0,01="" vs="" modelová="" skupina)="" nebo="" samotný="" sorafenib="" (50="" mg/kg,="" orální="" sondou;="" p="">< 0,01="" vs="" modelová="" skupina)="" samotný="" (obr.="" 5a="" a="" b).="" kombinace="" a01="" (50="" mg/kg)="" a="" sorafenibu="" (50="" mg/kg)="" vykazovala="" silnější="" inhibici="" růstu="" nádoru="" ve="" srovnání="" se="" samotným="" sorafenibem="" (p="">< 0,01),="" ale="" vyvolala="" podobný="" účinek="" jako="" samotný="" a01="" (obr.="" 5a="" a="" c).="" ).="" dále="" jsme="" použili="" model="" nahých="" myší="" s="" xenoimplantátem="" jhh{21}}="" k="" dalšímu="" testování="" možné="" protinádorové="" účinnosti="" a01.="" jak="" je="" znázorněno="" na="" obr.="" 6,="" léčba="" a01="" (20="" mg/kg,="" iv)="" nebo="" sorafenibem="" (50="" mg/kg,="" ig)="" produkovala="" významnou="" inhibici="" růstu="" nádoru="" jhh-7="" xenograftu="" (p="">< 0,01="" vs="" modelová="" skupina="" ),="" s="" větší="" inhibicí,="" když="" jsou="" kombinovány="" dohromady="" (obr.="" 6a="" a="" b;="" p="">< 0,01="" vs="" a01="" nebo="" skupina="" sorafenib="">

Možná modulace peptidázy související s kallikreinem a p53Akteosid z cistanche

Peptidáza související s kallikreinem (KLK) byla navržena jako nádorový biomarker v diagnostice a prognóze různých nádorových onemocnění, včetně hepatocelulárního karcinomu, kvůli jeho dysregulované expresi [17–19]. V tomto scénáři jsme detekovali genovou expresi KLK1–15 v buněčné linii HCC JHH-7. Jak je znázorněno na obr. 7, léčba akteosidem způsobila významnou inhibici hladin KLK1, 2, 4, 9 a 10 mRNA (obr. 7a-e), bez významných změn zbytku KLK1–15 (data nejsou uvedena ). Kromě toho jsme také detekovali hladinu tumor supresorového proteinu p53 a odhalili zvýšení při léčbě akteosidem (obr. 7f).

Diskuse

Léčba pokročilého HCC byla dlouho neřešitelná z důvodu nemožnosti diagnostiky v časnějších stádiích a chemorezistence nádoru [5, 6]. Sorafenib, multikinázový inhibitor, o kterém se uvádí, že inhibuje buněčnou proliferaci a angiogenezi, se spolu s dalším perorálním multikinázovým inhibitorem lenvatinibem stal standardní léčbou pokročilého HCC [3, 5, 20, 21]. Celková míra přežití je však skromná ve světle nízké míry odpovědi a nevhodnosti v klinických podmínkách [3, 22]. Nedávná studie prokázala, že atezolizumab plus bevacizumab přinesly u pacientů s neresekabilním HCC lepší klinické výsledky než sorafenib, což z této kombinace činí možnou novou možnost léčby první volby u pokročilého HCC [7]. V této souvislosti jsme zjistili, že fenylethanoidový glykosid,Akteosid z cistancheinhibovala buněčnou proliferaci, tvorbu kolonií a migraci ve třech lidských HCC buněčných liniích BEL7404, HLF a JHH-7 a také zakázala angiogenezi HUVEC. Kombinace akteosidu a sorafenibu produkovala silnější inhibici tvorby buněčných kolonií a migrace buněk HCC a také angiogenezi HUVEC. Acteosid vykazoval protinádorovou účinnost v modelu nahých myší s xenoimplantátem BEL7404 nebo JHH-7, přičemž v kombinaci se sorafenibem došlo ke zvýšení inhibice růstu xenoštěpu JHH-7. Další analýzy odhalily zvýšení p53 a také pokles některých genů KLK. V souladu s tím by mělo být zváženo možné použití akteosidu jako doplňkové léčby při léčbě pokročilého HCC na klinice.

Přibývající důkazy ukázaly protinádorové účinkyAkteosid z cistanchev různých nádorových buňkách, jako jsou buňky melanomu B16, buňky glioblastomu, buňky kolorektálního karcinomu, buňky spinocelulárního karcinomu ústní dutiny, buňky rakoviny prostaty a buňky lidského adenokarcinomu prsu [11–13, 23–25] nebo u zvířat s nádory [12]. Navzdory tomu se jen málo studií zaměřilo na účinky akteosidu na HCC in vitro nebo in vivo kromě jedné studie používající diethylnitrosamin jako karcinogen k indukci hepatokarcinogeneze u potkanů ​​a odhalující chemoprevenci akteosidem [26]. V současné studii jsme prokázali inhibici buněčné proliferace, tvorby kolonií a migrace v HCC buněčných liniích akteosidem, stejně jako růst nádoru u myší nesoucích xenoimplantáty HCC buněčné linie, čímž jsme přímo prokázali protinádorové účinky akteosidu v HCC. Navíc kombinace akteosidu a sorafenibu vyvolala ještě silnější protinádorové účinky. V kombinaci s důkazy, že akteosid chrání před poškozením jater [27–29] bez toxických účinků u zvířat a bez mutagenity [30], se zdá být proveditelný pro budoucí aplikaci kombinované terapie akteosidem a sorafenibem u pacientů s pokročilým HCC na klinice.

Rodina lidských kalikreinů zahrnuje 15 homologních jednořetězcových sekretovaných serinových proteáz trypsinu nebo chymotrypsinu podobných (KLK1–15) a je zapojena do regulace růstu nádoru, neoplastické progrese, angiogeneze a metastáz [18, 31]. Zejména KLK byly navrženy jako nádorový biomarker v diagnostice a prognóze různých nádorových onemocnění, včetně hepatocelulárního karcinomu kvůli jeho dysregulované expresi [17–19]. Například KLK1 je navržen jako biomarker rakoviny žaludku v důsledku zvýšení hladin KLK1 v novotvaru žaludku a prevence růstu nádoru u rakoviny žaludku inhibicí aktivity KLK1 proteinem vázajícím kallikrein (KBP) [32]. V tomto scénáři jsme pozorovali významnou inhibici hladin KLK mRNA akteosidem (KLK1, 2, 4, 9 a 10). Bylo popsáno, že aplikace KBP, který se specificky váže na tkáňový kalikrein a inhibuje aktivitu kalikreinu, potlačuje růst HCC u myší pravděpodobně prostřednictvím jeho antiangiogenní aktivity [33], což naznačuje možné zapojení KLK do progrese HCC. Nádorový supresorový protein p53 je navíc schopen vyvolat senescenci, apoptózu i zástavu buněčného cyklu. Zvýšená exprese p53 propůjčuje rakovinným buňkám zvýšenou chemosenzitivitu [34]. V tomto ohledu naše západní výsledky ukázaly zvýšení hladin p53 po léčbě akteosidem. Celkově vzato je rozumné odvodit, že akteosid vykazuje protinádorové účinky na HCC pravděpodobně prostřednictvím jeho up-regulace p53, stejně jako inhibice KLK a angiogeneze.

Je třeba poznamenat, že přímý molekulární cíl, ke kterémuAkteosid z cistanchemůže přímo vázat, je stále nejasné. Naše předběžná data pomocí molekulárního dokování odhalila přímou vazbu akteosidu s kalikreinem (data nejsou uvedena). K objasnění tohoto předpokladu by byly nutné další experimenty. Kromě toho, pokud jde o dávky akteosidu použité pro buněčný test ve studii 10–50krát vyšší než dávky sorafenibu (10 μM), nejprve jsme vybrali tyto dávky akteosidu v souladu s vztah dávka-odpověď v testu MTT. Za druhé, dávky, které jsme použili (100 500 μM) byly srovnatelné s předchozími studiemi [35], ve kterých akteosid (100 μM) inhiboval buněčnou proliferaci buněk kolorektálního karcinomu. A konečně, navzdory vyšší dávce v buněčném testu, akteosid produkoval výraznou inhibici růstu nádoru u modelu HCC xenoimplantátových nahých myší v naší studii (25 a 50 mg/kg), přičemž účinky byly podobné jako u sorafenibu (50 mg/kg). Pro sorafenib byl v naší studii použit v dávce 10 μM na buněčné úrovni. Tato dávka je srovnatelná s předchozími studiemi, ve kterých bylo zjištěno, že sorafenib inhibuje životaschopnost buněk s IC50 4,0–6,5 μM v buněčných liniích HCC buněk PLC/PRF/5 a HepG2. Naproti tomu dávka sorafenibu použitá k potlačení růstu xenograftů HCC u myších samic SCID byla 30 mg/kg (po žaludeční sondou) [36]. Na klinice je doporučená dávka sorafenibu pro pacienta 400 mg za čas (2*0,2 g), dvakrát denně (celkem 800 mg za den). Tato dávka pro sorafenib používaná na klinice je v kontrastu s dávkou používanou v buněčném testu (hodnota IC50 v hladině μM), pravděpodobně kvůli jeho špatné absorbovatelnosti za podmínek in vivo. Pro akteosid, na základě jeho dávkování u myší (50 mg/kg, ig), jeho ekvivalentní dávka pro člověka (60 kg BW) je asi 250 mg. Toto dávkování je srovnatelné s dávkováním sorafenibu používaného na klinice a mělo by být pro pacienty přijatelné.

Závěry Na závěrAkteosid z cistancheje schopen vykazovat protinádorový účinek v buněčných liniích HCC a u nahých myší nesoucích xenoimplantáty buněčné linie HCC, účinky pravděpodobně prostřednictvím zvýšení hladin p53 a také zabránění KLK a angiogenezi. Akteosid by mohl být užitečný jako doplněk při léčbě pokročilého HCC na klinice.

Reference

1 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Globální statistika rakoviny 2018: GLOBOCAN odhady incidence a mortality na celém světě pro 36 rakovin ve 185 zemích. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394–424..

2. Llovet JM, Zucman-Rossi J, Pikarsky E, Sangro B, Schwartz M, Sherman M, Gores G. Hepatocelulární karcinom. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16018.

3. Sim HW, Knox J. Hepatocelulární karcinom v éře imunoterapie. Curr Probl Cancer. 2018;42(1):40–8. 4. Jiang Y, Han QJ, Zhang J. Hepatocelulární karcinom: mechanismy progrese a imunoterapie. World J Gastroenterol. 2019;25(25):3151–67.

5. Forner A, Da Fonseca LG, Diaz-Gonzalez A, Sanduzzi-Zamparelli M, Reig M, Bruix J. Kontroverze v managementu hepatocelulárního karcinomu. JHEP Rep. 2019;1(1):17–29.

6. Hartke J, Johnson M, Ghabril M. Diagnostika a léčba hepatocelulárního karcinomu. Semin Diagn Pathol. 2017;34(2):153–9.

7. Finn RS, Qin S, Ikeda M, Galle PR, Ducreux M, Kim TY, Kudo M, Breder V, Merle P, Kaseb AO a kol. Atezolizumab plus bevacizumab u neresekabilního hepatocelulárního karcinomu. N Engl J Med. 2020;382(20):1894–905.

8. He ZD, Ueda S, Akaji M, Fujita T, Inoue K, Yang ČR. Monoterpenoidní a fenylethanoidní glykosidy z Ligustrum peduncular. Fytochemie. 1994;36(3):709–16.

9. Li H, Chou GX, Wang ZT, Hu ZB. HPLC stanoveníakteosidv Radix Rehmanniae. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006;31(10):822–4.

10. Wong IY, He ZD, Huang Y, Chen ZY. Antioxidační aktivity fenylethanoidových glykosidů z Ligustrum purpurascens. J Agric Food Chem. 2001;49(6):3113–9.

11. Mulani SK, Guh JH, Mong KK. Obecná syntetická strategie a antiproliferační vlastnosti na buněčných liniích rakoviny prostaty pro přírodní fenylethanoidové glykosidy. Org Biomol Chem. 2014;12(18):2926–37.

12. Cheimonidi C, Samara P, Polychronopoulos P, Tsakiri EN, Nikou T, Myrianthopoulos V, Sakellaropoulos T, Zoumpourlis V, Mikros E, Papassideri I a kol. Selektivní cytotoxicita rostlinné látky akteosid proti nádorovým buňkám a její mechanismy. Redox Biol. 2018;16:169–78.

13. Attia YM, El-Kersh DM, Wagdy HA, Elmazar MM. Verbascoside: identifikace, kvantifikace a potenciální senzitizace buněk kolorektálního karcinomu k 5-FU cílením na dráhu PI3K/AKT. Sci Rep. 2018;8(1):16939.

14. Liu S, Zhao Z, Huo Z, Xu Z, Zhong Y, Wang X, Yang Y, Wang Z. Vodný extrakt květu Osmanthus fragrans a jeho obohacený akteosid inhibují melanogenezi a ultrafialovým zářením indukovanou pigmentaci. Nat Prod Commun. 2018;13(5):575–80.

15. Wang J, Ma S, Chen X, Zhang S, Wang Z, Mei Q. Nový inhibitor PI3K S1 synergizuje se sorafenibem v buňkách nemalobuněčného karcinomu plic zahrnujících signalizaci Akt-S6. Zkoumejte nové drogy. 2019;37(5):828–36.

16. Hanahan D, Weinberg RA. Charakteristické znaky rakoviny: příští generace. Buňka. 2011;144(5):646–74. 17. Emami N, Diamandis EP. Užitečnost peptidáz souvisejících s kallikreinem (KLK) jako biomarkerů rakoviny. Clin Chem. 2008;54(10):1600–7.

18. Tailor PD, Kodeboyina SK, Bai S, Patel N, Sharma S, Ratnani A, Copland JA, She JX, Sharma A. Diagnostický a prognostický biomarkerový potenciál genů rodiny kallikreinu u různých typů rakoviny. Oncotarget. 2018;9(25): 17876–88.

19. Kontos CK, Mavridis K, Talieri M, Scorilas A. Kallikrein-related peptidases (KLK) in gastrointestinální rakoviny: mechanické a klinické aspekty. Thromb Haemost. 2013;110(3):450–7.

20. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS a kol. Účinnost a bezpečnost sorafenibu u pacientů v asijsko-pacifické oblasti s pokročilým hepatocelulárním karcinomem: randomizovaná, dvojitě zaslepená, placebem kontrolovaná studie fáze III. Lancet Oncol. 2009;10(1):25–34. 21. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A a kol. Sorafenib u pokročilého hepatocelulárního karcinomu. N Engl J Med. 2008;359(4):378–90.

22. Píseň MJ. Infuzní chemoterapie jaterních tepen pro pokročilý hepatocelulární karcinom. World J Gastroenterol. 2015;21(13):3843–9.

23. Liao YF, Rao YK, Tzeng YM. Vodný extrakt Anisomeles India a jeho purifikovaná sloučenina vykazuje antimetastatickou aktivitu prostřednictvím inhibice aktivace NF kappaB/AP-1-závislé MMP-9 v buňkách MCF-7 lidského karcinomu prsu. Food Chem Toxicol. 2012;50(8):2930–6.

24. Zhang Y, Yuan Y, Wu H, Xie Z, Wu Y, Song X, Wang J, Shu W, Xu J, Liu B a kol. Účinek verbascosidu na apoptózu a metastázy u lidského orálního spinocelulárního karcinomu. Int J Cancer. 2018;143(4):980–91.

25. Hwang TW, Kim DH, Kim DB, Jang TW, Kim GH, Moon M, Yoon KA, Choi DE, Park JH, Kim JJ. Synergický protirakovinný účinek chemoterapie glioblastomu na bázi akteosidů a temozolomidu. Int J Mol Med. 2019; 43(3):1478–86.

26. Peerzada KJ, Faridi AH, Sharma L, Bhardwaj SC, Satti NK, Shashi B, Tasduq SA. Akteosidy zprostředkovávají chemoprevenci experimentální karcinogeneze jater prostřednictvím STAT-3 regulovaného oxidačního stresu a apoptózy. Environ Toxicol. 2016;31(7):782–98.

27. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metabolity dietárního akteosidu: profily, izolace, identifikace a hepatoprotektivní kapacity. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

28. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Namba T, Kadota S. Akteosid inhibuje apoptózu u poškození jater vyvolaného D-galaktosaminem a lipopolysacharidy. Life Sci. 1999;65(4):421–30.

29. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, Huang Y. Ochranný účinek akteosidu na imunologické poškození jater vyvolané Bacillus Calmette Guerin plus lipopolysacharid. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.

30. Lu B, Li M, Zhou F, Huang W, Jiang Y, Mao S, Zhao Y, Lou T. Extrakt z vonných květů Osmanthus bohatý na fenylethanoidní glykosidy: studie akutní a subchronické toxicity. J Ethnopharmacol. 2016;187:205–12.

31. Diamandis EP, Yousef GM. Lidské tkáňové kalikreiny: rodina nových biomarkerů rakoviny. Clin Chem. 2002;48(8):1198–205.

32. Sawant S, Snyman C, Bhoola K. Srovnání exprese tkáňového kalikreinu a kininového receptoru u žaludečních vředů a novotvarů. Int Immunopharmacol. 2001;1(12):2063–80.

33. Lu L, Yang Z, Zhu B, Fang S, Yang X, Cai W, Li C, Ma JX, Gao G. Kallikreinbinding protein potlačuje růst hepatocelulárního karcinomu antiangiogenní aktivitou. Cancer Lett. 2007;257(1):97–106.

34. Guntur VP, Waldrep JC, Guo JJ, Selting K, Dhand R. Zvýšení proteinu p53 senzibilizuje nemalobuněčný karcinom plic na paclitaxel a cisplatinu in vitro. Anticancer Res. 2010;30(9):3557–64.

35. Zhou L, Feng Y, Jin Y, Liu X, Sui H, Chai N, Chen X, Liu N, Ji Q, Wang Y, Li Q. Verbascoside podporuje apoptózu regulací signalizace HIPK2-p53 u člověka kolorektální rakovina. BMC rakovina. 2014;14:747.

36. Liu L, Cao Y, Chen C, Zhang X, McNabola A, Wilkie D, Wilhelm S, Lynch M, Carter C. Sorafenib blokuje dráhu RAF/MEK/ERK, inhibuje nádorovou angiogenezi a indukuje apoptózu nádorových buněk v hepatocelulárních model karcinomu PLC/PRF/5. Cancer Res. 2006;66:11851–8.