Nový, ataxický myší model ataxie Telangiektázie způsobené klinicky relevantní nesmyslnou mutací (část 2)

Pro více informací prosím kontaktujtedavid.wan@wecistanche.com

3.{1}} Diskuze

Zvýšením genotoxického stresu přidáním sekundárního zásahu do dráhy DDR jsme vytvořili nový myší model, který vykazuje dosud nejkomplexnější sadu příznaků AT ze všech modelů. To zahrnuje těžkou a progresivní ataxii spojenou s cerebelární atrofií a poruchami vlastností PN spolu s vysokým výskytem rakoviny a defektů ve vývoji imunitních buněk. Společně tyto komorbidity zahrnují tři hlavní příčiny předčasné smrti vAT – každý přispívajícína zhruba třetinu úmrtí. Z nich je zneschopňující účinek ataxie nejpronikavější a pacienti a ošetřující uvádějí, že má největší dopad na kvalitu jejich života. Z tohoto důvodu je přítomnost ataxie a cerebelární atrofie v tomto novém myším modelu velmi důležitá, protože poskytuje vůbec poprvé zdroj nejen k objasnění mechanismů neurologické dysfunkce, ale také kriticky potřebný in vivo model pro otestovat velmi potřebná AT terapeutika, jako jsou sloučeniny pro čtení, které zde popisujeme. Našli jsme několik podobností mezi celkovou progresí ataxie v Atm3535; Aptx myši aAT pacientů. V klinické AT jsou motorické deficity pozorovatelné zhruba do 2 let věku, kdy rodiče a lékaři zjistí sníženou schopnost přechodu z batolecího do hladkého, reflexně koordinovaného vrátka – o motorických defektech v časnějších stádiích v důsledku onemocnění je bohužel známo jen málo. nízká prevalence a současný nedostatek včasného diagnostického testování (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Pacienti se obvykle naučí chodit bez pomoci a neurologické symptomy mají tendenci zůstat stabilní během prvních 4 až 5 let života (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Našli jsme podobnou časnou progresi motorických deficitů u Atm735×R3x; Myši Aptx^', detekující časné mírné motorické deficity na P8 (deficit vzpřimovacího reflexu), po kterém následovalo období relativní stability, před nástupem progresivní a těžké ataxie rozvíjející se po p210, která zahrnovala změny v chůzi, úlekový reflex, třes a lokomotoriku aktivita. Z těchto zjištění vyplývá několik důležitých otázek, včetně toho, zda ATM a/nebo APTX mají neurovývojovou roli v

mozeček. Budoucí studie zaměřené na ranou fázi poruchy budou rozhodující pro pochopení toho, zda se mozeček vyvíjí normálně před dysfunkcí nebo zda jsou vývojové vady počáteční příčinou. Zjistili jsme, podobně jako u pacientů s AT, že závažnost pozdně se vyvíjející ataxie byla proměnlivá, přičemž některé myši se pohybovaly s neohrabaným, vysoko nasazeným zadním vrátkem (Video 3) a jiné se pohybovaly téměř výhradně prostřednictvím zkroucení zadního trupu ( Obr. 1E a Video 4) (Rothblum-Oviatt et al. 2016; Levy a Lang 2018; Boder a Sedgwick 1958). Celkově jsme zjistili, že Atm?35×xR35×; U myší Aptx se vyvinula vizuálně hluboká a měřitelná progresivní ztráta motorické koordinace podobná té, která byla pozorována u pacientů s AT, která byla zachráněna expresí alespoň jedné kopie Atm nebo Aptx get he. Ztráta motorické koordinace u AT byla připisována cerebelární degeneraci kvůli její relativně selektivní neuropatologii v mozku a její kauzální roli v několika různých formách ataxie (Hoche et al.2012). V souladu sAT pacientneuroimagingové studie (Wallis et al. 2007; Sahama et al. 2015; Sahama et al. 2014; Dineen et al. 2020; Tavani et al. 2003; Quarantelli et al. 2013), zjistíme, že velikost mozečku v Atm735×R3 ; Myši Aptx' jsou zpočátku normální, ale progresivně atrofují současně se změnami neurologické funkce. Zatímco ztráta cerebelární tkáně byla považována za hlavní příčinu ataxie u lidí, z klinických údajů není jasné, zda je závažnost ataxie dobrým prediktorem rozsahu cerebelární degenerace zjištěné postmortem (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al, 2006 : Dineen a kol. 2020). V Atm?35×R35×; U myší Aptx^ nacházíme jasnou atrofii spojenou se ztenčením vrstvy dendritů Purkyňových neuronů, která předchází pozdním vážným deficitům chování. Naše histologická pozorování v Atm?35xR35×; Aptx'myši naznačují, že změny v samotné cerebelární funkci, spíše než hluboká ztráta cerebelárních buněk, jsou dostatečné k vyvolání ataxického fenotypu, což je v souladu s pozorováním defektů chování před významnou ztrátou PN u několika SCA (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti a kol., 2000; Clark a kol., 1997; Jayabal a kol., 2016). Důvod, proč je nedostatek ATM a APTX nutný ke vzniku ataxie u myší, když ztráta kteréhokoli z nich je dostatečná k tomu, aby způsobila ataxii u lidí, zůstává nejasný. Jednou z možností je, že mozek hlodavců může flexibilněji využívat kompenzační dráhy nebo nadbytečné proteiny a přitom reagovat na 10-20k lézí DNA, které každý den ovlivňují buňky (Lindahl a Barnes 2000). Existuje několik forem opravy DNA, které mohou potenciálně čelit této výzvě, včetně opravy excizí báze (BER), opravy excize nukleotidů (NER),

Kliknutím sem se dozvíte více o Cistanche

stejně jako homologní a nehomologní spojování konců (HEJ a NHEJ, respektive), z nichž všechny byly zapleteny do ATM a APTX (Chou et al. 2015; Caglayan et al. 2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee a Walker 2017) Alternativně to může být V případě, že nedostatek ATM nebo APTX samotných nemá adekvátní dopad na zdraví buněk během relativně krátké doby života myši, a proto je eliminace obou proteinů nezbytná k dosažení dostatečné akumulace poškození DNA, které se projeví během tohoto časového období. Tato možnost je posílena skutečností, že ATM a APTX mají odlišné biochemické vlastnosti a funkční role v reakci na poškození DNA, a proto se předpokládá, že jejich nedostatek způsobí širší zásah do stability genomu (tj. zvýšený genotoxický stres). Naše zjištění, že k vyvolání neurologických defektů u myší jsou nutné dva proteiny genomové stabilizační dráhy, silně naznačuje, že je to ztráta ATM's Oriole při opravě DNA, spíše než potenciální funkce v signalizaci oxidativního stresu, mitofágii nebo mitochondriální funkci, která způsobuje cerebelární defekty ( Shiloh 2020). Alternativy však nelze zcela vyloučit, protože APTX byl stejně jako ATM pozorován v mitochondriích mozkových buněk, kde se předpokládá, že podporuje zpracování mitochondriální DNA (Meagher a Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011). Tento nový model myši poskytuje nový nástroj k prozkoumání těchto možností a mechanickému definování toho, jak ztráta ATM a APTX nakonec způsobí cerebelární dysfunkci. Biofyzikální poruchy pozorované u PN zaznamenaných z AtmR35XR35X; Aptx myši se podobně nacházejí v několika dalších myších modelech ataxie. To zahrnuje změny, které jsme pozorovali u vstupního odporu PN, kapacitance membrány a prahu a šířky AP, které byly také popsány u myších modelů SCA jako 1, 3 a 7 (Stoyas a kol. 2020; Shakkottai a kol. 2011; Dell „Orco a kol. 2015). Navíc progresivní snižování frekvence střelby PN akčního potenciálu, které uvádíme, pozitivně koreluje s rozvojem ataxie u AtrnR35XR35X; Aptx'myši jsou hlášeny ve velkém počtu modelů ataxických myší, včetně SCA 1, 2, 3, 5, 6 a 13 a také v několika epizodických formách (viz přehled (Cook, Fields a Watt 2021)). Vzhledem k významnému překrývání poruch PN pozorovaných u mnoha různých ataxií způsobených odlišnými buněčnými defekty, bylo obnovení spouštěcích frekvencí PN AP považováno za široce založený terapeutický přístup. Zůstává však nejasné, zda je snížená střelba PN příčinným faktorem ataxie. Experimentální důkazy navíc naznačují, že změny v aktivitě PN mohou být ve skutečnosti generalizovanou reakcí na udržení homeostázy během probíhajícího poškození fyziologie PN související s onemocněním (Dell'Orco et al.2015). Je tedy zapotřebí neustálého úsilí napříč všemi cerebelárními ataxiemi, aby bylo možné spojit genetické, molekulární a buněčné poruchy způsobené onemocněním se specifickými změnami v cerebelární nervové signalizaci, které nakonec generují ataxii. Významný význam v tomto úsilí bude určit, zda onemocnění způsobující cerebelární defekty běžně nebo odlišně způsobují ataxii prostřednictvím ztráty cerebelární funkce (např. ztráta koordinačních signálů během pohybu), nebo z dominantně-negativního efektu (např. narušení downstream neurálního obvody s abnormálními nervovými výstupy). V konečném důsledku, zatímco společná terapeutická strategie pro řešení cerebelárních ataxií by měla největší dopad, řízený přístup, který se zabývá odlišnými genetickými a molekulárními příčinami buněčné dysfunkce, může být nakonec nezbytný pro úspěšný vývoj účinné terapie. Mechanistická vazba mezi nedostatkem DNA proteiny stability jako ATM a APTX a dysfunkce PN není zdaleka jasná. Naše výsledky naznačují, že účinek ztráty ATM a APTX na PN je vnitřní, protože nenacházíme změny v presynaptických vlastnostech granulárních buněk ani důkazy o jejich buněčné ztrátě (žádná změna tloušťky GCL). Kromě toho, zatímco jsme pozorovali rozdíly v krátkodobé plasticitě nižších olivárních vstupů u PN a divokého typu s deficitem ATM a APTX, tyto výsledky pravděpodobně poukazují na narušení homeostázy Ca2* potenciálně prostřednictvím snížení inositolu 1,4,5- exprese trifosfátového receptoru 1(ltpr1), podobná těm pozorovaným u myších modelů SCA 1, 2 a 3 a také u myší s deficitem ATM (Kim et al. 2020; Chen et al. 2008; Demirci et al. 2009; Shakkottai et al. kol.2011). I když to poskytuje slibnou cestu pro budoucí zkoumání a srovnání, zatím není jasné, dokonce ani u SCA, zda změny v homeostáze Ca2* jsou kauzálním faktorem nebo jen dalším příznakem nebo dokonce kompenzační reakcí nemocných nebo narušených PN (Dell „Orco a kol. 2015). V imunitním systému se ATM podílí na opravě zlomů DNA, které se přirozeně vyskytují během genového přeskupení genů pro antigenní receptory v prekurzorech B- a T-buněk, což je fenomén kritický pro diverzitu antigenních receptorů (LG a TCR) těchto buněk. zjištění tohoT-buňkaproporce v krvi jsou významně sníženy, což je v souladu s předchozími studiemi na lidech a AT knockout myších (Schubert, Reichenbach a Zielen 2002; Hathcock a kol. 2013; Chao, Yang a Xu 2000; Barlow a kol. 1996). Toto snížení T-buněk na periferii pravděpodobně koreluje s defektem buněčné i humorální imunity. Důležité je, že jsme zjistili, že exprese jedné kopie genu ATM je dostatečná k obnovení deficitů CD4 plus v krvi, což naznačuje, že terapie schopné obnovit částečnou expresi ATM by měly terapeutickou účinnost. Ačkoli jsme v tomto článku nehodnotili vývoj B-buněk, je pravděpodobné, že podobné závěry by se vztahovaly na tento proces vzhledem k jejich mechanistickým podobnostem (Marshall et al. 2018). Jak se očekávalo, snížení T-buněk v periferní krvi koreluje s defektním vývojem thymocytů. V brzlíku jsme našli dva hlavní defekty. Jeden, vyvolaný primárně deficitem APTX, se projevuje jako defekt v přechodu DN3 na DN4, který se shoduje s časným přeskupením lokusu TCR. Druhý defekt, primárně způsobený deficitem ATM, koreluje se sníženou progresí dvojitě pozitivních CD4*CD8 na jednopozitivní buňky, primárně CD4' thymocyty. Zatímco zjištění APTX bylo překvapivé, protože jeho nedostatek (AOA 1) není spojen s imunitním deficitem, je známo, že APTX interaguje s proteiny pro přeuspořádání genu TCR, včetně XRCC4 (Clements et al. 2004). Budoucí studie zaměřené na definování role APTX v mechanismech spojování konců během přeuspořádání genu TCR budou

je důležité a možnost, že alternativní mechanismy spojování konců, jako je použití mikrohomologií, odpovídají za nedostatek imunitního deficitu v jeho nepřítomnosti, vyžaduje další zkoumání (Bogue et al. 1997). Schopnost přežití Atm?35×/R35×; Aptx'myši jsou podstatně delší než předchozí modely myší AT. Ve srovnání prvníAT KOmyší model publikovaný Barlow et al. zemřel na thymom obvykle během 2-4 měsíců po narození (Barlow et al. 1996). Snížená schopnost přežití při rakovině u tohoto a mnoha dalších knockoutovaných myších modelů AT je pravděpodobně genetická, protože se ukázalo, že kmen v pozadí ukrývající mutaci má významné účinky na prevalenci rakoviny a přežití s ​​A/J a C57BL/6

pozadí mající významně zvýšenou schopnost přežití oproti kmenům BALBC a 129S (Genik et al. 2014). Pravděpodobně stojí za tím skutečnost, že naše myši s deficitem ATM byly vytvořeny na pozadí C57BL/6; že u myší Aptx*t se nevyvine ataxie, jde o jejich poměrně dlouhou životnost. Vzhledem k tomu, že Atm35xR35×; nepravděpodobné, že by časná smrt u AT KO myší bránila pozorování ataxického fenotypu, který by se jinak u těchto myší vyvinul. Není však známo, zda pozadí C57BL/6 propůjčuje odolnost vůči rozvoji ataxie, jako je tomu u rakoviny. Definice genetických nebo případně epigenetických faktorů, které ovlivňují závažnost onemocnění, by mohla poskytnout cesty pro budoucí terapeutický vývoj. Vzhledem ke globální povaze nulové mutace ATM a APTX v našem myším modelu nemůžeme zcela vyloučit, že k těžkému ataxickému fenotypu mohou přispět i extracerebelární defekty, a tedy budoucí vyšetření mimo mozeček v předním mozku, mozkovém kmeni, míše , a dokonce i svaly budou muset být provedeny. V rámci cerebellum, zatímco jsme našli některé anatomické rozdíly ve vlastnostech střelby PN v různých oblastech cerebellum, jsme nezjistili regionální rozdíly v šířce ML nebo hustotě PN. Při použití regionální anatomie jako seskupovacího faktoru v mozečku však existují problémy, protože fyzické záhyby tkáně nemusí nutně korelovat s hranicemi funkčních domén, molekulární exprese nebo domén fyziologických vlastností, které byly popsány (Apps a Hawkes 2009 Tsutsumi a kol. 2015; Gao, van Beugen a De Zeeuw 2012; Zhou a kol. 2014). Experimenty zaměřené na zkoumání rozsahu cerebelárních defektů v těchto doménách budou důležité v budoucích studiích a ve srovnání s neoficiálními zprávami o anatomických rozdílech u pacientů s AT (Verhagen a kol. 2012; De Leon, Grover a Huff 1976; Amromin, Boder, a Teplitz 1979; Monaco a kol. 1988; Terplan a Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare a Lopez 1967; Aguilar a kol. 1968a; Paula-Barbosa a kol. 1983). Zatímco u Atm735wR35x detekujeme dvě potenciální fáze progrese ataxie; Aptx myši, pozdější stádium těžké ataxie se u myší vyvine v dospělosti ve srovnání s počátkem v dětství u lidí. To může omezit jeho použití v některých neurovývojových studiích. Interpretace budoucích experimentů musí také pečlivě zohlednit skutečnost, že tento nový model exprimuje nulové mutace ve dvou genech stability genomu současně, což je situace, která nebyla detekována u lidských pacientů s AT ani AOA1. A konečně, určit, kde, kdy a jak nedostatek ATM způsobuje cerebelární patologii a ataxii, byl problém, protože předchozí myši s deficitem ATM obecně postrádaly charakteristické rysy potřebné pro kauzální spojení buněčných a molekulárních deficitů s ataxickým fenotypem. Bylo definováno několik slibných směrů zkoumání, včetně těch zaměřených na neuronální úroveň, kde se ATM podílí na signalizaci oxidačního stresu (Chen et al. 2003) a synaptické funkci (Li et al. 2009; Vail et al. 2016). stejně jako gliové funkce, kde nedávné důkazy naznačují, že gliová patologie může být hlavním faktorem v cerebelární patologii (Kaminsky et al. 2016; Campbell et al. 2016; Petersen, Rimkus a Wassarman 2012; Weyemi et al. 2015). Tento nový zvířecí model poskytuje nový nástroj pro testování mechanistických hypotéz týkajících se toho, jak nedostatek ATM způsobuje cerebelární patologii a ataxii. Kromě toho může tento model sloužit především jako kritický preklinický nástroj pro testování dříve navržených terapeutických kandidátů (Browne et al. 2004; Chen et al. 2003) a našich vlastních sloučenin SMRT (Du et al. 2013). Závažná omezení neexistence vhodného preklinického modelu pro terapeutické testování, zejména u vzácných poruch, jako je AT a AOA1, nelze přeceňovat.

4.0 Materiály a metody

4.1 Etické prohlášení

Tato studie byla provedena v přísném souladu s doporučeními v Příručce pro péči a použití laboratorních zvířat Národního institutu zdraví. Se všemi zvířaty bylo zacházeno v souladu se schválenými protokoly Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) v The Lundquist Institute (31374-03,31773-02) a UCLA (ARC-2007-082, ARC{{3}). }). Protokol byl schválen Výborem pro etiku pokusů na zvířatech Lundquistova institutu (číslo záruky: D16-00213). Bylo vynaloženo veškeré úsilí k minimalizaci bolesti a utrpení poskytováním podpory v případě potřeby a výběrem etických koncových bodů.

4.2 Myši

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>Mutace T nalezená ve velké populaci severní AfrikyVpacientů using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), replikující lidský AT PTC). Genomické alely byly poté klonovány do modifikované verze savčího zaměřovacího vektoru NorCOMM pomocí 3-way Gateway Reaction (Bradley et al. 2012). Výsledné targetovací vektory byly elektroporovány do buněk C2 ES (C57BI/6N, odvozené v laboratoři A. Nagy, Toronto, Kanada) a úspěšně zacílené klony byly identifikovány selekcí pomocí G418 (Gertsenstein et al.2010). Integrace mutované zaměřovací kazety do lokusu Atm genu byla potvrzena Southern blotem a sekvenováním produktů PCR k potvrzení přítomnosti mutace Atm PTC, bezchybného cílení do lokusu Atm a bezchybných funkčních komponent

vektor (data nejsou uvedena). Pozitivní ES klony byly použity pro injekci blastocyst pro získání transgenních linií. Transgenní alela obsahovala floxovaný lidský beta-aktinový promotor-deltaTK1-Neo cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc; (obr. 1A). Genotypizace dvou Atm linií byla provedena pomocí následujících primerů na Tm 62. stupni: Atm genový dopředný (F) primer: 5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; a Atm genový reverzní(R)primer: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', vytvářející alelový produkt divokého typu o 151 bp nebo cílový alelový produkt o 241 bp (obr. 1A, 1B). Atmn35~ a Atm035×v byly zpětně zkřížené s C57Bl/6J myšmi po 9 generací (99,2 procent isogenní) před kryokonzervací a následnou rederivací pomocí C57BI/6J náhradních matek. Atm735× a Atm?35xa Atm 35×/Q35× byly šlechtitelé získané od F1 sourozenců Atm35 a Atm835X plus myší. AtmR35×k35×: obě byly shledány plodnými. Myši Aptx knockout (Aptx) byly vytvořeny a poskytnuty Dr. Mathewsovi jako embrya od Dr. McKinnona (Ahel et al. 2006) a následně získány prostřednictvím náhradních matek C57Bl/6J. Myši Aptx' jsou na smíšeném pozadí C57Bl/6 a 129. Atm35k35; Aptx myši různých kombinací divokého typu, heterozygotních a homozygotních kombinací byly vytvořeny z Atm35X; Aptx šlechtitelé byli vytvořeni křížením myší Atm?35×R35 a Aptx^. Jedna kohorta dvojitě mutantních a odpovídajících kontrolních myší byla použita v longitudinální behaviorální studii pro analýzy chůze a testování SHERPA (obr. 2, 3). Pro elektrofyziologické, imunohistologické a testovací experimenty s vertikálním pólem bylo použito několik dalších kohort věkově odpovídajících dvojitě mutantních a kontrolních myší (obr. 4, 7). Imunologické experimenty a experimenty s proteinovou expresí byly provedeny s použitím myší vyšlechtěných z původních myší odvozených z AtmR35× a Atm35× (obr. 5, 6 a 8). Genotypizace byla provedena ze vzorků ušní tkáně P8-11 myší. Ke stanovení genotypu každého zvířete byly použity metody PCR v reálném čase prováděné společností Transnetyx Inc. Zvířata byla identifikovatelná pomocí tetování na noze provedeného současně s biopsií ucha. Jedinečné primery pro Atm35× a Atm35× byly kvantifikovány a použity k identifikaci divokého typu, heterozygotních a homozygotních myší (uvedených výše). K hodnocení jejich genotypů byly použity primery Aptx' a Aptx*".

4.3 Zdraví zvířat

Zvířata byla zvážena pomocí digitální váhy na P8, 45, 120,210,400. Smrt zvířete byla zaznamenána jako den, kdy byla nalezena mrtvá, nebo v den eutanazie, kdy zvířata dosáhla humánního koncového bodu (zvíře neschopné se narovnat do 60. let, výrazná srst indikující nedostatečnou péči o sebe nebo nadměrný stres, jak poznamenal veterinární lékař personál). Mrtvá těla zvířat byla ihned po smrti zmražena a posmrtné pitvy byly prováděny v dávkách. Pravděpodobná příčina smrti byla podle našich nejlepších schopností stanovena ve spolupráci se štábním veterinářem (Dr. Catalina Guerra) vizuální kontrolou vnitřních orgánů. Některé myši byly kanibalizovány nebo náhodně zlikvidovány personálem vivária a byly

proto byly označeny jako „chybějící“. Myši bez rozpoznatelné vizuální příčiny smrti byly označeny jako „neurčitelné“. pravděpodobné příčiny smrti (např. zvětšená játra, ucpání moči) byly označeny jako „jiné“.

4.4 Chování

Před provedením jakéhokoli behaviorálního testu byly myši aklimatizovány na behaviorální sadu po dobu ~ 20 minut. Myši byly testovány v různou denní dobu, v souladu s jejich denním cyklem. Byla provedena baterie behaviorálních testů na naivních dvojitě mutantních myších uvedených genotypů v různých časových bodech v závislosti na chování, ale ve stejné kohortě myší. Baterie testů zahrnovala hodnocení Catwalk Gait (P45, 120,210, 400) a podskupinu testů SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College a Royal-London-Hospital Phenotype Assessment (SHERPA) (P30 a 400). Tyto testy byly provedeny UCLA Behavioral Core. Myši s dvojitou mutantou a kontrolní myši byly dále vyšetřeny testem s vertikálním pólem. Všechny behaviorální aparáty byly otřeny ethanolem (70 procent) mezi každým testovaným subjektem.

Analýza chůze

Použili jsme analytický systém Noldus Catwalk Gait navržený pro poloautomatické měření a analýzu chůze myší během normální chůze. Stručně řečeno, pohyb myší přes chodbu se skleněným dnem je nahráván z centrální pozice. Otisky tlapek jsou ve videu zvýrazněny díky světelnému osvětlení přes skleněnou pochozí plošinu. Každý krok myši ve videu je následně detekován pomocí Catwalk XT (Noldus) poloautomatickým způsobem. Běh pro každou myš se skládá ze 3 pokusů konzistentního pohybu napříč monitorovanou platformou. Jsou přijímány pouze konzistentní testy a myši mohou trvat až 10 pokusů, aby dokončily 3 vyhovující testy v obou směrech přes chodbu. Vyhovující zkoušky byly definovány jako ty s pohybem po platformě kratším než 5 s a s ne více než 60% změnou rychlosti. Po umístění na platformu myši obvykle běhaly tam a zpět, aniž by potřebovaly pobízení experimentátora.

Vertikální pól

Myši se umístí na vrchol 80 cm vysokého šroubu s nosem směřujícím dolů a zadními tlapkami co nejblíže k vrcholu. Myši jsou okamžitě vypuštěny a čas začíná okamžitě po umístění.

Čas se zastaví, když se první přední tlapa dotkne povrchu pod tyčí. Přirozenou predilekcí myši je okamžitě slézt po tyči dolů a na překročení tyče jim je dáno až 60 s, jinak je jim pomoci tyč sestoupit. Nedokončenému pokusu je automaticky přidělen čas 30 s, protože 95 procent myší, které neklesly do 30 s, bylo stále na tyči na značce 60 s. Behaviorální testy SHIRPA provedla University of California, Los Angeles Behavioral Core na P30

a P400. Všechny parametry jsou skórovány pro poskytnutí kvantitativního hodnocení. což umožňuje srovnání výsledků jak v čase, tak mezi různými laboratořemi. Každá myš byla postupně testována napříč všemi chováními v časovém rozpětí ~20-min, než se přesunula na další myš. Experimentátor byl zaslepený vůči zvířecímu genotypu. Screening byl proveden tak, jak bylo popsáno dříve (Rogers et al. 1997).

Behaviorální pozorování

Primární obrazovka poskytuje profil pozorování chování a hodnocení každého zvířete začíná pozorováním nerušeného chování v pozorovací nádobě (průměr 10 cm) po dobu 5 minut. Kromě skórovaného chování polohy těla, spontánní aktivity, frekvence dýchání a třesu pozorovatel zaznamenává všechny případy bizarního nebo stereotypního chování a křečí, nutkavého olizování, sebedestruktivního kousání a retropulze (chůze pozpátku) a náznaky prostorových dezorientace.

Chování v aréně

Poté se myš přenese do arény (30 cm x 50 cm) pro testování vzrušení z přenosu a pozorování normálního chování. Aréna je označena do mřížky čtverců 10 x 10 cm² pro měření lokomotorické aktivity během 30 sekund. Zatímco je myš aktivní v aréně, zaznamenávají se měření úlekové reakce, chůze, zvednutí pánve a zvednutí ocasu.

Zádrž na zádech

Zvíře je zadrženo v poloze na zádech, aby se zaznamenalo autonomní chování. Během tohoto hodnocení byla hodnocena síla úchopu, tělesný tonus, pinna reflex, rohovkový reflex, sevření prstu, drátový manévr a srdeční frekvence.

Rovnováha a orientace

Nakonec bylo provedeno několik měření funkce vestibulárního systému. Byly provedeny testy vzpřimovacího reflexu, kontaktního vzpřimovacího reflexu a negativní geotaxe. Během tohoto postupu byly zaznamenávány vokalizace, močení a celkový strach, podrážděnost nebo agresivita.

Použité vybavení

1.Aréna z čirého plexiskla (přibližné vnitřní rozměry 55x33 x18 cm). Na podlaze arény je list z plexiskla označený 15 čtverci (11 cm). Přes pravý zadní roh je upevněn pevný vodorovný drát (průměr 3 mm) tak, aby se zvířata během manévru s drátem nemohla dotýkat stran. Po celé šířce krabice je zajištěna mřížka (40x20 cm) s oky o velikosti 12 mm (přibližně) pro měření odpružení ocasu a síly úchopu. 2. Jako průhledná nádoba byl použit čirý válec z plexiskla (15 x 11 cm). 3. Jedno mřížkové dno (40x 20 cm) s 12mm oky, na kterých stojí sklenice.4. Čtyři válcové podpěry z nerezové oceli (3 cm délka x 2,5 cm průměr) pro zvednutí roštů z lavice. 5. Jedna čtvercová (13 cm) nerezová deska pro přesun zvířat do arény. 6. Uřízněte délky 3/0 Mersilk drženého v kleštích pro testy rohovkového a ušního reflexu 7. Plastová hmoždinka byla nabroušena na špičku tužky, aby se otestovalo slinění a kousání.8. Pár pitevních kleští, zakřivených s jemnými hroty (kleště 125 mm, Philip Harris Scientific, kat. č. D46-174), pro skřípnutí prstů na noze. 9.A stopky.10. K testování úlekových reakcí se používá IHR Click box. Click Box generuje krátký tón 20 kHz při 90 dB SPL, když je držen 30 cm nad myší. Kontaktujte prof. KP Steela, MRC Institute of Hearing Research, University Park, Nottingham NG7 2RD. 11.Pravítko.12.30 cm čirá plexi trubice s vnitřním průměrem 2,5 cm pro kontaktní vzpřimovací reflex.4.5 Elektrofyziologie Příprava akutního cerebelárního řezu Roztomilé parasagitální řezy o tloušťce 300 μm byly připraveny z mozečku experimentálních a kontrolních myší ze stejného vrhu pomocí následujících publikovaných metod (Hansen et al., 2013). Stručně řečeno, mozeček byl rychle odstraněn a ponořen do ledově chladného extracelulárního roztoku se složením (mM): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 glukóza, 2,5 KCl, 2,5 CaCla, 1,3 MgCla a 1 NaHzPOa, pH 7,4, když zplynováno 5 procenty CO-/95 procenty O2. Cerebella byla parasagitálně nařezána pomocí vibratomu (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, Německo) a zpočátku inkubována při 35 stupních po dobu-30 min a poté ekvilibrována a skladována při pokojové teplotě až do použití. Extracelulární elektrofyziologie Extracelulární a intracelulární záznamy byly získány z Purkyňových neuronů (PN) v řezech neustále perfundovaných extracelulárním roztokem s bublinkami karbogenu a udržovaných buď při 37 stupních C (extracelulární) nebo 32 stupních (intracelulární) ± 1 stupeň (viz výše). Buňky byly vizualizovány optikou DIC a objektivem 40x ponořeným do vody (NA 0,75) za použití mikroskopu Zeiss Examiner. Skleněné pipety s odporem ~3 MQ (Model P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) byly naplněny extracelulárním roztokem a umístěny blízko PN axonových pahorků, aby bylo možné měřit kapacitní proudové přechody spojené s akčním potenciálem v režimu napěťové svorky s potenciálem pipety udržovaným na 0 mV. Pro celobuněčné záznamy patch-clamp byly pipety naplněny intracelulárním roztokem (mM): 140 měsíců (CH3K03S), 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,2 CaClz, 10 HEPES, 14 Fosfokreatin (tris sůl), 1 EGTA, 4 Mg -ATP,0,4 Na-GTP.100 uM pikrotoxin (Sigma) byl přidán k blokování inhibičních GABAegerických synaptických vstupů. Data byla získána pomocí

zesilovač MultiClamp 700B při 20 nebo 100 kHz v režimu napěťové nebo proudové svorky, Digidata 1440 s pClamp10 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a filtrovaný při 2 až 4 kHz. Sériový odpor byl obvykle mezi 10 a 15 MQ. Sériový odpor byl kompenzován na 80 procent pouze pro krátkodobé experimenty plasticity. Pro extracelulární záznamy bylo zaznamenáno celkem 20 až 45 PN pro každé zvíře napříč všemi genotypy, pohlavími a věkovými skupinami. Záznamy byly distribuovány přes mediálně-laterální i rostrokaudální osu mozečku. Byly zkoumány pouze buňky se "zdravým" vzhledem (nízký kontrast buněčných hranic) a pravidelnou, nepřerušovanou rychlostí vypalování. Během analýzy bylo zjištěno, že několik buněk má mezery ve vypalování delší než 2 sekundy, a tyto buňky byly z analýzy vyřazeny, protože tento typ vypalování je spojen s tím, že je „nezdravý“. Dvojitá mutantní tkáň se kvalitativně nelišila Objevily se pod DIC mikroskopií před záznamy, ani nebyl počet "nezdravých" buněk větší než u jiných genotypů (7 procent vs. 4 až 11 procent všech buněk v kontrolních genotypech při P400). Prostorové srovnání neurální aktivity bylo získáno záznamem ze sériových řezů vločkových, laterálních (2"d nebo 3'), středních (6" nebo 7.) a mediálních (11" nebo 12t) řezů. Byly použity řezy s nižším počtem mladší věkové skupiny (P45 a 110), aby zhruba odpovídalo relativnímu umístění záznamů napříč věkovými skupinami. 0-3 záznamy byly pořízeny z každého lalůčku v každém řezu v závislosti na kvalitě a zdraví tkáně. Každý záznam trval {{29} Pro každou věkovou skupinu bylo použito 3 až 5 myší a experimentátor byl zaslepen na genotyp, věk a pohlaví.

Intracelulární záznamy byly získány z PN buď v lalůčku IIl nebo VIl mediálního cerebellum (tj. vermis); mezi laloky nebyly pozorovány žádné statistické rozdíly ve vlastnostech.

Analýzy

Interstimulační intervaly spontánního akčního potenciálu byly detekovány a analyzovány pomocí standardních a vlastních rutin v ClampFit (Molecular Device), GoPro (Wavemetrics) a Excel (Microsoft). Konkrétně byly detekovány prahové hodnoty akčního potenciálu a pomocí přizpůsobených programů (TaroTools; https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/) byly stanoveny statistiky špiček (tj. frekvence a délka intervalu). Variační koeficient středního intervalu mezi špičkami (CV) a středního intervalu mezi špičkami (CV2=2 ISIn plus 1-ISInl/(ISIn plus 1 plus ISIn)) byly vypočteny v Excelu pomocí vlastní makra. Standardní vlastnosti membrány byly analyzovány pomocí lgorPro. RM byla stanovena zprůměrováním 3 odezev napěťové stopy na -5 mV krokový impuls z -80 mV udržovacího potenciálu a měřením výsledné odchylky proudu mezi 900 a 1000 ms po začátku. Membránová časová konstanta byla měřena přizpůsobením jedné exponenciály počáteční fázi rozpadu od 90 procent do 10 procent píku. CM byla vypočtena dělením membránové časové konstanty RM. sEPSC události byly zaznamenávány během 1-minutové epochy a detekovány a měřeny pomocí Neuroexpress (v21.1.13). Paralelní a stoupající vláknové axony byly stimulovány pomocí skleněných theta elektrod (WPI) a TTL řízeného stimulačního izolátoru (ISO-Flex, AMPI). Vyvolané amplitudy EPSC a konstanty doby rozpadu (1 ex. pro paralelní a 2 exp. pro šplhající vlákna) byly analyzovány pomocí uživatelských rutin v lgorPro. Akční potenciály byly zkoumány jako součást sady 1 s proudových injekcí mezi -500 a 2250 pA (250 pA kroky) s přídržným proudem nastaveným tak, aby byl zachován potenciál ~70 mV. Průběhy akčního potenciálu byly měřeny pomocí custom

rutiny v lgorPro. Práh akčního potenciálu byl definován jako první membránové napětí, při kterém první derivace přesáhla 30 mV/ms (Zhu et al.2006).

4.6 Vyšetření cerebelární atrofie

Velikost mozečku Bezprostředně po odstranění mozku z lebky byl získán dorzální snímek celého těla. Snímky byly poté zpracovány pomocí Fidži (NIH). Velikosti předního mozku a mozečku byly stanoveny nastíněním jejich 2-rozměrného prostoru a následným výpočtem oblasti. Normalizovali jsme možné rozdíly v celkové velikosti mozku vydělením výsledků mozečku velikostí předního mozku, abychom vytvořili relativní poměr mozečku k přednímu mozku. Experimentátoři byli slepí ke genotypu zvířete. Imunohistochemie V příslušných koncových bodech studie (P45, 120,210,4{{7{{1{108}}4}}}}0), samci a samice myší všech genotypů zastoupená v této studii byla anestetizována isofluranem a podstoupila transkardiální perfuzi fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem následovanou 4 procenty (hmotn./obj.) pufrovaným paraformaldehydem (PFA) a poté byla rozřezána, aby se extrahoval mozek. Snímky celého mozku byly pořízeny ihned po vyjmutí mozku z lebky a mozky byly poté ponořeny do 4% PFA na 24 hodin a poté byly kryoprotekovány v Tris-pufrovaném fyziologickém roztoku (TBS) s 0,05% azidem a 30% sacharózou na 72 hodiny a skladujte při 4 stupních až do dalšího použití. Mozeček byl oddělen od předního mozku a parasagitální řezy byly nařezány pomocí posuvného mikrotomu (Microm HM 430, Thermo Scientific) nastaveného na řezy o tloušťce 40 μm. Řezy mozečku byly odebrány v sérii po šesti a uloženy v TBS-AF (TBS s 30 procenty sacharózy, 0,05 procenty azidu sodného a 30 procenty ethylenglykolu) při 4 stupních nebo -20 stupních až do dalšího použití. Pro imunofluorescenční vizualizaci Purkyňových neuronů, cerebellum řezy obou Atm*; Aptx*t a Atm?35×R35×; Aptx^(n=5 na genotyp) byly třikrát promyty po dobu 5 minut v TBS a poté blokovány v 15% normálním kozím séru při pokojové teplotě po dobu 30 minut s následnou volně plovoucí inkubací v králičím nebo myším anti-kalbindinu D -28k (1:1000) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě na orbitální třepačce. Řezy byly poté třikrát promyty po dobu 5 minut TBS, následovala volně plovoucí inkubace v kozím anti-králičím nebo myším Alexa Fluor 488 (1:1000) po dobu 1 hodiny ve tmě při teplotě místnosti na orbitální třepačce. Po sekundární inkubaci protilátky byly řezy třikrát promyty po dobu 5 minut v TBS, poté připevněny a překryty pomocí Fluoromount-G s DAPI. U některých řezů byly protilátky proti štěpené kaspáze-3(1:200) a anti-CD68(1:400) navíc testovány paralelně s Calbindinem pomocí sekundární protilátky Alexa Fluor 647 (1:500). Sklíčka byla naskenována pomocí Stereo Investigator (MBF Bioscience, ver. 2020) na mikroskopu Zeiss vybaveném ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) s použitím objektivu 2,5, 10, 20, 40 nebo 63x a obrázků zachycené kamerou Hamamatsu CMOS (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plus). Abychom kvantifikovali počet buněk reagujících na kalbindin v každém lalůčku ve výsledných snímcích, použili jsme Stereo Investigator k náhodnému nakreslení 2 čar o délce 300 až 500 μm. každý lalůček a ručně spočítali celkový počet PN podél délky v rámci 40 um tloušťky tkáňového řezu při 40násobném zvětšení. Poté byla zjištěna 2D hustota (počet PN/(lineární délka*40 um tloušťka)) dvou vzorků na lalůček. zprůměrovány pro další srovnání mezi lalůčky a zvířaty. Šířky kalbindinu pozitivního PN dendritu byly měřeny na předem definovaném místě v lalůčku VI od každého zvířete v řezech tkání o tloušťce 25 nebo 40 um při 20x zvětšení. Dendritické šířky primárních a sekundárních větví byly měřeny na střední čáře mezi těly PN buněk a okrajem molekulární vrstvy. Bylo naměřeno 7 až 13 dendritů na řez, jeden řez na zvíře. Pro somatická měření PN byl použit Stereo Investigator k náhodnému výběru PN rozmístěných po celém mediálním úseku při 20násobném zvětšení. Průměrná šířka PN na zvíře byla stanovena zprůměrováním výsledků napříč 3 sériovými sekcemi (16 až 37 PN na sekci). Šířky PN byly měřeny kolmo k vrstvě PN nebo k vystupujícímu dendritu, pokud byl nakloněn o více než několik stupňů. Šířky molekulární vrstvy a vrstvy granulárních buněk (vizualizované pomocí barviv Calbindin a DAPI, v tomto pořadí) byly hodnoceny v Stereo Investigator zprůměrováním dvou měření šířky na předem definovaných místech pro každý lalůček, zhruba v polovině podél dlouhého rozsahu každého lalůčku při 2,5násobném zvětšení. CD68 pozitivita v cerebelárních řezech byla kvantifikována měřením celkové procentuální plochy CD68 plus pozitivní barvení napříč celým mediálním cerebelárním řezem. 10x sešité obrázky byly stanoveny jako prahová hodnota pro negativní kontrolu a kvantifikovány pomocí ImageJ, jeden řez na zvíře. Abychom kvantifikovali procento Calbindin-pozitivních PN, které byly pozitivní na štěpenou kaspázu{94}}, spočítali jsme PN v celém mozečku pomocí Stereo Investigator. Byly zkoumány tři sešité obrázky s 20násobným zvětšením na zvíře a výsledky byly zprůměrovány. Prahová hodnota pro pozitivitu kaspázy byla stanovena z kontrolních řezů obarvených pouze sekundárními protilátkami. Pro nefluorescenční histologickou analýzu 25-uměle silné, volně plovoucí tkáňové řezy na pozitivně nabitá sklíčka a přes noc vysušte na vzduchu. Tkáň byla promývána ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) dvakrát po dobu 5 minut, poté byla postupně obarvena 0,1 procenta hematoxylinu v 95 procentech ethanolu po dobu asi 25 sekund a 0,5 procenta eosinu v 95 procentech ethanolu po dobu asi 3 sekund a poté byla promyta dvakrát destilovanou vodou každá skvrna. Tkáň byla následně dehydratována po dobu 1 minuty v 95 procentech ethanolu, 100 procentech ethanolu a 100 procentech xylenu, poté byla překryta krycím sklíčkem Permountem. Sklíčka byla zobrazena pomocí barevné kamery (Q Imaging, MBF Biosciences) na stejném mikroskopu Zeiss a akvizičním softwaru MBF. Experimentátoři byli zaslepeni k myšímu genotypu, ve kterém byly zkoumány řezy, a pořadí vyšetření bylo proloženo pro všechna histologická měření.

4.7 Měření průtokovou cytometrií

Analýza krevních a brzlíkových buněk průtokovou cytometrií byla provedena barvením specifickými anti-myšími protilátkami∶CD4, CD8, CD3, CD44 a CD25. Stručně řečeno, vzorky plné krve (50 μ) byly obarveny pomocí fluorescenčně značených protilátek, poté byly červené krvinky lyžovány pomocí BD lyzačního roztoku, zatímco živé bílé krvinky byly obarveny pomocí barviva viability. Thymi byly mechanicky disociovány. 1 až 2 miliony buněk brzlíku byly podobně obarveny pomocí specifických protilátek pro CD4, CD8, CD44 a CD25. Analýza imunobarvených vzorků bílých krvinek nebo brzlíku byla provedena pomocí FACS ARIA 1 a data byla analyzována pomocí softwaru FlowJo, jak bylo uvedeno dříve (Sanghez et al. 2017).

4.8 Western BIots

Proteinové extrakty (buňky/tkáně) byly homogenizovány v lyzačním pufru pro radioimunoprecipitační test (RIPA) (150 mM NaCl, 1 procento Nonidet P-40 [NP-40],0 0,5 procenta deoxycholátu,0,1 procenta SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) s inhibitory proteázy (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml leupeptinu, 5 ug/ml pepstatinu, 5 ug/ml chymotrypsinu, 10 ug/ml aprotininu). Proteinové extrakty byly sonikovány a poté peletovány centrifugací při 13, 000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut při 4 °C. Pro kvantifikaci koncentrací proteinu byl použit proteinový test BCA. Vzorky obsahující stejná množství proteinu 50 až 100 ug na dráhu byly odděleny pomocí 4 až 12procentního gradientu TGX prefabrikovaných gelů BioRad a poté přeneseny systémem TransBlot Semi-Dry BioRad s použitím Nitrocelulózového přenosového balení. Přenesené bloty byly obarveny barvivem Ponceau S pro stejné nanesení proteinu, poté promyty a blokovány 5% odtučněným sušeným mlékem v TBST po dobu 60 minut při teplotě místnosti. Primární protilátky byly inkubovány za třepání přes noc při 4 stupních. Bloty byly testovány na následující protilátky: ATM (D2E2) králičí mAb buněčná signalizace, v ředění 1:1000, -aktin (D6A8) králičí mAb buněčná signalizace, GAPDH (D16H11) králičí mAb buněčná signalizace následovaná vhodnou křenovou peroxidázou HRP) sekundární anti-králičí, anti-myší po dobu 2 hodin při pokojové teplotě. Po vícenásobném promytí TBST byla exprese proteinu detekována pomocí chemiluminiscenčního substrátu Radiance Plus pomocí zobrazovacích systémů Azure c400 a BioRad ChemiDoc. Denzitometrická analýza ATM byla provedena pomocí ImageJ. Experimenty byly provedeny se 2 technickými a 2-3 biologickými replikáty, jak je uvedeno.

4.9 Statistické hodnocení

Počet zvířat vybraných pro každou skupinu byl založen na a priori analýze síly pomocí GPower v3.1 na základě velikosti 0,5, síly 0,8 a velikosti účinku odhadnuté z předběžných údajů nebo předchozí studie. Použili jsme parametrické (1-a 2-způsob ANOVA) pro normálně rozdělené i neparametrické (Kruskal Wallace) statistické metody pro intervalová data k testování rozdílů mezi skupinami, po nichž následovaly párové vícenásobné srovnávací testy, jak je uvedeno v text. Odlehlé hodnoty pro imunitní data na Obr. 6 a 7 byly vyloučeny pomocí metody ROUT (Q=2 procent). Konkrétní analýzy použité pro každý soubor dat jsou uvedeny v legendě každého obrázku. Pro všechny obrázky: ns nevýznamné,*p Menší nebo rovno 0,05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">