Homozygotní Dab1−// je potenciální novou příčinou autozomálně recesivních vrozených anomálií myší ledvin a močových cest

edmund.chen@wecistanche.com

Úvod

Mutované myši Yotari, získané spontánním získáním mutace v genu Dab1, vykazují histologické abnormality v centrálním nervovém systému [1,2], velmi podobné těm u myší reeler (reelin//), což naznačuje, že reelin a DAB1 patří k stejnou signální dráhu [1–4]. Uvádí se, že aberace v dráze reelin/DAB1 jsou spojeny s různými psychiatrickými poruchami [5–7]. Je zajímavé, že kromě centrálního nervového systému byla přítomnost DAB1 a reelinových proteinů potvrzena také v periferním nervovém systému a některých extraneurálních tkáních. Přítomnost DAB1 byla nalezena v myších podocytech [8] a lidském ploduledviny[9], zatímco exprese reelinu byla popsána během vývoje myšího a lidského plodu, stejně jako v některých endoteliálních buňkách podél krevních cév u dospělých myší [9–11]. Kanonická dráha reelin/DAB1 může spouštět odlišné downstream proteiny, včetně receptorů NOTCH2, které hrají kritickou roli při rozhodování o buněčném osudu a diferenciaci běhemledvinavývoj [12–14]. K vytvoření proximálních tubulů a podocytů jsou nutné receptory NOTCH2 [13], ale jakmile je dosaženo zrání nefronu, je tato cesta většinou umlčena [15]. V podmínkách akutníchonemocnění ledvin,zvýšená exprese NOTCH2 může potenciálně přispívat k regeneraci, zatímco trvalá exprese je kauzálně spojena s intersticiální fibrózou a glomerulosklerózou [15]. Downregulace signalizace NOTCH může výrazně snížit autofagii a způsobit poruchu diferenciace podocytů během vývoje [16].

V důsledku toho hrají dysfunkční podocyty klíčovou roli u glomerulárních onemocnění, zejména u lidského idiopatického nefrotického syndromu [17,18] a u nefrotického syndromu s minimálními změnami (MCNS) [19]. Autofagie tedy udržuje buněčnou homeostázu za normálních fyziologických podmínek, zatímco za patologických podmínek může přejít v autofagickou smrt [20]. Široce používaným autofagickým biomarkerem je LC3B, strukturální protein autofagozomálních membrán [21]. Komplexní přeslech mezi autofagií a apoptózou také přispívá k udržení homeostatické rovnováhy jako reakce na buněčné mikroprostředí. Je dobře známo, že počet apoptotických příhod v průběhu narůstáledvinavývoj [22] a značně se zmenší, jakmile dozrávání skončí, s výjimkou podmínekpoškození ledvin[23]. Apoptóza je nepopiratelně komplexní mechanismus regulovaný souhrou několika drah, ale většinou končí aktivací kaspázy3 (CASP3), jejíž aktivace je jedním z nejčastěji používaných markerů pro detekci apoptózy [23].

V této zprávě jsme se zaměřili na analýzu toho, jak funkční umlčování genu Dab1 ovlivňujeledvinamorfologie a exprese a lokalizace proteinů reelin, NOTCH2, LC3B a štěpených CASP3 u postnatálních myšíledviny. Předpokládáme, že tyto proteiny jsou exprimovány u postnatálních myšíledvina,a jejich funkční souhra přispívá k udržení jejich struktury a funkce. Navíc, protože přítomnost DAB1 byla potvrzena během lidského ploduledvinavývoji [9], lze předpokládat, že jeho inaktivace může způsobit poruchu širokého spektra vrozených anomáliíledvinaa močových cest (CAKUT).

klíčová slova:yotari; funkce ledvin; postnatální vývoj ledvin; imunofluorescenční barvení; transmisní elektronová mikroskopie

CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCI LEDVIN/RENÁL

Materiály a metody

Kolekce vzorkůJako konvenční mutanty bez Dab1 jsme použili myši yotari (Dab1/), které dříve popsal Howell et al. [24]. PCR primery použité pro genotypizaci myší byly yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT a CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, divoký typ lokusu Dab1: GCCCTTCAGCATCACCATGCT a CCTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. Myši C57BL/6 N byly chovány a umístěny ve skupinách ve standardních polykarbonátových klecích (včetně alespoň jednoho z každého genotypu) s ad libitním přístupem k potravě a vodě v místnosti s řízenou teplotou (23 ± 2 ◦C) s 12 hodinovým světlem/ temný cyklus. V postnatálních dnech 4, 11 a 14 (P4, P11 a P14) byly myši hluboce anestetizovány pentobarbitalem a transkardiálně perfundovány po dobu 10 minuty fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (PBS, pH 7,2) a 4% paraformaldehydem (PFA ) v 0,1 M PBS.Ledvinybyly odstraněny a fixovány 4 procenty PFA v 0.1 M PBS přes noc pro konvenční histologické analýzy (hematoxylin–eozin (H&E), imunohistochemické a imunofluorescenční barvení) a ve směsi 2 procent PFA plus 2,5 procenta glutaraldehydu (GA) pro vyšetření elektronovým mikroskopem. Po fixaci byla tkáň připravena k dalšímu histologickému vyšetření, jak jsme popsali dříve [25,26].

Imunoflfluorescence a imunoperoxidázové barveníPo deparafinizaci a rehydrataci byly řezy zahřívány 20 min v 0,01 M citrátovém pufru (pH 6,0) ve vodním parním hrnci a poté ochlazeny na pokojovou teplotu. Blokovací pufr (ab 64226, Abcam, Cambridge, UK) byl aplikován po dobu 30 minut, aby se vyloučilo nespecifické barvení. Řezy byly poté přes noc inkubovány ve vlhké komoře s primárními protilátkami (tabulka 1). Po promytí v PBS byly na jednu hodinu aplikovány sekundární protilátky (tabulka 1) a znovu promyty v PBS. Poté byla jádra obarvena 4060 -diamidino-2-fenylindolem (DAPI) po dobu 2 minut, promyta v PBS a překryta krycím sklíčkem. Preadsorpční test jsme provedli tak, že každá primární protilátka byla použita s odpovídajícím peptidem a jejich kombinace byla aplikována na řezy. Výsledky neukázaly žádné barvení protilátek. Kromě toho byly provedeny kontroly s vynecháním primární protilátky pro stanovení hladin nespecifické vazby sekundárních protilátek.

Pro imunoperoxidázové barvení byla jako primární protilátka aplikována králičí polyklonální anti-CASP3 (1:100 ředění, ab13847, Abcam, Cambridge, UK) po dobu jedné hodiny ve vlhké komoře po ošetření řezu 0,1 procenta H2O2. Po promytí v PBS byla provedena sekundární detekce za použití spojky a streptavidin peroxidázy, každá po dobu 15 minut (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) a diaminobenzidinu (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), pečlivě kontrolované barvení, aby se zabránilo přebarvení pozadí. Jádra byla obarvena hematoxylinem, opláchnuta ve vodě z vodovodu po dobu 10 minut, krátce dehydratována ve vzestupné sérii ethanolových roztoků a překryta krycím sklíčkem.

Příprava tkáně pro transmisní elektronový mikroskop (TEM)Po fixaci směsí 2 procent PFA a 2,5 procenta GA v 0,1 M PBS po dobu 2 hodin byly vzorky promyty PBS a následně fixovány ve vodném roztoku 2 procenta oxidu osmičelého po dobu 2 hodin. Všechny vzorky byly dvakrát promyty v PBS, dehydratovány ve stoupajícím stupni ethanolu a uloženy v Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, UK). Sériové řezy (tloušťka 70 nm) byly nařezány na ultramikrotomu Ultracut UCT (Leica Microsystems, Wetzlar, Německo) a obarveny 1 procentem uranylacetátu a citrátu olovnatého.

Získávání a analýza datAnalýza byla provedena epiflfluorescenčním mikroskopem (Olympus BX51, Tokio, Japonsko) vybaveným digitálním fotoaparátem DP71 (Olympus), transmisním elektronovým mikroskopem JEM 1400 (JEOL, Tokio, Japonsko) provozovaným při 80 kV a fotografovaným s nábojem JEOL- kamerový systém s propojeným zařízením (CCD) (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA, USA) a konečně mikroskop s jasným fifieldem (BX40, Olympus, Tokio, Japonsko). Všechny analyzované obrázky byly zpracovány softwarem ImageJ a Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, USA). Na zkoumanou skupinu jsme použili tři až čtyři zvířata. Všechny shromážděnyledvinybyly nařezány na řezy o tloušťce 5 um a maximálněledvina length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, což znamená vynikající shodu [27].

Statistická analýzaByl proveden dvoustranný t-test pro analýzu rozdílů v průměrném průměru mezi PCT, DCT a G zvířat divokého typu a zvířat yotari. Průměr byl prezentován jako průměr ± standardní odchylka (SD). Úroveň významnosti byla nastavena na p < 0.05.="" ke="" zkoumání="" rozdílů="" v="" procentu="" pozitivních="" buněk="" mezi="" pct,="" dct="" a="" glomeruly="" ve="" všech="" časových="" bodech="" byl="" použit="" dvoucestný="" test="" anova="" následovaný="" tukeyho="" testem="" vícenásobného="" srovnání.="" procento="" pozitivních="" buněk="" bylo="" vyjádřeno="" jako="" průměr="" ±="" standardní="" chyba="" průměru="" (sem).="" hladina="" významnosti="" byla="" stanovena="" na="" p="">< 0,05.="" analýza="" byla="" provedena="" v="" softwaru="" graphpad="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">

Výsledek

Barvení hematoxylin-eosinem (H&E) a měření průměru ledvinH&E barvení středních sagitálních řezůledvinyve všech zkoumaných časových bodech zdůrazňuje maléledvinafenotyp myší yotari ve srovnání s divokým typem (obrázek 1a). Při 4P průměrledvinaprůměr zvířat yotari byl kolem 55 um než kolem 75 um. Kromě toho byl tento rozdíl patrný v pozdějších časových bodech kvůli pomalejšímu růstuledvinyv yotari ve srovnání s progresivním růstemledvinyu zvířat divokého typu. Chcete-li zjistit, zda snížení celkověledvinavelikost byla způsobena zmenšením velikosti segmentu nefronu, průměr PCT, DCT a G na skupinu jsme zprůměrovali. Ve skutečnosti došlo ke snížení středního průměru G, PCT a DCT ve skupině s yotari ve srovnání s divokým typem (obrázek 1b, p < 0,05).="" navíc="" barvení="" h&e="" odhalilo="" tenčí="" kůru="">ledvinovéextenze pánve u zvířat yotari a mírně difuzně dilatovaná DCT ve 14P. Základní struktura a vzorec glomerulárního zrání jsou u obou zkoumaných skupin zvířat stejné.

Popisná histologická analýza založená na mikrofotografiích TEMNa mikrofotografiích získané pomocí TEM, glomeruly myší divokého typu vykazovaly typický vzhled všech částí fifiltrační bariéry, které byly normálně vyvinuté a rozpoznatelné (obrázek 2a). Podocyty, výběžky a pedikly podocytů, fifiltrační štěrbiny, glomerulární bazální membrány a kapilární lumen s fenestrovaným endotelem byly snadno rozlišitelné (obrázek 2a). Na druhé straně v glomerulech myší yotari bylo možné pozorovat progresivní poškození podocytů s vymýváním výběžků chodidla a chybějícími fifiltračními štěrbinami (obrázek 2b–d). Tyto ultrastrukturální změny byly pozorovány u všechledvinyvyšetřili a zapojili většinu vyšetřovaných glomerulů. U PCT nebo DCT myší yotari nebyly zaznamenány žádné abnormality než u zvířat divokého typu (obrázek 2e–h). V PCT byla buněčná rozhraní definována špatně kvůli nepravidelnosti buněčných membrán a vzájemnému propojení buněk s jejich sousedy. Cytoplazma byla bohatá, obsahovala dobře odlišitelná jádra, prodloužené mitochondrie, bazální infoldings a mnoho tubulárních jamek mezi mikroklky, které tvořily kartáčový lem na apikální membráně. Vyšší zvětšení odhalilo apikální povrch PCT epiteliálních buněk obsahujících dlouhé mikroklky, které tvoří kartáčový lem a těsné spoje mezi luminálními buněčnými hranicemi sousedních tubulárních epiteliálních buněk (obrázek 2e, f). Na druhé straně apikální povrch DCT epiteliálních buněk obsahoval několik krátkých mikroklků a četné vezikuly (obrázek 2g,h).

Obrázek 2. Mikrofotografie divokého typu a yotari z transmisního elektronového mikroskopu (TEM).ledviny.Glomeruli zvířat divokého typu (a) vykazovaly normálně vyvinutou fifiltrační bariéru s fenestrovaným endotelem (E) kapiláry (C), bazální membránou (BM), podocyty (P) s pedikly (PE) a fifiltračními štěrbinami (FS ). Vledvinyu zvířat yotari bylo možné zaznamenat vymazání pediklů a nedostatek fifiltračních štěrbin (hvězdičky, b–d). Nebyly zaznamenány žádné abnormality v proximálních stočených tubulech (PCT) nebo distálních stočených tubulech (DCT) myší yotari ve srovnání se zvířaty divokého typu (e–h). V PCT byla cytoplazma hojná, obsahovala dobře odlišená jádra (N), prodloužené mitochondrie (M), bazální infolding (BI) a mnoho tubulárních jamek (TP) mezi mikroklky, které tvořily kartáčový lem (BB) v místě apikální membrána (e,f). Vyšší zvětšení odhalilo apikální povrch PCT epiteliálních buněk obsahujících dlouhé mikroklky, které tvoří kartáčový lem a těsné spoje (TJ) mezi luminálními buněčnými hranicemi sousedních tubulárních epiteliálních buněk (e, f). Na druhé straně apikální povrch DCT epiteliálních buněk obsahující několik krátkých mikroklků a četné vezikuly (g,h). Měřítko na obrázcích (a–d) a vložkách (e–h) je 1 µm; měřítko na obrázcích (e–h) je 2 µm.

Lokalizace a kolokalizace Reelin a DAB1Reelin byl slabě exprimován s mírnou až střední reaktivitou (tabulka 2) v glomerulech a DCT všech zkoumaných zvířat ve všech pozorovaných časových bodech (p < 0.05,="" obrázek="" 3a).="" pouze="" u="" pct="" myší="" yotari="" bylo="" procento="" pozitivních="" buněk="" významně="" vyšší="" než="" u="" zvířat="" divokého="" typu="" (p="">< 0,05,="" obrázek="" 3a).="" v="" glomerulárních="" buňkách="" byla="" lokalizace="" barvení="" perinukleární,="" zatímco="" v="" pct="" a="" dct="" byla="" rozptýlena="" po="" celé="" cytoplazmě="" (obrázek="">

obrázek 4. Imunofluorescenční barvení postnatálních yotariledvinys reelinovým markerem (a) a dvojitým imunofluorescenčním barvením postnatálního divokého typuledvinys DAB1 a reelinovými markery (b). (a,b) Barvení DAPI jaderné DNA se spojilo s DAB1 a paralelně se ukazuje reelinová imunofluorescence (sloučení). Pozorované časové body byly P4, P11, P14. Exprese vyšetřovaných markerů v glomerulech (G), proximálních stočených tubulech (PCT) a distálních stočených tubulech (DCT) je označena šipkami, zatímco hvězdičky označují expresi reelinu v extracelulární matrix (a). Vložky zobrazují nejvýraznější výraz na obrázku. Jaderné barvení DAPI odhalilo špatnou kolokalizaci DAB1 a reelinu, většinou v DCT (šipka). Měřítko je 20 µm a vztahuje se na všechny obrázky.

Nebyla téměř žádná imunitní reaktivita DAB1 v glomerulech a PCT zvířat divokého typu v P4, zatímco procento pozitivních buněk s mírnou reaktivitou (tabulka 2) významně vzrostlo v P11 a P14 (p < 0,05,="" obrázek="" 3b).="" v="" dct="" byl="" dab1="" exprimován="" většinou="" v="" apikálních="" a="" laterálních="" částech="" buněčných="" membrán="" (obrázek="" 4b)="" se="" silnou="" reaktivitou="" (tabulka="" 2).="" procento="" pozitivních="" buněk="" bylo="" významně="" vyšší="" než="" u="" předchozích="" struktur,="" kolem="" 60="" procent="" (obrázek="" 3b),="" zejména="" v="" macula="" densa="" (obrázek="" 4b).="" nedošlo="" téměř="" k="" žádné="" kolokalizaci="" dab1="" a="" reelinu="" kromě="" dct="" zvířat="" divokého="" typu="" v="" p14="" (šipka,="" obrázek="" 4b).="" biomolecules="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" of="" 14="" obrázek="" 4.="" imunofluorescenční="" barvení="" postnatálních="">ledvinys reelinovým markerem (a) a dvojitým imunofluorescenčním barvením postnatálního divokého typuledvinys DAB1 a reelinovými markery (b). (a,b) Barvení DAPI jaderné DNA se spojilo s DAB1 a paralelně je zobrazena reelinová imunofluorescence (sloučení). Pozorované časové body byly P4, P11, P14. Exprese vyšetřovaných markerů v glomerulech (G), proximálních stočených tubulech (PCT) a distálních stočených tubulech (DCT) je označena šipkami, zatímco hvězdičky označují expresi reelinu v extracelulární matrix (a). Vložky zobrazují nejvýraznější výraz na obrázku. Jaderné barvení DAPI odhalilo špatnou kolokalizaci DAB1 a reelinu, většinou v DCT (šipka). Měřítko je 20 µm a vztahuje se na všechny obrázky. Nebyla téměř žádná imunitní reaktivita DAB1 v glomerulech a PCT zvířat divokého typu v P4, zatímco procento pozitivních buněk s mírnou reaktivitou (tabulka 2) významně vzrostlo v P11 a P14 (p < 0,05,="" obrázek="" 3b).="" v="" dct="" byl="" dab1="" exprimován="" většinou="" v="" apikálních="" a="" laterálních="" částech="" buněčných="" membrán="" (obrázek="" 4b)="" se="" silnou="" reaktivitou="" (tabulka="" 2).="" procento="" pozitivních="" buněk="" bylo="" výrazně="" vyšší="" než="" u="" předchozích="" struktur,="" kolem="" 60="" procent="" (obrázek="" 3b),="" zejména="" v="" macula="" densa="" (obrázek="" 4b).="" nedošlo="" téměř="" k="" žádné="" kolokalizaci="" dab1="" a="" reelinu="" kromě="" dct="" zvířat="" divokého="" typu="" v="" p14="" (šipka,="" obrázek="">

Prostorové a časové výrazové vzory NOTCH2 a LC3BProcento NOTCH{{0}}pozitivních buněk bylo méně než 20 procenta v glomerulech obou zvířecích genotypů ve všech pozorovaných časových bodech. Pouze při P14 bylo procento pozitivních buněk významně vyšší v glomerulech zvířat yotari než zvířat divokého typu (p < 0,05,="" obrázek="" 3c).="" intenzita="" barvení="" byla="" mírná="" až="" střední="" (tabulka="" 2),="" většinou="" lokalizována="" perinukleárně="" (obrázek="" 5a–f).="" v="" pct="" a="" dct="" obou="" zvířecích="" genotypů="" se="" procento="" pozitivních="" buněk="" v="" průběhu="" času="" zvyšovalo.="" v="" p14="" bylo="" procento="" pozitivních="" buněk="" významně="" vyšší="" u="" pct="" a="" dct="" zvířat="" yotari="" než="" pct="" a="" dct="" zvířat="" divokého="" typu="" (p="">< 0,05,="" obrázek="" 3c).="" intenzita="" signálu="" ve="" všech="" pozorovaných="" časových="" bodech="" byla="" mírná="" až="" střední="" (tabulka="" 2)="" a="" rozptýlená="" po="" celé="" cytoplazmě="" (obrázek="" 5a–f).="" obrázek="" 5.="" imunofluorescenční="" barvení="" postnatálního="" divokého="" typu="" a="">ledvinys markery NOTCH2 a LC3B a imunoperoxidázové barvení markerem štěpené kaspázy3 (CASP3). (a–f) Barvení DAPI jaderné DNA je sloučeno s NOTCH2 a LC3B. Pozorované časové body byly P4, P11, P14. Exprese markerů NOTCH2 a LC3B v glomerulech (G), proximálních stočených tubulech (PCT) a distálních stočených tubulech (DCT) je označena šipkami. Zvláště silnou LC3B reaktivitu lze pozorovat v Bowmanově pouzdru rozkládajících se glomerulů (hvězdička, e). Vložky zobrazují nejvýraznější výraz na obrázku. CASP3 byl slabě exprimován ve všech pozorovaných časových bodech. Jediná významná exprese byla v glomerulech myší yotari na P14 (šipky). Měřítko je 20 µm a vztahuje se na všechny obrázky. Biomolekuly 2021, 11, 609 9 z 14 3.4. Prostorové a časové vzorce exprese NOTCH2 a LC3B Procento NOTCH2-pozitivních buněk bylo méně než 20 procent v glomerulech obou zvířecích genotypů ve všech pozorovaných časových bodech. Pouze při P14 bylo procento pozitivních buněk významně vyšší v glomerulech zvířat yotari než zvířat divokého typu (p < 0,05,="" obrázek="" 3c).="" intenzita="" barvení="" byla="" mírná="" až="" střední="" (tabulka="" 2),="" většinou="" lokalizována="" perinukleárně="" (obrázek="" 5a–f).="" v="" pct="" a="" dct="" obou="" zvířecích="" genotypů="" se="" procento="" pozitivních="" buněk="" v="" průběhu="" času="" zvyšovalo.="" v="" p14="" bylo="" procento="" pozitivních="" buněk="" významně="" vyšší="" u="" pct="" a="" dct="" zvířat="" yotari="" než="" pct="" a="" dct="" zvířat="" divokého="" typu="" (p="">< 0,05,="" obrázek="" 3c).="" intenzita="" signálu="" ve="" všech="" pozorovaných="" časových="" bodech="" byla="" mírná="" až="" střední="" (tabulka="" 2)="" a="" rozptýlená="" po="" celé="" cytoplazmě="" (obrázek="">

Obrázek 5. Imunofluorescenční barvení postnatálního divokého typu a yotariledvinys markery NOTCH2 a LC3B a imunoperoxidázové barvení markerem štěpené kaspázy3 (CASP3). (a–f) Barvení DAPI jaderné DNA je sloučeno s NOTCH2 a LC3B. Pozorované časové body byly P4, P11, P14. Exprese markerů NOTCH2 a LC3B v glomerulech (G), proximálních stočených tubulech (PCT) a distálních stočených tubulech (DCT) je označena šipkami. Zvláště silnou LC3B reaktivitu lze pozorovat v Bowmanově pouzdru rozkládajících se glomerulů (hvězdička, e). Vložky zobrazují nejvýraznější výraz na obrázku. CASP3 byl slabě exprimován ve všech pozorovaných časových bodech. Jediná významná exprese byla v glomerulech myší yotari na P14 (šipky). Měřítko je 20 µm a vztahuje se na všechny obrázky.

V glomerulech a DCT obou zvířecích genotypů se procento LC3B-pozitivních buněk v průběhu času zvyšovalo (p < 0.05,="" obrázek="" 3d).="" v="" p11="" a="" p14="" bylo="" procento="" pozitivních="" buněk="" významně="" vyšší="" v="" glomerulech="" zvířat="" yotari="" než="" v="" glomerulech="" zvířat="" divokého="" typu="" (p="">< 0,05,="" obrázek="" 3d).="" v="" glomerulech="" zvířat="" yotari="" byla="" intenzita="" barvení="" většinou="" střední="" až="" silná="" (tabulka="" 2)="" lokalizovaná="" v="" perinukleárním="" a="" jaderném="" prostoru="" (obrázek="" 5a–f),="" ve="" všech="" sledovaných="" časových="" bodech,="" zatímco="" v="" glomerulech="" myší="" divokého="" typu="" byla="" intenzita="" většinou="" střední="" (tabulka="" 2).="" pct="" zvířat="" yotari="" a="" zvířat="" divokého="" typu="" obsahovala="" přibližně="" 20="" procent="" pozitivních="" buněk="" ve="" všech="" pozorovaných="" časových="" bodech="" (p="">< 0,05,="" obrázek="">

Odštěpený výraz CASP-3V souboru nebyl téměř žádný výraz aktivovaného CASP-3ledvinyzvířat divokého typu ve všech sledovaných časových bodech. V PCT a DCT myší yotari bylo několik jednotlivých buněk CASP-3-pozitivních (obrázek 3e). Pouze v glomerulech ledvin yotari na P14 (obrázek 5e) se procento pozitivních buněk významně zvýšilo ve srovnání sledvinymyší divokého typu (p < 0,05, obrázek 3e).

Diskuse

ledvinymorfogeneze a vývoj jsou složité procesy přesně koordinované souhrou velkého počtu genů. Vrozené anomálieledvinaa močové cesty (CAKUT) jsou nejčastější vrozenou vadou, která tvoří 23 procent všech takových vad a představuje hlavní příčinu konečného stadianemoc ledvinu dětí [28,29]. Poruchy jednoho genu mohou být primárním zdrojem CAKUT a až dosud byla jako příčina CAKUT identifikována mutace ve více než 20 genech [30]. Jak naše předchozí práce ukázala skvělou expresi DAB1 během normálního lidského ploduledvina[9] jsme předpokládali, že DAB1 by mohl hrát významnou roli u savcůledvinarozvoj. Abychom potvrdili naši hypotézu, prozkoumali jsmeledvinamorfologie a vzorce exprese reelin, NOTCH2, LC3B a aktivovaných CASP3 proteinů u Dab1 knockout myší.

CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESTI LEDVIN/RENÁL

Řezání myší yotariledvinyodhalil tenčí kůru a výrazně menší průměrledvinaa průměry PCT, DCT a G ve srovnání se zvířaty divokého typu. Pokles vledvinavelikost způsobená nedostatečným vybavením nefronů je známá jakoledvinovéhypoplazie, jedné z nejčastějších poruch CAKUT, která predisponuje hypertenzi a chronické onemocnění ledvin v dospělosti [31]. Kromě toho mikrofotografie zachycené pomocí TEM odhalily, že myši yotari vykazovaly výrazné poškození podocytů se smazáním výběžků chodidla a chybějícími fifiltračními štěrbinami. Po poranění podocyty procházejí procesem efacementu, při kterém ztrácejí svou strukturu, což vede ke snížení jejich fifiltrační bariérové ​​funkce [32]. Všechny formy nefrotického syndromu, stejně jako fokální segmentální glomeruloskleróza (FSGS), jsou charakterizovány defekty ve struktuře nebo funkci podocytů [33].

Naše současná studie ukázala nejvyšší expresi DAB1 v apikálních a laterálních částech buněčných membrán DCT, zatímco REELIN byl většinou rozptýlen v cytoplazmě PCT. Ve zkoumaných časových bodech nebyly pozorovány žádné morfologické změny v tubulech myší yotari, ale k objasnění úlohy DAB1 v tubulointersticiálních kompartmentech je nezbytný další výzkum. Docházelo k občasné kolokalizaci proteinů DAB1 a REELIN, většinou v DCT. Tato zjištění navazují na naši předchozí práci týkající se exprese těchto dvou proteinů během lidského ploduledvinavývoj [9]. To může naznačovat, že DAB1 a reelin mají podobné role u člověka a myšiledvinyaktivací některých downstream drah, jako jsou signální kaskády Crk, MAPK a PI3K/Akt/mTOR [34–36]. Naše data také odhalila zvýšenou expresi reelinu v glomerulech myší yotari. Je zajímavé, že předchozí studie ukázala, že fosforylace DAB1 a zvýšená exprese reelinu v glomerulech jsou doprovázeny hypertenzí, proteinurií a poškozením podocytů u potkanů ​​s infuzí Ang II [10].

Kromě toho imunofluorescenční barvení odhalilo zvýšenou expresi receptorů NOTCH2 v glomerulech myší P14 yotari. Je dobře známo, že exprese NOTCH2 je downregulována, jakmile je dosaženo zrání nefronu, s výjimkou podmínekporanění ledvin,jako je diabetická nefropatie a FSGS [15,37]. Myši s nefrotickým syndromem indukovaným Adriamycinem také vykazovaly zvýšenou expresi aktivovaného NOTCH2, který zmírňuje fibrózu [38]. Ve zkoumaných časových bodech jsme nezaznamenali zvýšenou fibrózu, zbývá však objasnit přesnou roli exprimovaného NOTCH2 v postnatálním yotariledviny.Bylo by nutné další sledování toho, zda se fibrotické změny vyskytují v pozdějších stádiích. Již nyní však existují některá zjištění, která naznačují, že krátkodobý účinek zvýšené aktivace NOTCH2 je spojen se silným přínosem pro přežití poraněných podocytů, který se v dlouhodobých modelech, jako je diabetická nefropatie, ztrácí [39].

Vyšší exprese LC3B v glomerulech myší P11 a P14 yotari pravděpodobně odrážela akumulaci autofagozomů v podocytech. Jasně ukázat, že autofagie byla urychlena. Je nutné analyzovat poměr exprese proteinu LC3-II a LC{5}}I. Za normálních podmínek je pro normální autofagie nezbytnáfunkce ledvin[40], zejména v podocytech. Vzhledem ke své omezené kapacitě buněčného dělení a náhrady vykazují vysokou bazální úroveň autofagie [41]. Navzdory těmto zjištěním bylo zvýšení exprese LC3B hlášeno u několika glomerulárních onemocnění [42–44], zejména v souvislosti s vymizením výběžků chodidla a rozvojem nefrotického syndromu, jak bylo pozorováno u myší s podmíněným knockoutem pro proreninový receptor [45,46]. Všechny tyto studie naznačují protektivní roli zesílené autofagie v patologických stavech, dále podpořenou zjištěními nefropatie vyvolané Adriamycinem, kde je autofagie aktivována k ochraně před poškozením podocytů [43], stejně jako u glomerulárních onemocnění závislých na věku, kde zpomaluje progresivní funkční úpadekfunkce ledvin[40]. Analýza člověkaledvinabiopsie také prokázaly zvýšenou autofagii ve spojení s vymýváním výběžků nohy u několika glomerulárních onemocnění, včetně nefrotického syndromu s minimálními změnami (MCNS), který je jednou z nejčastějších příčin idiopatického nefrotického syndromu [19]. U stavů diabetické nefropatie a lipopolysacharidy indukované akutníporanění ledvin,posílení autofagie některými terapeutiky prostřednictvím inhibice dráhy PI3K/AKT/mTOR zlepšuje funkci ledvin [47,48]. Všechna tato zjištění naznačují, že autofagie má nepostradatelnou cytoprotektivní roli pro adaptaci na stresporanění ledvina jeho modulace by mohla být slibnou terapeutickou strategií, i když za určitých okolností může být autofagie také škodlivá a může přejít do buněčné smrti.

CISTANCHE ZLEPŠÍ SELHÁNÍ LEDVIN/RENÁL

Kromě zvýšení autofagie bylo možné pozorovat zvýšenou úroveň apoptózy také v glomerulech myší P14 yotari. Autofagie obvykle zabraňuje apoptóze, ale za specifických patologických okolností může mít také opačný účinek na přežití buněk posílením a podporou apoptózy [42]. Po narození apoptóza vledvinyje značně snížena, s výjimkou podmínekporanění ledvin,jako je idiopatický nefrotický syndrom, kde přispívá k rozvoji onemocnění [23]. potenciální nová příčina autozomálně recesivních vrozených anomáliíledvinaa močových cest. Hlavní roli však DAB1 běhemledvinavývoj zůstává nejasný. Kromě toho tyto myši vykazovaly abnormality chodidel a zvýšenou hladinu reelin, NOTCH2, LC3B a štěpených proteinů CASP3 v glomerulech, což může vést k glomerulárním poraněním, jako je nefrotický syndrom, který v korelaci s hypoplazií může být potenciální příčinou smrti. těchto zvířat v období odstavu. Pro potvrzení této hypotézy je nutné poskytnout další informace týkající se krevního tlaku a dalších klinicko-laboratorních parametrů, jako jsou hladiny sérového kreatininu, albuminu a proteinů.