Delece pěti aminokyselin v NKCC2 myší C57BL/6 ovlivňuje analýzu fosforylace NKCC2, ale neovlivňuje funkci ledvin

edmund.chen@wecistanche.com

ÚVOD

Silná vzestupná končetina (TAL) savceledvinaje rozhodující pro řízení objemu extracelulární tekutiny, koncentrace v moči, homeostázy vápníku (Ca 2 plus ) a hořčíku (Mg 2 plus ) a také rovnováhy pH. 1 Hlavní transportní dráhou Na plus v TAL je Na plus - K plus - 2Cl − kotransportér (NKCC2), který je specificky inhibován smyčkovými diuretiky. 1 Kotransport iontů Na plus , K plus a 2Cl − přes NKCC2 je elektroneutrální, ale závisí na elektrogenní sekreci K plus přes apikální ledvinovévnější medulla K plus kanál ROMK. 2 Souhra NKCC2 s ROMK vytváří lumen-pozitivní elektrochemický gradient, který zvyšuje reabsorpci Na plus a řídí paracelulární transport Ca 2 plus a Mg 2 plus . 3 Význam NKCC2 pro TAL afunkce ledvinje příkladem Bartterův syndrom I. typu, genetická porucha způsobená ztrátou funkce mutací v NKCC2, projevující se závažnýmiledvinovéplýtvání solí a tekutinami, hypokalemická metabolická alkalóza a hyperkalciurie. 3

NKCC2 je členem rodiny nosičů rozpuštěných látek 12 (Slc12) membránových transportních proteinů, která také zahrnuje všudypřítomně exprimovaný NKCC1 a distální stočený tubulus (DCT) specifický Na plus - Cl − kotransportér (NCC). 2 Aktivita NKCC2 pozitivně koreluje s fosforylací kotransportéru na několika serinových a threoninových zbytcích na cytoplazmatickém N-konci. 4 Aminokyselinové sekvence obklopující tato fosforylační místa jsou vysoce konzervované a vykazují vysoký stupeň podobnosti mezi NKCC2, NKCC1 a NCC. 2 Fosforylace NKCC2 je stimulována několika hormonálními a nehormonálními cestami. Hormony jako arginin vasopresin (AVP) a angiotensin II (ANGII) stimulují NKCC2 prostřednictvím zvýšené produkce cAMP a aktivace proteinkinázy A (PKA). 5 Předpokládá se, že PKA přímo fosforyluje NKCC2 na Ser126, což zvyšuje exocytózu vezikul obsahujících NKCC2, a tudíž hojnost transportéru v apikální plazmatické membráně. 6 Podobně změny v intracelulárních koncentracích chloridů regulují fosforylaci NKCC2. Snížená koncentrace tracelulárního Cl − stimuluje withnolysin(K)kinázy WNK1 a WNK4 k fosforylaci a aktivaci downstream kináz Ste{27}} související s prolin alanin bohatou kinázou (SPAK) nebo kinázou 1 reagující na oxidační stres (OXSR1 ). 7- 9 Po navázání na motiv "RFxV" v NKCC2 tyto kinázy poté fosforylují NKCC2 na dvou threoninových zbytcích (T96 a T101). 2 Defosforylace těchto zbytků je zprostředkována fosfatázou kalcineurinem, což zdůrazňuje, že NKCC2 je cílem pro několik signálních drah. 10

Pro studium funkce NKCC2 vyvinulo několik skupin včetně naší fosfoformně specifické protilátky proti Thr96 a/nebo Thr101. 11- 17 Protilátky byly použity k hodnocení fosforylace NKCC2 v heterologních expresních systémech 7,11,17,18,19,20 a zvířecích modelech včetně potkanů ​​10,21,22,23,24,25 a myší. 14,15,16,17,19,26,27 Avšak při použití naší protilátky pT96/101 NKCC2 jsme získali nekonzistentní výsledky v našich různých myších modelech. Zatímco jsme detekovali silné signály pNKCC2 v ledvinách od myší na genetickém pozadí 129Sv, nezískali jsme spolehlivé signály pNKCC2 v ledvinách od myší C57BL/6, ale pozorovali jsme zkříženou reaktivitu protilátek pNKCC2 s pNCC. Další laboratoře, včetně laboratoří JA McCormicka a AA McDonougha (osobní komunikace), provedly podobná pozorování. 18,28,29 Kromě toho byly u myší popsány výrazné rozdíly mezi kmenyledvinovéfunkce 30 včetně významně nižšího vylučování Ca2 v moči u C57BL/6 ve srovnání s myšmi 129Sv. 31 Proto jsme předpokládali, že myši C57BL/6 exprimují genetickou variantu NKCC2, která ovlivňuje fosforylaci NKCC2 a možnáfunkce ledvinkteré vysvětlují pozorované rozdíly mezi kmeny. Následující studie byla navržena tak, aby systematicky testovala tuto hypotézu.

klíčová slova:iontová homeostáza, ledviny, NKCC2, fosforylace, rozdíly mezi kmeny

VÝSLEDEK

2,1|Myši C57BL/6 mají deleci pěti aminokyselin v NKCC2, která interferuje s detekcí fosforylovaného NKCC2Nejprve jsme pro několik druhů porovnali publikované N-koncové aminokyselinové sekvence (transkripční ID v tabulce S1) NKCC2 a NCC (obrázek 1A, B), které odpovídají epitopům rozpoznávaným protilátkami anti-pNCC a anti-pNKCC (Obrázek 1C). Zarovnání potvrdilo vysoký stupeň zachování fosforylačních míst NKCC2 a NCC 7, což pravděpodobně vysvětluje zkříženou reaktivitu protilátek pNKCC2 a pNCC pozorovanou námi a dalšími. 18,28,29 Je zajímavé a v souladu s naší hypotézou, že srovnání také odhalilo dosud nepochopenou deleci pěti aminokyselin v sekvenci NKCC2 z myší C57BL/6 (AF97-T101) (obrázek 1A) . Sekvenování DNA ze dvou různých kolonií myší C57BL/6 uchovávaných v The Jackson Laboratory v USA nebo Janvier Labs ve Francii potvrdilo nukleotidovou deleci v exonu 2 C57BL/6 NKCC2, která odpovídá výše uvedené deleci aminokyselin (obrázek S1 ,Tabulka S2).

Abychom charakterizovali dopad delece pěti aminokyselin na imunodetekci celkového a fosforylovaného NKCC2, systematicky jsme studovali ledviny myší C57BL/6 a 129Sv pomocí imunohistochemie a imunoblotu. Imunofluorescence s protilátkou proti celkovému NKCC2 ukázala silný fluorescenční signál v apikální plazmatické membráně TAL myší 129Sv a C57BL/6. Naše dříve vyvinutá protilátka pT96/T101 NKCC2 však vykazovala silné apikální značení TAL pouze u 129Sv myší, zatímco TAL myší C57BL/6 měly velmi slabé imunobarvení (obrázek 1D). V souladu s tím analýza Western blot odhalila silný pruh pro celkový NKCC2 u obou kmenů myší, zatímco protilátka pT96/T101 NKCC2 detekovala silný pruh očekávané velikosti (170 kDa) pouze u myší 129Sv (obrázek 1E). Místo toho ledviny myší C57BL/6 odhalily pás při 130 kDa, který odpovídá očekávané velikosti NCC (obrázek 1E). Podobné výsledky byly získány s jinými protilátkami dříve používanými ke studiu fosforylace NKCC2 (obrázek S2). Protilátka pT212/T217 NKCC1 R5 11 vykazovala kromě signálu pNCC slabý signál očekávané velikosti pro pNKCC2 (obrázek S2). Imunoreaktivní pás pro pNKCC2 se stal intenzivnějším, když byl čerstvýledvinabyly použity lyzáty. Použití lyzačního pufru s detergenty (RIPA pufr) nezlepšilo, ale snížilo intenzitu signálu (obrázek S3).

OBRÁZEK ​​1 Protilátka pT96/T101 NKCC2 nedetekuje viditelný signál pNKCC2 u myší C57BL/6. A, Zarovnání aminokyselinové sekvence NKCC2 různých druhů a dvou myších kmenů 129Sv a C57BL/6. ID sekvencí NKCC2 pro různé druhy jsou uvedeny v tabulce SI. Vysoce konzervovaná oblast odpovídající myšímu Thr96 až myšímu Thr101 je označena šedě. B, Zarovnání aminokyselinové sekvence NCC u různých druhů. ID sekvencí NCC pro různé druhy jsou uvedeny v tabulce SI. C, Seznam epitopů běžně používaných a publikovaných protilátek rozpoznávajících pT53 nebo pT58NCC, stejně jako pNKCC2 na konzervovaném lokusu kolem Thr96 až Thr101. D, Imunobarvení celkového a pT96/T101 NKCC2 v po sobě jdoucích kryořezech myší s pozadím 129Sv a C57BL/6. Měřítko=50 µm. E, Imunoblot celkem a pT96/T101 NKCC2 myší s pozadím 129Sv a C57BL/6. Hodnoty jsou průměry ± SEM, n=5 myší na skupinu, zelené šipky ukazují na specifické pruhy, zatímco červené šipky ukazují na nespecifické pruhy. Součástí jsou markery molekulové hmotnosti. Celkové a pT96/T101 NKCC2 pásy se očekávají při 170 kDa. F, Imunobloty pro celkovou a pT96/T101 NKCC2, celkovou a pT53 a pT58 NCC u NCC WT a NCC knockout (KO) myší různého původu. Zelené šipky ukazují na specifická pásma, zatímco červené šipky ukazují na nespecifická pásma. Součástí jsou markery molekulové hmotnosti. Celková a pT58 a pT53 NCC pásy se očekávají při 130 kDa, celkové a pT96/T101 NKCC2 pásy se očekávají při 170 kDa

Abychom otestovali, zda naše protilátka pT96/T101 NKCC2 skutečně křížově reaguje s fosforylovaným NCC u myší C57BL/6, sondovali jsmeledvinalyzáty z myší divokého typu 129Sv a C57BL/6 a knockout myší C57BL/6 NCC s protilátkami proti celkovému NKCC2, pT96/T101 NKCC2, celkovému NCC a fosforylovanému NCC (pT53 a pT58 NCC) (obrázek 1F). Protilátka pT96/T101 NKCC2 a protilátky proti celkovému NCC a pNCC nedetekovaly pásy při 130- 170 kDa u C57BL/6 NCC knockout myší (obrázek 1F). Je zajímavé, že imunoblot a další imunohistochemické experimenty (obrázek S4) ukazují, že nejenom, že protilátky pNKCC2 zkříženě reagují s NCC u myší C57BL/6, ale naše protilátky pNCC (pT53 NCC a pT58 NCC) zkříženě reagují s NKCC2 v 129Sv. myši v použitých koncentracích.

Vylučování vápníku a hořčíku močí se u myší 129Sv a C57BL/6 liší

Abychom určili, zda se delece (F{0}} T101) v NKCC2 může spojovat s fyziologickými rozdíly mezi myšmi 129Sv a C57BL/6, porovnávali jsme příjem vody, hladiny iontů v plazmě a vylučování tekutin a iontů močí mezi dvěma myšími kmeny. Jak je shrnuto v tabulce 1, většina hodnocených parametrů se mezi kmeny nelišila. Myši C57BL/6 však vykazovaly nižší vylučování Ca 2 plus v moči a vyšší vylučování Mg 2 plus v moči než myši 129Sv. Plazmatické hladiny Ca 2 plus a Mg 2 plus byly pro obě skupiny podobné, což naznačuje, že myši byly v ustáleném stavu, ve kterém byla homeostatická rovnováha střevní reabsorpce, mobilizace tkání (např. z kostí) aledvinovébylo dosaženo vylučování Ca 2 plus a Mg 2 plus iontů. Abychom otestovali, zda různé rychlosti vylučování Ca 2 plus a Mg 2 plus močí vyplývají z rozdílů ve střevním příjmu těchto iontů, porovnali jsme denní příjem potravy, výdej stolice a vylučování Ca 2 plus a Mg 2 plus stolicí u těchto dvou látek. myší kmeny. Jak je znázorněno na obrázku S5, příjem potravy a fekální výdej Ca 2 plus výdej byly podobné, ale denní fekální vylučování Mg 2 plus bylo u myší C57BL/6 nižší než u myší 129Sv, což naznačuje, že myši C57BL/6 mají vyšší intestinální Mg 2 plus reabsorpci než 129Sv myši. V souladu s tímto předpokladem měly myši C57BL/6 silnější expresi hořčíkového kanálu TRPM6 v tlustém střevě (obrázek S6), stejně jako trend k vyšším hladinám plazmatického Mg2 plus ve srovnání s myšmi 129Sv, ačkoli rozdíly nedosáhly statistické významnosti. Pro posouzení možného přínosu kosti jsme pomocí mikro-CT analyzovali kostní minerální denzitu u obou kmenů. Podobně jako v předchozích zprávách mělo 32 myší C57BL/6 poměrně nízkou hustotu kostních minerálů (obrázek S7), což může vysvětlovat, proč tyto myši mají tendenci šetřit Ca 2 plus ionty prostřednictvím sníženéledvinovéCa 2 plus vylučování. V souladu se zvýšenou rychlostí tubulárního Ca 2 plus reabsorpce ledviny myší C57BL/6

exprimovali více TRPV5 Ca2 plus kanál na proteinových hladinách než ledviny 129Sv myší (obrázek 2). Myši C57BL/6 měly také významně vyšší expresi NCC mRNA a proteinu než myši 129Sv (obrázek 2A). Podobně, množství proteinu celkového NKCC2, celkového a fosforylovaného NCC a celkového - ENaC bylo vyšší u C57BL/6 než u 129Sv myší (obrázek 2B,C). Množství proteolyticky štěpených a tedy aktivních forem - a - ENaC se nelišilo, což naznačuje, želedvinovéAktivita ENaC byla pro oba kmeny podobná (obrázek 2B,C).

Žádný důkaz pro změněnou funkci tlustých vzestupných končetin u myší C57BL/6 ve srovnání s myšmi 129Sv

Vyšší množství celkového NKCC2, celkového NCC a fosforylovaného NCC v ledvinách myší C57BL/6 může být kompenzační odpovědí za sníženou fosforylaci NKCC2. Abychom otestovali, zda se aktivita NKCC2 a NCC mezi myšími kmeny liší, provedli jsme bumetanidový a thiazidový test. Jediná injekce bumetanidu nebo hydrochlorothiazidu vyvolala silnou natriurézu, která byla výraznější u bumetanidu než u hydrochlorothiazidu. Nicméně diuretické odpovědi byly u obou kmenů zcela podobné, což naznačuje, že funkční aktivity NKCC2 a NCC se u myší C57BL/6 a 129Sv nelišily (obrázek 3A-D). Je zřejmé, že množství proteinů a hladiny fosforylace nemusí nutně odpovídat funkčním aktivitámledvinovéiontové transportní proteiny, jak nedávno také poukázali Hunter a spolupracovníci. 33 Pro další posouzení funkce TAL jsme provedli test omezení vody, ve kterém měly myši 24 hodin přístup k navlhčené potravě, ale ne k vodě z vodovodu. Za těchto podmínek oba myší kmeny zvýšily osmolaritu moči na podobné hodnoty (tabulka 1). Kromě toho myši C57BL/6 a myši 129Sv vykazovaly stejné vylučování uromodulinu močí (Tamm-Horsfall protein) (tabulka 1), který je produkován a vylučován do moči v závislosti na funkční aktivitě buněk TAL. 3

Křížení myší 129Sv a C57BL/6 naznačuje, že delece pěti aminokyselin v NKCC2 neodděluje specifický fenotyp

Prezentovaná data naznačují, že kmenové rozdíly ve vylučování iontů močí aledvinovéabundance proteinů nesouvisí s delecí pěti aminokyselin v C57BL/6 NKCC2, ale souvisí s jinými genetickými rozdíly mezi dvěma myšími kmeny. Abychom to dále otestovali, zkřížili jsme myši 129Sv a C57BL/6 do generace F2, ve které by rozdíly genetických kmenů (včetně těch v NKCC2) měly být náhodně

distribuovány myším. Poté jsme porovnali myši F2, které byly buď homozygotní pro NKCC2 v plné délce (f/f), homozygotní pro deleci NKCC2 (Δ/Δ) nebo heterozygotní pro deleci NKCC2 (f/Δ). S výjimkou očekávaných odlišných vazebných vzorů fosfoformně specifických protilátek proti NKCC2 a NCC (a nejasného rozdílu exprese ROMK na úrovni mRNA, ale ne na úrovni proteinu), nebyl žádný z dříve identifikovaných rozdílů mezi těmito dvěma kmeny evidentní. myši f/f, Δ/Δ nebo f/Δ generace F2 (obrázek 4 a tabulka 2). Zejména nebyly zjištěny žádné rozdíly ve vylučování Ca 2 plus nebo Mg 2 plus močí, stejně jako žádné rozdíly v hladinách Ca 2 plus nebo Mg 2 plus v plazmě, což naznačuje, že rozdíly mezi kmeny mezi myšmi 129Sv a C57BL/6 jsou nezávislé na delece pěti aminokyselin v NKCC2.

Nová protilátka pT96 NKCC2 detekuje pNKCC2 v obou kmenech

Protože delece pěti aminokyselin v NKCC2 brání spolehlivé detekci fosforylace NKCC2 u myší C57BL/6 při použití dostupných protilátek, vytvořili jsme novou protilátku namířenou proti fosfositu T96 u myší C57BL/6. Králíci byli imunizováni fosfopeptidem, který odpovídal aminokyselinové sekvenci C57BL/6 NKCC2 obklopující T96 (YYLQ(p)TMDA). Antiséra byla afinitně purifikována a charakterizována imunoblotováním a imunohistochemií (obrázek 5). Protilátka detekovala jeden pás o očekávané velikosti 170 kDa v ledvinách 129Sv, C57BL/6 divokého typu a C57BL/6 NCC knock-out

myši (obrázek 5A). Pás byl jasně odlišný od pásu detekovaného pro NCC při 130 kDa. Defosforylace 129Svledvinavzorky s alkalickou fosfatázou z telecího střeva (CIAP) zcela vymýtily signál získaný s novou protilátkou pT96 NKCC2, zatímco signál s protilátkou NKCC2 nespecifickou pro fosfoformu byl viditelný v kontrolních a defosforylovaných vzorcích (obrázek 5B). Je zajímavé, že fosforylace NKCC2 byla také z velké části eliminována, kdyžledvinalyzáty byly inkubovány při 37 stupních po dobu 1 hodiny bez CIAP (pravděpodobně kvůli aktivitě endogenní alkalické fosfatázy z proximálních tubulů). Experimenty defosforylace s použitím lambda fosfatázy na po sobě jdoucích parafinových řezech ledvin myší C57BL/6 dále potvrdily, že nová protilátka rozpoznává pouze fosforylovaný NKCC2 (obrázek 5C). Navíc imunofluorescence na po sobě jdoucích kryosekcích prokázala, že nová protilátka barví pouze apikální plazmatickou membránu NKCC2- pozitivních TAL, ale ne NCC-pozitivních DCT u myší 129Sv a C57BL/6 (obrázek 5D), což naznačuje, že nová Protilátka pNKCC2 nereaguje zkříženě s pNCC. Tento závěr byl také potvrzen použitím buněčných lyzátů z MDCKI buněk exprimujících lidský NKCC2 (hNKCC2) a lidský NCC (hNCC). Imunobloty imunoprecipitací (IP) a lyzátů celých buněk prokázaly, že nová protilátka pT96 NKCC2 rozpoznává lidský NKCC2, ale ne lidský NCC (obrázek S8A). Je zajímavé, že ačkoliv byla nová protilátka vypěstována proti pNKCC2 myší C57BL/6, nová protilátka detekovala fosforylaci NKCC2 ekvivalentně v ledvinách obou myších kmenů jak imunohistochemicky (obrázek 6A), tak imunoblotem (obrázek 6B).

Nová protilátka pT96 NKCC2 umožňuje analýzu regulované fosforylace NKCC2

Fosforylace a tím i aktivita NKCC2 a NCC jsou regulovány koncentracemi extracelulárních iontů. Nízký [Cl -] ex zvyšuje fosforylaci NKCC2 na Thr96 a Thr101 a NCC na Thr53 a Thr58 prostřednictvím aktivace dráhy WNK/SPAK/OSR1. 7,8,18,29,35 Podobně vysoká [K plus] prudce snižuje fosforylaci NCC, ale předpokládá se, že má malý nebo žádný účinek na fosforylaci NKCC2. 12,36,37,38 Abychom otestovali, zda je nově vyvinutá protilátka pT96 NKCC2 schopna detekovat tento typ diferenciální regulace fosforylace NKCC2,ledvinařezy myší C57BL/6 byly ex vivo vystaveny buď 110 nebo 5 mM [Cl-] ex a 3 nebo 10 mM [K plus] ex. Jak se očekávalo, nízká [Cl -] ex silně zvýšila fosforylaci NCC a NKCC2 (obrázek 7A, B), zatímco vysoká [K plus] ex pouze snížila fosforylaci NCC, ale nezměnila fosforylaci NKCC2 (obrázek 7C, D). Stejně tak nová protilátka detekovaná stejně dobře změněná

OBRÁZEK ​​4 Žádné významné změny v expresi mRNA a proteinu majorledvinovéiontové transportéry a kanály v křížené generaci F2. A, sloupcový graf relativních úrovní exprese mRNA ve třech skupinách myší. Všechny hodnoty byly normalizovány na f/f myši. Hodnoty jsou průměry ± SEM. B, Hojnost bílkovin u myšiledvinalyzáty ze zvířat generace F2. Tyto tři skupiny odpovídají NKCC2 plné délky (f/f), NKCC2 homozygotní pro deleci (A/A) nebo NKCC2 heterozygotní pro deleci (f/A/). Součástí jsou markery molekulové hmotnosti. NKCC2 a pNKCC2 se očekávají při 170 kDa, NCC a pNCC při 130 kDa, TRPM6 při 260 kDa, - ENaC při 95 kDa a 34 kDa (štěpené), - ENaC při 100 kDa, - ENaC při 100 kDa a ROMK při 55 kDa (zralá glykosylovaná), 43 kDa (jádro glykosylovaná) a 34 kDa (neglykosylovaná). Zelené šipky ukazují na konkrétní pruhy, zatímco červené šipky ukazují na nespecifické pruhy. C, Denzitometrická analýza nadbytku proteinu srovnáním f/f a A/A myší. Intenzity pásů z A/A myší jsou normalizovány na hodnoty z f/f. (Hodnoty jsou průměry ± SEM; n=5 myší/skupina; *P < 0,05,="" †="" p="">< 0,01,="" ‡="" p=""><>

Fosforylace NKCC2, která byla vyvolána v buňkách MDCKI exprimujících lidský NKCC2 (hNKCC2) nebo myší NKCC2 (mNKCC2(C57BL/6)) hypotonickými podmínkami s nízkým extracelulárním chloridem (obrázek S8B). vledvinařezy inkubované při 5 mM [Cl -] ex, také dříve popsané protilátky proti myšímu pT96/T101 NKCC2 39 a protilátky proti lidskému pT212/T217 NKCC1 R5 11 detekují slabé signály pro NKCC2 a NCC, které jsou zřetelnější, když je naloženo více proteinů a imunobloty jsou zobrazeny ve vylepšeném nastavení (obrázek S9).

DISKUSE

Myši C57BL/6 a 129Sv jsou dva z nejčastěji používaných myších kmenů pro biomedicínský výzkum. Genom myší C57BL/6 byl první, který byl sekvenován pro myš 40 a od té doby sloužil jako referenční genom pro analýzu genetických a fenotypových variací mezi myšími kmeny. 41- 44 Proledvinajeden podstatný rozdíl mezi C57BL/6 a 129Sv myšmi se týká exprese genu reninu. Stejně jako lidé mají myši C57BL/6 pouze jeden gen pro renin, zatímco myši 129Sv mají dvě kopie, což může vysvětlit vyšší náchylnost tohoto myšího kmene k hypertenzi 45,46 a hypertenznímu poškození. 47 V této studii přidáváme další důležitý genetický rozdíl, který je třeba vzít v úvahu. Popisujeme dosud nedoceněnou deleci pěti aminokyselin v NKCC2 (ΔF97- T101), přítomné u C57BL/6, ale ne u 129Sv myší, která interferuje s detekcí fosforylace NKCC2 s většinou dříve dostupných protilátek, ale nijak významně dopadfunkce ledvin.

N-koncová fosforylační místa myší NKCC2 T96 a T101 jsou vysoce konzervovaná napříč druhy a mezi NKCC2, NKCC1 a NCC (obrázek 1). Proto není překvapivé, že protilátky namířené proti těmto fosforylačním místům zkříženě reagují s ostatními kotransportéry. Předchozí studie uvádějí, že protilátky proti fosforylovanému NCC také detekují fosforylovaný NKCC2 7,18,28,29 a že protilátka pNKCC1 umožňuje analýzu hladin fosforylace jak NKCC1, tak NKCC2. 11 V souladu s tím jsme pozorovali zkříženou reaktivitu našich protilátek pNCC (pT53 a pT58) s fosforylovaným NKCC2 a naší protilátky pT96/pT101 NKCC2 s fosforylovaným NCC. Nicméně zkřížená reaktivita protilátek pNCC s NKCC2 byla pozorována pouze v ledvinách myší 129Sv, ale ne v ledvinách myší C57BL/6. Naopak naše dříve vyvinutá protilátka proti NKCC2 pT96/pT101 nevykazovala žádný nebo přinejlepším velmi slabý signál pro pNKCC2 v ledvinách myší C57BL/6 a detekovala v tomto kmeni hlavně fosforylované NCC. Nyní spojujeme tato matoucí pozorování s delecí pěti aminokyselin v NKCC2 myší C57BL6 (AF97- T101). Regulace fosforylace NKCC2 byla studována

v různých experimentálních podmínkách a pro různé stimuly včetně vazopresinu, 14,21,24,25,49 uromodulinu 19,20,50 a inhibitorů kalcineurinu. 10,26 Zatímco většina studií byla provedena na heterologních expresních systémech 10,19,20,25,50 nebo na potkanech 10,24 a myších 19,26 exprimujících NKCC2 plné délky, některé studie byly provedeny také na myších C57BL/6. 7,18,27,28,29,51 Jak zde uvádíme, myši C57BL/6 exprimují variantu NKCC2 s delecí pěti aminokyselin, která interferuje se správnou detekcí fosforylace NKCC2 a která nese riziko, že standardní pT96/T101 NKCC2 protilátky a R5 anti fosfo-NKCC1 protilátka zkříženě reagují s fosforylovaným NCC alespoň za podmínek použitých v naší práci. Není možné posoudit dopad této křížové reakce na předchozí experimentální závěry, ale podle našich pozorování by data z myší C57BL/6 měla být znovu přezkoumána a interpretována s opatrností. Navzdory skutečnosti, že delece pěti aminokyselin měla silný dopad na detekci fosforylace NKCC2, nemáme žádný důkaz, že delece významně ovlivňuje funkční aktivitu kotransportéru. Myši C57BL/6 měly ve skutečnosti vyšší vylučování Mg2 plus v moči a nižší vylučování Ca2 plus v moči 31 než myši 129Sv, ale zjistili jsme, že tyto rozdíly pravděpodobně nesouvisejí se změněným paracelulárním transportem těchto kationtů podél TAL, ale jsou výsledek zvýšeného TRPM6- dependentního Mg 2 plus absorpce ve střevě a zvýšené TRPV 5- dependentní Ca 2 plus reabsorpce v DCT2 a CNT. Ten způsobuje pozitivní Ca 2 plus rovnováhu, která může pomoci zvýšit nízkou hustotu kostního minerálu u myší C57BL/6. Zjištění, že myši C57BL/6 a 129Sv vykazují totéžledvinovéodezvy na smyčková a thiazidová diuretika a na omezení vody dále naznačuje, že delece pěti aminokyselin v NKCC2 významně nezhoršuje funkci TAL. Nejdůležitější je, že myši generace F2 křížených myší C57BL/6 a 129Sv mají stejnéledvinovéfenotyp nezávislý na tom, zda myši exprimují plnou délku (f/f) NKCC2 nebo NKCC2

homozygotní (A/Δ) pro deleci. Tato pozorování u myší jsou v souladu s předchozími funkčními daty z heterologních expresních systémů. Zatímco mutace jednotlivých zbytků v NKCC1 (T217 u člověka, T211 u myši) nebo NCC (T60 u člověka, T58 u myši) ruší aktivitu těchto kotransportérů, mutace odpovídajícího zbytku v NKCC2 (T105 u člověka, T101 u myši ) mají spíše malý nebo dokonce žádný účinek na výchozí a stimulovanou aktivitu NKCC2. 35,52,53 I když jsou oba threoninové zbytky v NKCC2 mutovány na alanin, funkční aktivita NKCC2 stále dosahuje ~70 procent maximální aktivity, 35 což naznačuje, že fosforylace těchto míst je indikativní, ale není nezbytná pro aktivitu NKCC2.

Fosforylační místa jsou mezi proteiny často homologní. Problém zkřížené reaktivity protilátek specifických pro fosfoformy tedy není ojedinělý pro protilátky namířené proti fosforylovaným NCC, NKCC2 a NKCC1, ale byl popsán také pro jiné proteiny, jako jsou cyklin dependentní kinázy 1 a 2 54 a extracelulární signálem regulované kinázy 1 a 2. 55 Důsledně, kdykoli jsou použity protilátky specifické pro fosforylační stav, jsou zapotřebí přísné experimentální kontroly k potvrzení specifičnosti detekovaných signálů. To může zahrnovat (a) potvrzení, že použitá protilátka detekuje protein v očekávané molekulové hmotnosti (imunoblotting) a/nebo v očekávané buněčné a subcelulární lokalizaci (imunofluorescence), (b) ověření, že protilátka specificky interaguje s fosforylovaným epitopem pomocí kompetičních testů s fosforylovanými a nefosforylovanými peptidy a (c) prokázání, že

protilátka je fosfoformně specifická porovnáním vzorků fosforylované a defosforylované tkáně. Tyto kontroly mohou být doplněny genetickými kontrolami, které zahrnují testování tkání z knockoutovaných zvířat a/nebo buněk heterologně exprimujících požadovaný protein. V této studii jsme použili výše uvedené přístupy k důkladné charakterizaci nové protilátky pT96 NKCC2, která detekuje fosforylovaný NKCC2 vledvinavzorky z myší C57BL/6 a 129Sv stejně dobře. Protilátka je fosfoformně specifická a nevykazuje žádnou zjevnou zkříženou reaktivitu s fosforylovaným NCC za žádné z testovaných podmínek. Pomocí této protilátky jsme potvrdili, že nízké koncentrace extracelulárního chloridu zvyšují fosforylaci NKCC2 v tomto místě, 7,8 zatímco změněné koncentrace extracelulárního draslíku nemají významnou regulační roli. 24 Závěrem, naše práce odhaluje kritický rozdíl mezi kmeny v aminokyselinové sekvenci myšího NKCC2, který ovlivňuje detekci a tedy analýzu fosforylace a regulace NKCC2. Nově vyvinutá protilátka pT96 NKCC2 tuto technickou výhradu obchází a umožňuje spolehlivou detekci změněné fosforylace NKCC2 nezávisle na genetickém pozadí myších modelů. Naše studie navíc znovu zdůrazňuje, že při analýze myších modelů je třeba vzít v úvahu rozdíly v genetickém pozadí.

MATERIÁLY A METODY

zvířata,Samci myší stejného věku (6- 8 týdnů) byli buď inbrední kmeny 129S6/SvEvTac, C57BL/6J, dále označované jako 129Sv a C57BL/6, nebo smíšený hybridní kmen 129S/B6 v generaci F2. Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu se švýcarskými zákony o dobrých životních podmínkách zvířat a schváleny veterinární správou kantonu Curych, Švýcarsko (Licence: 141/2014, 185/2017 a 135/2018). Myši byly genotypizovány pro deleci 15 bází pomocí standardní PCR s primery uvedenými v tabulce S3. NKCC2 plné délky (f/f) má očekávaný produkt PCR 87 bp, zatímco deletovaná sekvence NKCC2 (A/A) se očekává na 70 bp.

Zpracování tkáníMyši byly anestetizovány kombinací isofluranu (2 procenta - 4 procent, 0,5 l/min; Provet; CH) a Temgesic (buprenorfin; 0.05- 0. 4 mg/kg tělesné hmotnosti; Indivor; CH). Pro biochemickou analýzu byly myši anestetizovány a perfundovány přes levou srdeční komoru fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS). Ledviny a distální tračník byly odebrány, rychle zmraženy v tekutém dusíku a skladovány při teplotě -80 až do dalšího zpracování. Pro imunohistochemii byly ledviny fixovány pomocí paraformaldehydu (PFA) 3 procenta v 0,1 M fosfátovém pufru (pH 7,4, 300 mOsm) retrográdní perfuzí hluboce anestetizované myši pomocí břišní aorty následovaný krátkým propláchnutím 0,1 M fosfátovým pufrem (0,2 M NaH2P04 x H20, 0,2 M NaH2P04 x 2H20, 0,1 M CaCl2). Následně byly ledviny vyjmuty, nakrájeny na kousky a zmraženy v kapalném propanu a skladovány při -80 stupních.

Metabolické klecové studiePo adaptaci na metabolické klece (Techniplast) byly myši drženy v metabolických klecích čtyři po sobě jdoucí dny s volným přístupem k vodě z vodovodu a standardnímu laboratornímu krmivu (Ssniff, Spezialdiäten GmbH). Tělesná hmotnost, příjem potravy a vody byly zaznamenávány denně a 24 hodin byla shromažďována moč a stolice.

Protokol o omezení vodyMyši byly drženy po dobu 24 hodin v metabolických klecích (Techniplast) bez přístupu k vodě z vodovodu. Standardní laboratorní prášek do krmiva (Ssniff, Spezialdiäten GmbH) byl smíchán s vodou v poměru 1:1, 24 hodin byla shromážděna a analyzována moč a stolice. Po 24 hodinách byly myši umístěny zpět do normálních klecí (T 2L (IVC), LASC, UZH).

Biochemická měřeníKoncentrace Naplus, Kplus, Ca2plus v moči byly analyzovány plamenovou fotometrií (EFOX 5053, Eppendorf). Koncentrace Mg 2 plus v moči a plazmě byly měřeny v Curyšském centru pro integrativní fyziologii hlodavců pomocí systému(ů) SYNCHRON LX ® , klinického systému UniCel ® DxC 800 Synchron ® a multikalibrátoru Synchron ® System. Kreatinin v moči byl měřen Jaffeho metodou. Koncentrace krevních plynů a iontů byly měřeny v heparinizované plné krvi pomocí analyzátoru krevních plynů ABL825Flex (radiometr) bezprostředně po odběru krve z duté žíly. Plazmatické hladiny aldosteronu a koncentrace uromodulinu v moči (UMOD) byly měřeny pomocí komerčně dostupných souprav ELISA (souprava Aldosterone ELISA od Cayman; #501090 a Mouse Uromodulin ELISA kit od Abcam; ab245726, v tomto pořadí).

Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (RT-qPCR)

RNA byla izolována z ledvin a distálního tračníku pomocí soupravy pro izolaci celkové RNA SV (PROMEGA). Stejné koncentrace izolované RNA (250 ng v 129Sv vs C57BL/6 nebo 500 ng v f/f, A/Δ a f/A) byly reverzně transkribovány do cDNA pomocí GoScript™ Reverse Transkriptase kit (PROMEGA). Vytvořené cDNA byly dále zředěny vodou bez DNAázy/RNázy (1:5). Primery byly navrženy pro kvantifikaci celkových Slc12a1, Slc12a3, Trpm6, Trpv5, Scnn1a, Scnn1b, Scnn1g a Kcnj1 (tabulka S3). Kvantitativní PCR analýza byla provedena za použití LightCycler® 480 (Roche) k měření hladin exprese genů, které jsou středem zájmu. Relativní genová exprese byla vypočtena pomocí metody delta Ct s použitím -aktinu jako referenčního genu.

Western blot analýzaLedviny byly homogenizovány v lyzačním pufru bez detergentu (DFLB) obsahujícím mannitol 200 mM, HEPES [4- (2- hydroxyethyl)- 1piperazinethansulfonová kyseliny] 80 mM, hydroxid draselný 41 mM, inhibitory proteázy (Complete Ultra, Roche) a inhibitory fosfatázy (PhosSTOP, Roche) s použitím 32 Magna Lyser Green Beads (Roche) v tkáňovém homogenizéru Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le- Bretonneux). Kuličky byly sedimentovány centrifugací po dobu 10 minut (1987 rcf) a supernatant obsahující protein byl uložen v alikvotech na jedno použití při -80 °C. Pro Western blot bylo 50 ug proteinu denaturováno v Laemmliho pufru, separováno SDS-PAGE s použitím 8% - 12 procent gelů a následně přeneseno na nitrocelulózové membrány. Nespecifická vazebná místa byla blokována pomocí 1x Odyssey Blocking Solution (Li-COR Biosciences) předtím, než byly membrány inkubovány s primárními protilátkami (tabulka S4) zředěnými v 0,2x Odyssey Blocking Solution při 4 stupních po dobu 12 hodin. Po promytí v PBS- 0.1% Tween byly membrány inkubovány se sekundárními protilátkami (kozí-anti-králičí IRDye 800 nebo kozí-anti-myší IR barvivo 680, 1:10'000, LI - COR Biosciences) zředěný v 0,1x pufru pro blokování kaseinu (Sigma). Detekované pásy byly vizualizovány infračerveným zobrazovacím systémem Odyssey (Li-COR Biosciences). Aby bylo zajištěno rovnoměrné nanesení proteinu, byly membrány před detekcí protilátek buď společně obarveny protilátkou proti - aktinu, nebo byl obarven celkový protein pomocí REVERT Total Protein Stain (Li-COR Biosciences). Imunoreaktivní pásy byly kvantifikovány na Fidži (ImageJ) a normalizovány proti - aktinovému signálu nebo barvení REVERT Total protein, v daném pořadí.

ImunohistochemieKryostatické řezy (tloušťka 4 µm) byly blokovány pro nespecifickou vazbu protilátek 10% normálním kozím sérem a následně inkubovány s primárními protilátkami (tabulka S4)

přes noc při 4 stupních. Po promytí 1X PBS byla sklíčka inkubována se sekundárními protilátkami (Cy3 – konjugovaný kozí-anti-králičí IgG, číslo produktu 111- 165- 144, 1:1000 a FITC – konjugovaný kozí-anti-myší IgG , číslo produktu 115- 095- 068, 1:100, oba od Jackson Immuno Research Laboratories) po dobu 2 hodin při pokojové teplotě. Všechny protilátky byly zředěny v 1% BSA/lxPBS. Buněčná jádra byla obarvena DAPI (4',6-diamidino- 2-fentyl-indol, Sigma-Aldrich, Co.) v koncentraci 0,1 ug/ml. Zobrazování bylo prováděno pomocí fluorescenčního mikroskopu Leica DM6000 B (Leica Microsystems, 35578) s fluorescenční monochromatickou digitální kamerou Leica DFC350 FX (Leica Microsystems, 35578). Snímky byly zpracovány na Fidži (ImageJ).

Vytvoření afinitně purifikované králičí-anti-myší pT96 NKCC2 protilátkyProdukce protilátek byla prováděna protilátkovou službou Pineda (Berlín, Německo). Králíci byli imunizováni fosfopeptidem obsahujícím aminokyseliny 105- 114 C57BL/6 myší NKCC2 sekvence (NH2- YYLQ(p) TMDAV-COOH). Monospecifická IgG frakce byla afinitně purifikována proti fosfopeptidu a následně preabsorbována s defosfopeptidem, což vedlo k frakci protilátky specifické pro fosfoformu. Protilátková specificita této frakce byla testována imunohistochemicky a analýzou Western blot (obrázek 5 a obrázek S4).

Léčba fosfatázouProteinové lyzáty byly inkubovány po dobu 1 hodiny při 37 stupních s telecí střevní alkalickou fosfatázou (CIAP) (1 U/1 µg proteinu), aby se indukovala hydrolýza 5'-fosfátových skupin fosforylovaných proteinů, která inhibovala specifickou vazbu pT96. NKCC2 protilátka k proteinům na nitrocelulózové membráně Western blot (obrázek 5B). Byly použity archivované ledviny zalité v parafínu z myší C57BL6. Ošetření řezů pomocí telecí střevní alkalické fosfatázy (Sigma Aldrich) bylo provedeno tak, jak bylo popsáno dříve, s menšími úpravami. 56 Po zablokování volných aldehydových skupin byly řezy pětkrát opláchnuty v alkalickém fosfatázovém pufru (100mm Tris, 50 µm CaCl2, 0,1 mm MgCl2, 8,4 µm leupeptin, 4 mm Pefablock, pH 9,0). Později byly řezy inkubovány v alkalickém fosfatázovém pufru s nebo bez telecí střevní alkalické fosfatázy (-130 jednotek/ml) v inkubátoru při 35 stupních po dobu 2 hodin. Následně byla podrobně provedena imunohistochemie a světelná mikroskopie. 57

Zarovnání sekvencí aminokyselinAminokyselinové sekvence pro různé druhy a myší kmeny byly získány z otevřené databáze "Ensembl Genome Browser" (www.ensem bl.org, Sanger Institute). 42 Zdroje ID přepisů jsou uvedeny v tabulce S1. Sekvence byly porovnány pomocí Qiagen © CLC Main Workbench 20.

Ledvinové plátkyledvinyplátky C57BL/6 myší byly použity pro ex vivo experimenty, jak bylo popsáno dříve. 12 Stručně řečeno, myši byly přes noc nalačno s volným přístupem k vodě, aby se zabránilo jakýmkoli potenciálním účinkům příjmu iontů z potravy na hladiny fosforylace NKCC2 a NCC. Ledviny byly odebrány zvířatům v anestezii, nakrájeny na 280 um silné plátky pomocí vibračního mikrokráječe (Vibratome, Microm; Thermo Scientific) a umístěny do Ringerova roztoku (v mM): 98,5 NaCl, 25 NaHC03, 3 KCl, 1 Na2 HPO4, 2,5 CaCl2, 1,8 MgCl2 a 25 % glukózy po dobu 30 minut při 30,5 stupních s konstantním probubláváním s 95 procenty O2 a 5 procenty C02. Následně byl Ringerův roztok nahrazen podobnými roztoky, ale s různými koncentracemi Cl − (5 mM pro nízký Cl −, 110 mM pro normální Cl −) a K plus (3 mM pro normální K plus, 10 mM pro vysoký K plus ) pro dalších 30 minut. Nakonec byly plátky rychle zmrazeny v kapalném dusíku.

StatistikaK porovnání dvou skupin byl použit nepárový Studentův t test a Welchův test v případě nestejných rozptylů (GraphPad Prism, verze 8.0.2). Pro vícenásobné srovnání byla provedena jednosměrná nebo dvoucestná ANOVA následovaná Tukeyho posttestem pro vícenásobné srovnání (GraphPad Prism, verze 8.0.2). Data jsou zobrazena jako průměr ± SEM (v tabulkách a obrázcích). Rozdíly byly považovány za významné, když P <>

PODĚKOVÁNÍ  Autoři děkují Dr. Gary Shullovi (University of Cincinnati, Cincinnait, OH) za poskytnutí myší NCC-KO, Dr. Biff Forbushovi (Yale School of Medicine, New Haven, CT) za jeho protilátku "R5" pNKCC1 a Dr. Henriku Dimke ( University of Southern Denmark, Odense, Dánsko) pro jeho myší monoklonální celkovou NCC protilátku. Autoři také děkují Monique Carrell a Inger Merete Paulsen za technickou pomoc a Dr Eszter Banki za poskytnutíledvinaVzorky. Měření minerální hustoty kostí a část analýzy moči a plazmy provedla Dr. Petra Seebeck a Nadine Nägele (Curyšská integrativní fyziologie hlodavců, Univerzita v Curychu). Vysoce oceňován byl velmi užitečný příspěvek Dr. Alicie McDonough (University of Southern California) a Dr. Oliviera Devuysta (University of Zurich).

KONFLIKT ZÁJMŮ Skupina JL dostává licenční poplatky za licencované protilátky proti NCC a fosforylovanému Nedd{0}} od Milipore a Abcam. Obě protilátky nebyly v současné studii použity. JL navíc obdržel v roce 2019 honorář od VIFOR za ústní prezentaci na sympoziu pořádaném VIFOR.