Srovnávací studie vlastností a mechanismu proti stárnutí: Resveratrol a omezení kalorií

ABSTRAKTNÍ

Resveratrol a kalorická restrikce (CR) jsou silné terapeutické možnostiproti stárnutí. Zde je jejich srovnávací účinek nagen spojený s dlouhověkostíregulátor umlčování informací (SIRT1) byl hodnocen in vitro a in vivo. Buňky IMR-90 ošetřené 2,2'-azobis (2-amidinopropan) dihydrochloridem (AAPH) byly aplikovány k vytvoření buněčného modelu stárnutí a byly použity krysy ošetřené D-galaktózou (D-gal). jako anstárnoucí zvířecí model. Resveratrol a CR vykazovaly podobnéaktivity proti stárnutí, o čemž svědčíinhibici stárnutí a apoptózy a obnovení kognitivního poškození a oxidačního poškození. Navíc mohliup-regulovat telomerázu(TE) činnost,zvýšit expresi SIRT1, forkhead box 3a (Foxo3a), aktivní regulátor SIRT1 (AROS) a Hu antigen R (HuR), ale snižuje p53 a deletuje hladiny rakoviny prsu 1 (DBC1). Ukázalo se však, že 10 μM resveratrol in vitro a skupina s vysokou dávkou in vivorelativně silnější aktivity anti-aging a stimulace hladin SIRT1 než CR. Na závěr, resveratrol a CR vykazovaly podobnéaktivity proti stárnutína signalizaci SIRT1,což naznačuje potenciál resveratrolu jako mimetika CR.

Kliknutím sem zjistíte bylinnou léčbu Cistanche proti stárnutí

ÚVOD

Zlepšení zdravotní péče pomohlo v posledních desetiletích prodloužit délku lidského života, a starší populace tak výrazně přibývá. Bohužel to stále znamená přibývající období špatného zdravotního stavu nebo invalidity. V současné době se ve většině rozvinutých zemí objevují různé nemoci související se stárnutím jako největší zdravotní hrozby. Přestože zatím není možné modifikovat naše genetické pozadí, v současnosti se objevují různé anti-aging strategie jako zdravý životní styl a terapeutické intervence, jejichž cílem je snížit výskyt rizikových faktorů špatného zdraví [1].

CR, snížený příjem kalorií bez podvýživy, je jedním z nejrobustnějších zásahů, které prodlužují životnost modelových organismů od kvasinek po primáty [2]. Mohl by chránit před zhoršováním biologických funkcí, snižovat výskyt a oddalovat nástup mnoha nemocí souvisejících s věkem. Mechanismus, kterým CR prodlužuje délku života, zahrnuje zpomalení růstu, redukci tělesného tuku, oddálení neuroendokrinních nebo imunologických změn, zvýšení opravných kapacit DNA, změněnou genovou expresi, zesílenou apoptózu, snížení tělesné teploty a snížení rychlosti metabolismu a zlepšení oxidačních procesů. stres [3]. Účinek CR proti stárnutí je silně spojen se zvýšenou hladinou a aktivací členů rodiny sirtuinů a také souvisí s dalšími molekulárními signálními cestami, včetně koaktivátoru receptoru G aktivovaného peroxisomovým proliferátorem- 1 (PGC{{ 6}}), adenosinmonofosfátem aktivovaná proteinkináza (AMPK), inzulín/inzulinový růstový faktor-1 a cíl rapamycinu [1, 4]. Většina lidí by však takový přísný dietní program nedodržela, zejména z dlouhodobého hlediska. Současný výzkum se proto stále více zaměřuje na stanovení proveditelnosti a účinnosti přírodních a/nebo farmakologických mimetických molekul/léčeb CR bez snížení spotřeby potravy [5].

Resveratrol je rostlinný polyfenol, který se běžně vyskytuje v různých rostlinách, včetně slupky hroznů, bobulí a arašídů. Je zajímavé, že začlenění resveratrolu do potravinových doplňků nebo potravin může být silnou terapeutickou možností pro boj proti stárnutí a několik zpráv naznačuje, že léčba resveratrolem má příznivé účinky podobné účinkům CR [6], což naznačuje potenciál resveratrolu jako mimetika CR. [4]. Nedávno bylo prokázáno, že resveratrol prodlužuje životnost prostřednictvím významného zvýšení aktivity SIRT1, což má za následek zvýšení afinity SIRT1 jak k NAD plus, tak k acetylovanému substrátu [7, 8], což je také odpovědné za dlouhověkost způsobenou CR. Ačkoli resveratrol a CR byly široce studovány pro jejich potenciální zdravotní přínosy, o jejich srovnávacích účincích je známo jen málo. V této studii jsme porovnávali účinek resveratrolu a CR proti stárnutí in vivo a in vitro pomocí detekce dráhy SIRT1.

VÝSLEDEK

Resveratrol a CR snížily barvení galaktozidázou asociované se stárnutím (SA-gal) v buňkách IMR-90 ošetřených AAPH

S využitím AAPH-indukovaného modelu stárnutí buněk IMR-90 jsme testovali možný účinek na barvení SA- -gal. Jak je znázorněno na obrázku 1, buňky ošetřené AAPH vykazovaly širší a silněji pozitivní barvení než kontrolní buňky a pozitivní barvení v kontrolních buňkách bylo relativně vzácné. Bylo zjištěno, že léčba resveratrolem (5 μM, 10 μM a 20 μM) nebo CR poskytuje výraznou ochranu při stárnutí vyvolaném AAPH. Navíc při srovnání účinku resveratrolu s CR vykazovaly buňky ošetřené 10 μM resveratrolem relativně méně často SA- -Gal pozitivní barvení než ošetření CR. Tyto výsledky tedy naznačují, že 10 μM resveratrol účinněji inhibuje senescenci vyvolanou AAPH než CR.

Analýza buněk IMR- 90 pomocí rastrovací elektronové mikroskopie

Výzkum rastrovací elektronové mikroskopie poskytl některé nové podrobnosti o struktuře buněk ošetřených AAPH (obrázek 2). Normální IMR-90 se jevil jako plně rozprostřené buňky s typickým vřetenovitým tvarem. Většina buněk obsahovala dva zužující se procesy a vykazovala několik váčků. Buňky ošetřené AAPH vykazovaly zvětšenou a zploštělou morfologii s četnými váčky. Na rozdíl od pozorování rastrovacím elektronovým mikroskopem vzorků IMR-90 ošetřených resveratrolem nebo CR po podání AAPH jasně ukázalo, že ačkoliv bylo možné detekovat některé váčky, normální vřetenovitý tvar byl obecně zachován spolu s plně rozprostřeným.

Resveratrol a CR snížily apoptózu u buněk IMR-90 ošetřených AAPH

Fosfatidylserin na povrchu buněk, považovaný za charakteristický znak apoptózy v časné fázi, byl stanoven testem barvení PI/Annexin V (obrázek 3). Apoptotické buňky se skládají jak z časných apoptotických buněk obarvených Annexinem-V-FITC, tak z pozdních apoptotických nebo nekrotických buněk obarvených Annexinem-V-FITC a PI. Populace apoptotických buněk se významně zvýšila ve skupině AAPH (34,54 procenta) ve srovnání s negativní skupinou (7,32 procenta). Zatímco bylo zjištěno, že léčba resveratrolem (5 μM, 10 μM a 20 μM) nebo CR snižuje apoptózu u buněk IMR-90 indukovaných AAPH. Navíc léčba 10 μM resveratrolem (11,58 procenta) účinněji snižovala apoptózu indukovanou AAPH než léčba CR (16,78 procenta).

Změna celkového vzhledu a tělesné hmotnosti

Během celého experimentu byl stárnoucím modelovým krysám podáván D-gal v dávce 200 mg/kg každý den a byl pozorován celkový vzhled. Ve srovnání s normálními kontrolními krysami se krysy v modelové skupině D-gal postupně staly apatickými, tupými a pomalými v reakci; vlasy modelových skupin postupně ztrácely elasticitu a stávaly se křehkými; kůže se postupně ztenčila, nepružila a ochabovala. Současná léčba resveratrolem nebo CR s D-gal u potkanů ​​však ukázala obrácení výše uvedených změn ve srovnání se skupinou D-gal. Během období léčby nebyl mezi experimentálními skupinami žádný rozdíl v tělesné hmotnosti, s výjimkou skupiny CR s téměř žádným nárůstem hmotnosti během experimentu (obrázek 4).

Resveratrol a CR zlepšily prostorové učení a paměť SD potkanů

Hodnotili jsme schopnost prostorového učení a paměti potkanů ​​provedením Morrisova testu vodního bludiště. Jak je znázorněno na obrázku 5, všech pět skupin se dokázalo úspěšně naučit úkol, o čemž svědčí postupně snižovaná úniková latence a zvýšená rychlost plavání ve 4 dnech fáze navigace místem. Při analýze dvoucestnou metodou ANOVA byly prokázány významné rozdíly jak v průměrné únikové latenci, tak v rychlosti plavání mezi tréninkovými dny (F(3,138)=41,660, P < 0. 01; F(3,138)=10.013, P < 0.01) a mezi ošetřeními (F(4,46) )=36.762, P < {{40}}.01; F(4,46)=20.102, P < 0,01, resp.), ale žádná interakce mezi faktory dnem a léčbou (F(12,138)=0,846, P > 0,05; F(12,138)=1,084, P > 0,05, v tomto pořadí). Úniková latence ve skupině D-gal byla výrazně delší než v kontrolní skupině (P < 0,01) (Post-hoc analýza, obrázek 5A). Mezitím potkani ve skupině resveratrol plus D-gal nebo skupině CR plus D-gal vykázali obrácení výše uvedených změn v únikové latenci ve srovnání se skupinou D-gal (P < 0,01) (obrázek 5A) a výrazně zkrátili únik latence na podobné úrovně jako u kontrolní skupiny. Podobné výsledky byly získány pro rychlost plavání krys (obrázek 5B) a krysy ve skupině resveratrol plus D-gal a skupině CR plus D-gal vykazovaly pozoruhodné zvýšení rychlosti plavání ve srovnání se skupinou D-gal (P < 0,01 ). Avšak krysy ve skupině s vysokou dávkou resveratrolu plus D-gal vykazovaly relativně delší únikovou latenci a nižší rychlost plavání ve srovnání se skupinou CR plus D-gal.

Obrázek 1: Resveratrol a kalorická restrikce snižují barvení SA- -gal v buňkách IMR-90 ošetřených AAPH. Buňky IMR- 90 indukované AAPH byly ošetřeny kalorickou restrikcí (CR) nebo resveratrolem (RES) v uvedené koncentraci po dobu 2 dnů. Zvětšení bylo 20×.

Obrázek 2: Analýza buněk IMR-90 pomocí rastrovací elektronové mikroskopie. Buňky IMR-90 indukované AAPH byly ošetřeny kalorickou restrikcí (CR) nebo resveratrolem (RES) v uvedené koncentraci po dobu 2 dnů. Zvětšení bylo 6000×.

Obrázek 3: Resveratrol (RES) a kalorická restrikce (CR) snížily apoptózu u buněk IMR-90 ošetřených AAPH. Buňky byly obarveny Annexinem V-FITC/PI a analyzovány průtokovou cytometrií. Kanál FL1 byl použit k detekci barvení annexinem-V-FITC a kanál FL2 byl použit k barvení PI

Ve fázi prostorové sondy (obrázky 5C a 5D) bylo vidět, že ve skupině D-gal došlo k významnému snížení překročení platformy ve srovnání s kontrolní skupinou (P < 0.{{6} }1). Je zajímavé, že průměrný počet případů, kdy krysy překročily platformu, se významně zlepšil po podání resveratrolu nebo CR ve srovnání se skupinou D-gal (P < 0,01). Nicméně krysy ve vysokých dávkách skupiny resveratrol plus D-gal přecházely přes platformu častěji než krysy ve skupině CR plus D-gal.

Tyto výsledky ukázaly, že stárnoucí modelové krysy měly poruchy v prostorovém učení a paměti, zatímco léčba resveratrolem nebo CR mohla obnovit kognitivní poruchu související s věkem způsobenou podáváním D-gal. Navíc stárnoucí modelové krysy léčené vysokou dávkou resveratrolu vykazovaly relativně vyšší účinnost na chování než krysy léčené CR.

Účinek resveratrolu a CR na hladiny SOD, T-AOC, MDA a lipofuscinu u stárnoucích potkanů

Hladiny SOD, T-AOC, MDA a lipofuscinu u potkanů ​​byly hodnoceny, aby se potvrdilo, zda anti-aging účinky resveratrolu a CR byly zprostředkovány zmírněním oxidačního stresu způsobeného podáváním D-gal. Tabulka 1 ukazuje hladiny SOD, T-AOC a MDA v séru, játrech a mozku u normálních a stárnoucích potkanů. Expozice D-gal významně snížila hladiny SOD a T-AOC, ale zvýšila hladinu MDA v séru, játrech a mozku ve srovnání s kontrolní skupinou (P < 0,05). Současná léčba resveratrolem nebo CR s D-gal u potkanů ​​způsobila snížení aktivity hladiny MDA, ale zvýšila hladiny SOD a T-AOC ve srovnání se skupinou D-gal. Ve srovnání s léčbou CR však výsledky ukázaly, že podávání vysoké dávky resveratrolu bylo relativně lepší.

Obrázek 4: Účinek resveratrolu a kalorické restrikce na tělesnou hmotnost krys ošetřených D-gal během experimentu. Všechny hodnoty byly vyjádřeny jako průměr ± SD. NG, negativní kontrolní skupina; MG, modelová kontrolní skupina; RESL, skupina s nízkou dávkou resveratrolu; RESH, skupina s vysokou dávkou resveratrolu; CR, kalorická restrikční skupina.

Obrázek 5: Účinek resveratrolu a kalorické restrikce na chování krys ošetřených D-gal s Morrisovým vodním bludištěm. (A) Porovnání latencí s platformou během 4 školicích dnů. Každá myš byla podrobena 4 pokusům denně. (B) Porovnání rychlosti plavání během 4 tréninkových dnů. (C) Porovnání počtu přejezdových plošin, kde byla plošina odstraněna pro zkušební zkoušku. (D) Typická plavecká dráha v testu sondy. Všechny hodnoty byly vyjádřeny jako průměr ± SD. * P < 0.05, **P < {{10}}.01 ve srovnání s negativní kontrolní skupinou; # P < 0,05, ##P < 0,01 ve srovnání s modelovou kontrolní skupinou. NG, negativní kontrolní skupina; MG, modelová kontrolní skupina; RESL, skupina s nízkou dávkou resveratrolu; RESH, skupina s vysokou dávkou resveratrolu; CR, kalorická restrikční skupina.

Tabulka 1: Stav antioxidantů ve tkáni a krvi krys v každé skupině

Poznámka: Hodnoty byly průměr ± SD. * P < {{0}}.05, **P < 0.01 ve srovnání s kontrolní skupinou (všechny skupiny); # P < 0,05, ##P < 0,01 ve srovnání s modelovou skupinou (skupina CR a skupina RES); ∆P < 0,05, ∆∆P < 0,01 ve srovnání se skupinou CR (skupina RES). NG, negativní kontrolní skupina; MG, modelová kontrolní skupina; RESL, skupina s nízkou dávkou resveratrolu; RESH, skupina s vysokou dávkou resveratrolu; CR, kalorická restrikční skupina.

je relativně lepší. Akumulace lipofuscinu je jedním z nejkonzistentnějších rysů stárnutí mozku. Jak je znázorněno na obrázku 6, potkani léčení D-gal vykazovali významné zvýšení hladiny lipofuscinu ve srovnání s kontrolní skupinou (P < 0.01). Léčba resveratrolem a CR však snížila akumulaci lipofuscinu v mozkové kůře stárnoucích potkanů ​​ve srovnání s potkany léčenými D-gal (P < 0,01). Navíc nebyly žádné rozdíly mezi skupinou resveratrol plus D-gal a skupinou CR plus D-gal (P > 0,05).

Resveratrol a CR up-regulovaly aktivitu telomerázy u stárnoucích potkanů

Hodnotili jsme vliv resveratrolu a CR na aktivitu telomerázy v jaterních a mozkových tkáních (obrázek 7). Naše výsledky ukázaly, že léčba neměla žádný významný vliv na aktivitu telomerázy v jaterních tkáních (P > 0.05). Aktivita telomerasy však byla snížena ve skupině s podáváním D-gal ve srovnání s kontrolou (P < 0,05). Mezitím by resveratrol nebo CR mohly zvýšit aktivitu telomerázy ve skupině s podáváním D-gal plus resveratrol nebo CR. Navíc nebyly žádné rozdíly mezi skupinou resveratrolu a skupinou CR (P > 0,05).

Obrázek 6: Účinek resveratrolu a kalorické restrikce na hladinu lipofuscinu u stárnoucích potkanů. Všechny hodnoty byly vyjádřeny jako průměr ± SD. * P < 0.05 ve srovnání s negativní kontrolní skupinou; # P < 0,05 ve srovnání s modelovou kontrolní skupinou. NG, negativní kontrolní skupina; MG, modelová kontrolní skupina; RESL, skupina s nízkou dávkou resveratrolu; RESH, skupina s vysokou dávkou resveratrolu; CR, kalorická restrikční skupina.

Resveratrol a CR zvýšily expresi SIRT1 mRNA indukované AAPH Abychom prozkoumali roli SIRT1 v léčebných účincích resveratrolu a CR, byly hladiny exprese SIRT1 mRNA v buňkách a tkáních IMR-90 vyšetřeny kvantitativní RT- v reálném čase PCR. Výsledky ukázaly, že exprese SIRT1 mRNA v IMR-90 buňkách byla významně snížena AAPH. Resveratrol a CR mohly účinně obnovit hladiny exprese SIRT1 mRNA v buňkách ošetřených AAPH a 10 μM resveratrolu byla optimální koncentrace pro stimulaci exprese SIRT1 mRNA v buňkách IMR-90 (P < 0,01; obrázek 8)