13-týdenní studie subchronické toxicity 2-(l-menthoxy)ethanolu u potkanů ​​F344

Úvod

2-(1-menthoxy)ethanol (CAS č. 38618-23-4) je čirá a bezbarvá kapalina s charakteristickým zápachem a je široce používána jako ochucovadlo. Společný výbor odborníků FAO/WHO pro potravinářská aditiva (JECFA) vyhodnotil 2-(l-methoxy)ethanol jako ochucovadlo, kategorizované jako látky strukturně příbuzné mentolu1. Na základě strukturní třídy aromatických látek, 2-(l-methoxy)etanol byl zařazen do třídy I. Ve Spojených státech a Evropě byly úrovně příjmu 2-(l-methoxy) etanolu u lidí byly odhadnuty na 12 ug/osoba/den a 0,01 ug/osoba/den, v tomto pořadí, v obou případech pod prahem třídy I 1 800 ug/osobu/den. Na základě těchto odhadů se má za to, že 2-(1-menthoxy)Ethanol nemusí představovat bezpečnostní riziko při běžném použití jako ochucovadlo.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg tělesné hmotnosti [BW])1. Navzdory použití 2-(1-menthoxy)ethanolu jako ochucovadla jsou k dispozici omezené údaje týkající se toxicity po opakovaném podávání této sloučeniny. Naše laboratoř zkoumala toxicitu několika potravinářských přídatných látek, včetně reprezentativních aromat z každé kategorie, na modelech hlodavců2–7. Abychom objasnili toxikologický profil a stanovili hladinu bez pozorovaného nepříznivého účinku (NOAEL), provedli jsme 13-týdenní studii subchronické toxicity 2-(1-menthoxy)ethanolu, který byl orálně podávané krysám F344 žaludeční sondou.

Materiály a metody

Testovaná chemikálie

2-(1-mentoxy)ethanol (šarže č. 5I0002, čistota 99,9 %) vyrábí společnost Takasago Int. Corp. (Tokio, Japonsko) poskytlo oddělení pro standardy a hodnocení, ministerstvo bezpečnosti potravin, ministerstvo zdravotnictví, práce a sociálních věcí, Japonsko, s podporou Japan Flavor & Fragrance Materials Association (Tokio, Japonsko). Ačkoli byla testovaná látka poskytnuta jako směs optických izomerů (CAS č. 38618-23-4), byla výrobcem potvrzena jako l-enantiomer (CAS č. 75443-64-0). Orální sonda s kukuřičným olejem (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonsko) jako vehikulum byla vybrána jako způsob podání vzhledem k nerozpustnosti ve vodě a těkavosti 2-(1-menthoxy)ethanolu. Roztoky 2-(1-menthoxy)ethanolu byly připravovány denně, bezprostředně před podáním. Po skladování po dobu 2 hodin při pokojové teplotě byly zbytkové poměry 2-(1-mentoxy) ethanolu v roztoku 4, 40 a 400 mg/ml potvrzeny jako 96,8 %, 99,8 % a 96,5 % , respektive plynovou chromatografií (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tokio, Japan).

Pokusná zvířata

Celkem bylo 40 samců a 40 samic potkanů ​​bez specifických patogenů (F344/DuCrlCrlj, 5 týdnů) zakoupeno od Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japonsko) a používáno po aklimatizaci po dobu jednoho týdne. Během studie byla zvířata chována v polykarbonátových klecích s měkkou čipovou podestýlkou, udržovaná v místnosti s bariérovým systémem pro kontrolu cyklu světlo/tma (12 h), ventilaci (rychlost výměny vzduchu 18x/h), teplotu ( 24 ± 1 stupeň) a relativní vlhkost (55 ± 5 %). Klece a podestýlka na čipy byly vyměňovány dvakrát týdně. Každé zvíře mělo volný přístup k vodě z vodovodu a základní dietě (CRF-1; Oriental Yeast, Tokio, Japan). Na začátku experimentu byla zvířata náhodně rozdělena do čtyř skupin po 10 krysích samcích a krysách na základě tělesné hmotnosti měřené bezprostředně před zahájením léčby testovanou chemickou látkou.

Studovat design

V předběžné {{0}}denní studii hodnotící 2-(1-menthoxy) ethanol podávaný v dávkách 0, 200, 400 a 800 mg/kg tělesné hmotnosti/ dne byly absolutní a relativní hmotnosti jater významně zvýšeny ve všech léčených skupinách obou pohlaví (data nejsou uvedena). Na základě těchto výsledků jsme vybrali dávky 2-(1-menthoxy) ethanolu 0, 15, 60 a 250 mg/kg tělesné hmotnosti/den pro podávání samcům i samičkám potkanů ​​v současné době {{ 13}}týdenní studie toxicity.

Celkový stav a mortalita byly hodnoceny denně. Tělesná hmotnost, stejně jako množství dodané a zbytkové stravy, byly měřeny jednou týdně během experimentálního období. Všechny krysy byly po dokončení léčby přes noc nalačno a vzorky krve pro hematologii a biochemii séra byly odebrány z břišní aorty v hluboké inhalační anestezii za použití isofluranu. Studie byla navržena podle Směrnice pro označování potravinářských přídatných látek a revize norem pro použití potravinářských přídatných látek z Japonska (1996) a schválena Výborem pro péči o zvířata a využití při Národním institutu zdravotnických věd v Japonsku.

Hematologie a biochemie séra

Následující hematologické parametry byly analyzovány pomocí automatických hematologických analyzátorů ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA): počet bílých krvinek (WBC), počet červených krvinek (RBC), koncentrace hemoglobinu (HGB), hematokrit (HCT), střední korpuskulární objem (MCV), střední korpuskulární hemoglobin (MCH), střední korpuskulární koncentrace hemoglobinu (MCHC), počet krevních destiček (PLT) a diferenciální leukocytární buňky, včetně neutrofilů (Neut), lymfocytů (Lymph), monocytů (Mono), eozinofilů (Eosino) a bazofily (Baso). Biochemická analýza séra byla provedena pomocí Oriental Yeast pro následující parametry: celkový protein (TP), albumin (Alb), poměr albumin/globulin (A/G), celkový bilirubin (Bil), glukóza, celkový cholesterol (T-Chol), triglyceridy (TG), močovinový dusík (BUN), kreatinin (Cre), vápník (Ca), anorganický fosfor (IP), sodík (Na), draslík (K), chlor (Cl), aspartátaminotransferáza (AST), alaninaminotransferáza (ALT), alkalická fosfatáza (ALP) a -glutamyltranspeptidáza (-GTP).

Hmotnosti orgánů a histopatologické hodnocení

U všech zvířat byla provedena kompletní pitva a byl zvážen mozek, brzlík, plíce, srdce, slezina, játra, nadledvinky, ledviny, varlata a vaječníky. Tyto orgány, stejně jako tkáně z míchy, trojklaného nervu, hypofýzy, nosní dutiny, slinných žláz, jazyka, jícnu, průdušnice, aorty, štítné žlázy, příštítných tělísek, slinivky břišní, žaludku, tenkého a tlustého střeva, submandibulární a mezenterické lymfatické uzliny, pochva, děloha, močový měchýř, prostata, semenné váčky, nadvarle, stehenní kost a hrudní kost s kostní dření, obratle, kosterní svaly, sedací nerv, kůže a mléčná žláza, byly fixovány v 10% neutrálně pufrovaném formalínu; poté byly připraveny řezy zalité v parafínu a obarveny hematoxylinem a eosinem pro histopatologické vyšetření. Varlata a oči s Harderovými žlázami byly fixovány v Bouinově fixativu a Davidsonově roztoku. Kostní tkáně, včetně nosní dutiny, obratlů, hrudní kosti a stehenní kosti, byly dekalcifikovány pomocí směsi 10% kyseliny mravenčí a 10% pufrovaného formalínu po dobu až 2 týdnů. Histopatologické hodnocení bylo provedeno pro všechny tkáně získané od zvířat v kontrolní skupině a skupině byla podávána nejvyšší dávka, pokud nebyly pozorovány žádné léze související s léčbou.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ IMUNITY PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Imunohistochemie pro 2u-globulin

U samců potkanů ​​byla akumulace 2u-globulinu v ledvinách zkoumána imunohistochemickou analýzou řezů zalitých v parafínu. Pro získání antigenu byly řezy získané od 5 krys v každé skupině inkubovány s proteinázou K (DAKO, Glostrup, Dánsko) po dobu 1 minuty při teplotě místnosti. Všechny řezy byly ponořeny do 3% roztoku H202/methanol na 10 minut při teplotě místnosti pro inaktivaci aktivity endogenní peroxidázy. Po zablokování nespecifických reakcí 10% normálním králičím sérem byly řezy inkubovány s primární protilátkou pro 2uglobulin (zředěnou 1:400; anti-krysí 2u-globulinová protilátka; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) přes noc při 4. stupni 8. Vizualizace vazby protilátky byla provedena pomocí soupravy VectaStain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) a 3,3'-diaminobenzidinu. Všechny řezy byly kontrastně obarveny hematoxylinem.

Statistická analýza

Rozdíly v hodnotách dat pro tělesnou hmotnost během experimentálního období, stejně jako pro hematologii, biochemii séra a hmotnosti orgánů, byly hodnoceny na homogenitu pomocí Bartlettova testu. Pro homogenní a heterogenní data byla použita jednocestná analýza rozptylu a Kruskal-Wallisův test. Při určování statisticky významných rozdílů byl použit Dunnettův mnohočetný srovnávací test pro srovnání kontrolní a léčené skupiny. Srovnání histopatologických incidencí a stupňů byla analyzována za použití Fisherova exaktního pravděpodobnostního testu a Mann-Whitneyho U testu, v daném pořadí. P hodnoty<0.05 were considered statistically significant.

Výsledek

Parametry během života, hematologie a biochemie séra

Během experimentálního období nebyly zaznamenány žádné významné klinické příznaky a všechna zvířata přežila až do plánované pitvy. Kromě toho nebyly u samců a samic potkanů ​​pozorovány žádné významné rozdíly v tělesné hmotnosti a denním příjmu potravy (obr. 1A a B).

Údaje o hematologii a biochemii séra jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2, v daném pořadí. Hematologické analýzy odhalily významně snížené HGB, HCT, MCV a MCH a zvýšené PLT u samců potkanů, kterým bylo podáváno 250 mg/kg tělesné hmotnosti/den 2-(1-menthoxy)ethanolu (tabulka 1). V biochemii séra bylo zaznamenáno významné zvýšení TP, T-Chol a Ca a snížení Bil a ALP u mužů ze skupiny 250 mg/kg (tabulka 2). Významné zvýšení Cre a snížení A/G bylo zaznamenáno u mužů ve skupinách 60 a 250 mg/kg. U žen bylo zaznamenáno významné zvýšení Ca a snížení ALP ve skupinách 60 a 250 mg/kg, zatímco zvýšené T-chol a snížené A/G, Bil, TG, AST a ALT byly detekovány u 250 mg /kg skupina. Přestože u samců, kterým byla podávána dávka 60 mg/kg, bylo pozorováno významné zvýšení TG a snížení Cl, absence jakéhokoli vztahu mezi dávkou naznačovala, že tyto rozdíly nebyly spojeny s expozicí testované látce.

Váhy orgánů

Údaje o hmotnosti orgánů jsou shrnuty v tabulce 3. Absolutní a relativní hmotnosti jater byly významně zvýšeny u obou pohlaví ve skupině s 250 mg/kg (tabulka 3). Významné zvýšení relativní hmotnosti jater bylo pozorováno u samců ve skupině 60 mg/kg. U mužů byla absolutní a relativní hmotnost ledvin významně zvýšena ve skupinách 60 a 250 mg/kg. Ve skupině mužů 250 mg/kg bylo zaznamenáno významné zvýšení absolutní a relativní hmotnosti nadledvin a relativní hmotnosti sleziny a varlat.

Histopatologie a imunohistochemie

Data pro histopatologické a imunohistochemické nálezy jsou shrnuta v tabulkách 4 a 5, v daném pořadí. Histopatologické nálezy odhalily, že frekvence akumulace eozinofilních granulí (obr. 2A–D), bazofilních tubulů a hyalinních odlitků, stejně jako fokální intersticiální zánět v ledvině, byla významně zvýšena u výhradně mužských léčebných skupin ve srovnání s kontrolou skupině (tabulka 4). Na základě imunohistochemických analýz vykazovali samci potkanů ​​léčených testovanou látkou zvýšení imunoreaktivity 2u-globulinu v epiteliálních buňkách proximálních tubulů, což prokázalo jasnou závislost na dávce (obr. 2E–H) (tabulka 5).

Při pitvě jeden krysí samec ve skupině 250 mg/kg vykazoval závažné zvětšení pravé ledviny v důsledku histologicky charakteristického nefroblastomu. Ačkoli nefroblastom je u většiny kmenů potkanů ​​neobvyklý9, tento případ byl považován za náhodný, protože žádné jiné zvíře nevykazovalo podobné léze. Kromě toho se ve studiích kancerogenity při perorálním podání výskyt spontánního nefroblastomu u samců potkanů ​​F344/DuCrlCrlj údajně pohyboval mezi 0–2,0 %10. Ačkoli několik lézí bylo sporadicky detekováno v jiných orgánech, nebyly patrné žádné významné na léčbě závislé změny ve výskytu těchto lézí.

Diskuse

K dnešnímu dni bylo JECFA vyhodnoceno 24 aromatických látek, včetně 2-(1-menthoxy) ethanolu, jako látky strukturálně příbuzné mentolu a všechny jsou na současných odhadovaných úrovních uvedeny jako „žádné bezpečnostní riziko“. příjmu1, 11. 2-(1-Mentoxy)ethanol je klasifikován v podskupině alicyklických alkoholů nebo etherů a je považován za primárně konjugovaný s kyselinou glukuronovou, po níž následuje vylučování močí1. Přestože jsou hodnoty LD50 těchto látek u hlodavců při perorálním podání relativně vysoké, údaje ze studií toxicity po opakovaném podávání zůstávají omezené. 13-týdenní studie toxicity po opakovaných dávkách odhalila, že mentylpyrrolidonkarboxylát (CAS č. 68127-22-0), sloučenina strukturně příbuzná mentolu, může být spojena se zvýšenou relativní hmotností jater a ledvin u mužů a žen Krysy Wistar. Akumulace 2u-globulinu v proximálních tubulech samců potkanů ​​byla také pozorována při dávce 1 111 mg/kg tělesné hmotnosti/den a NOAEL byla stanovena jako 109 mg/kg tělesné hmotnosti/den1.

V této 13-týdenní studii subchronické toxicity 2-(1-menthoxy)ethanolu nebyly pozorovány žádné toxikologické změny v celkovém stavu, tělesné hmotnosti a příjmu potravy. Po hematologickém vyšetření jsme pozorovali pokles HGB (96,6 % oproti středním hodnotám kontroly), HCT (96,3 %), MCV (98,4 %) a MCH (98,2 %) a zvýšení PLT (111 %) u mužů. 250 mg/kg, které byly považovány za toxikologické vlivy léčby 2-(1-mentoxy)ethanolem. Jak absolutní (115 % u obou pohlaví), tak relativní (119 % u mužů a 111 % u žen) hmotnosti jater byly významně zvýšeny u obou pohlaví ve skupinách s dávkou 250 mg/kg. Přestože v játrech nebyly žádné histopatologické změny, zvýšené hladiny T-chol v séru (110 % u mužů a 121 % u žen) a TP (105 % u mužů) a snížení TG (60,1 % u žen) u 250 mg/kg skupiny ukazují toxické změny spojené s metabolismem lipidů a syntézou proteinů v játrech. Bylo také zjištěno snížení HGB a MCH a zvýšené PLT, T-Chol a TP u mužů a snížené TG a zvýšení absolutní a relativní hmotnosti jater u obou pohlaví se statistickou významností v 28-denní předběžné studii (data nejsou uvedena ), což potvrzuje, že tyto změněné hematologické a biochemické parametry séra, stejně jako hmotnosti jater, nebyly náhodné, ale související s testovanou látkou. Naproti tomu významné zvýšení relativní hmotnosti jater zjištěné u mužů ve skupině 60 mg/kg v této studii nebylo doprovázeno zvýšením absolutních hmotností nebo změnami souvisejících biochemických parametrů, což naznačuje, že toto zvýšení bylo adaptivní změnou.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Významně zvýšená absolutní (120 %) a relativní (118 %) hmotnost nadledvin ve skupině samců 250 mg/kg byla považována za spojenou se zkoušenou chemickou látkou. Kromě toho zvýšená absolutní a relativní hmotnost nadledvin u obou pohlaví ukázala jasnou závislost na dávce v 28-denní předběžné studii (data nejsou uvedena), což ukazuje na souvislost s ošetřením testovanou chemickou látkou. Ačkoli hypertrofie nadledvin mohla být důsledkem stresu, v současných ani předběžných studiích nebyly zjištěny žádné nálezy naznačující stres, jako je snížený přírůstek tělesné hmotnosti nebo atrofie brzlíku a dalších lymfoidních orgánů. Vzhledem k tomu, že v případech inhibice enzymů souvisejících se steroidogenezí12 nemusí dojít k žádným histopatologickým změnám v nadledvinách ani při zhoršené produkci glukokortikoidů, nelze vyloučit možnost, že zvýšená hmotnost nadledvin je toxickým nálezem. Naproti tomu zvýšené relativní hmotnosti sleziny a varlat ve skupině samců 250 mg/kg, které nebyly pozorovány v předběžné studii, byly považovány za toxikologicky nevýznamné kvůli absenci histopatologických lézí nebo významně zvýšené absolutní hmotnosti. Podobně biochemie séra odhalila pokles A/G a zvýšení Ca u obou pohlaví, což bylo považováno za toxikologicky bezvýznamné, vzhledem k tomu, že nebyly zjištěny žádné abnormality v souvisejících parametrech. Navíc snížené hladiny Bil a ALP u obou pohlaví a snížené AST a ALT u žen byly v rozporu s očekávanými toxickými účinky a nebyly považovány za významné.

Chronická nefropatie charakterizovaná bazofilními tubuly, hyalinním útvarem a fokálním intersticiálním zánětem byla pozorována se statistickou významností u mužů ze všech léčených skupin. Kromě toho byla ve skupinách samců 60 a 250 mg/kg detekována zvýšená sérová hladina Cre a absolutní a relativní hmotnost ledvin; tyto změny nebyly pozorovány v léčebných skupinách žen. V těchto případech se stupeň akumulace eozinofilních granulí v buňkách proximálního tubulárního epitelu zvýšil zjevně závislým způsobem. Tyto granule byly imunohistochemicky potvrzeny jako 2u-globulin, což ukazuje na výskyt 2u-globulinové nefropatie. 2u-globuliny vázané na určité chemikálie, jako je d-limonen, se hromadí v lysozomech a jsou pozorovány v proximálních tubulech jako eozinofilní nebo hyalinní granule9. Tato akumulace může poškodit epiteliální buňky, což vede k chronické progresivní nefropatii a následné tvorbě nádorů9. Ačkoliv tedy NOAEL pro 2-(1-menthoxy)ethanol spojený s 2u-globulinovou nefropatií v ledvinách samců potkana nebyla identifikována, tento typ nefropatie je údajně specifický pro samce potkanů, a proto není relevantní pro člověka. hodnocení rizik13. Zvýšené riziko selhání ledvin zprostředkované mechanismy souvisejícími s akumulací 2u-globulinu je vysoce nepravděpodobné, protože tento protein u lidí chybí14. Proto bylo považováno za rozumné vyloučit ze stanovení NOAEL změny spojené s chronickou nefropatií pozorované u mužů.

Závěrem lze říci, že současná 13-týdenní studie subchronické toxicity prokázala, že léčba 250 mg/kg tělesné hmotnosti/den 2-(1-menthoxy) ethanolem způsobila toxické změny v hematologii, biochemii séra a hmotnosti orgánů u samců a samic potkanů ​​F344. Na základě pozorovaných výsledků, NOAEL 2-(1-menthoxy)ethanolubyla vyhodnocena jako 60 mg/kg tělesné hmotnosti/den pro obě pohlaví.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%