Jak vápník léčí poškození ledvin vyvolané fluoridem?

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

klíčová slova: Vápník, ledviny, Apoptóza

ABSTRAKTNÍ

Dlouhodobý nadměrný příjem fluoridu (F) může způsobit kostní i mimokostní poškození. Theledvinaje hlavním orgánem vylučujícím fluor v těle. Tato studie měla za cíl prozkoumat, zda dietnívápníksuplementace může zmírnitledvinaškody způsobené fluorózou a dále zkoumat její účinkyVápníko zmírňujícím mechanismuledvinabuňkaapoptózaspouštěné F. Hodnotili jsme histopatologickou strukturu,ledvinafunkční indikátory a hladiny genové a proteinové exprese zprostředkované receptorem smrtiapoptózadráhy u potkanů ​​Sprague Dawley (SD) léčených fluoridem sodným (NaF) a/nebovápníkuhličitanem (CaCO3) po dobu 120 dnů. Výsledky ukázaly, že 100 mg/l NaF indukovaloledvinahistopatologické poranění aapoptózazvýšili koncentrace kreatininu (CRE), kyseliny močové (UA), dusíku močoviny v krvi (BUN), draslíku (K), fosforu (P) a F (p < {{0}},05)="" a="" snížit="" hladinu="" sérového="" hořčíku="" (mg)="" (p="">< 0,05).="" kromě="" toho="" naf="" zvýšil="" hladiny="" exprese="" mrna="" a="" proteinů="" receptoru="" buněčné="" povrchové="" smrti="" fas="" (fas),="" tumor="" nekrotizujícího="" faktoru="" (tnf),="" souvisejícího="" s="">apoptóza-indukující ligand (TRAIL), kaspáza 8, kaspáza 3 a poly ADP-ribóza polymeráza (PARP) (p < 0.01),="" které="" nakonec="" aktivovaly="" dráhu="" receptoru="" smrti.="">Vápníksuplementace zvrátila pokles hladin CRE, BUN, UA, F a P vyvolaný F, zmírnila histopatologické poškození aapoptózaa snížily hladiny genové a proteinové exprese markerů souvisejících s dráhou receptoru smrti. Závěrem 1 procentoVápníkzmírňuje F-indukovanéledvinaapoptózaprostřednictvím signálních drah FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL.

Theledvinaje hlavním orgánem pro vylučování fluoru v tělecistanchemůže chránitledvinaa zlepšitledvinafunkce.

Úvod

Fluor je široce přítomen v půdě, vodě a potravinách. Některé přírodní faktory (zvětrávání minerálů a hornin, tvorbavápníka hořečnaté soli, infiltrace podzemních vod atd.) a lidské činnosti (průmyslové odpadní vody, agrochemikálie, výrobky pro domácnost atd.) způsobují znečištění životního prostředí fluorem (Daiwile et al., 2019). V současnosti je největším faktorem expozice fluoridu (F) pitná voda a doporučená koncentrace F v pitné vodě podle Světové zdravotnické organizace je nižší než 1,5 mg/l (Guidelines for Drinking-Water Quality, 2017). Epidemiologické důkazy naznačují, že vyšší než tato koncentrace zvyšuje riziko dentální fluorózy a zvyšující se koncentrace zvýší riziko skeletální fluorózy (Guidelines for Drinking-Water Quality, 2017; National Research Council, 2006). Dlouhodobé vystavení vysokým koncentracím fluoridu může zvýšit vstřebávání fluoru tělem dýchacími cestami

a trávicích traktech. Nadměrný příjem F může způsobit poškození kostních i nekostních orgánů těla. Poškození měkkých tkání mimo kost se obecně označuje jako nekostní poškození. V současnosti bylo zjištěno, že poškození nekostní tkáně způsobené F se týká trávicího traktu, jater,ledvina, mozek atd. (Jha et al., 2011; Perumal et al., 2013).

Theledvina, hlavní vylučovací orgán těla, je zodpovědný za metabolismus toxických látek a exogenních toxinů v těle. Studie uvádějí, že asi 50–80 procent fluoridů přijatých tělem je filtrováno a reabsorbovánoledvinya zbývající fluor se hromadí v jiných tkáních a orgánech (Chen et al., 2013; Dharmaratne, 2019). Mnoho druhů literatury prokázalo, že expozice 50 a 100 mg/LF může vést ke zvětšení dutiny pouzdra ledvin, atrofiiledvinatubulů, nepravidelné uspořádání papilárních buněk, zúžení lumen, což má za následekapoptózazledvinabuňky a zhoršení biochemických funkcí, jako je kreatinin (CRE), kyselina močová (UA),vápník(Ca) a fosfor (P) (Song a kol., 2014; HW Wang a kol., 2020; Wei a kol., 2018a).

Apoptóza, druh buněčné smrti řízené geny, která se dělí na endogenníapoptózaa exogenníapoptóza. Nedávné zprávy to ukázalyapoptózazpůsobená vysokým F zahrnuje především mitochondrie zprostředkované, endoplazmatické retikulum je zprostředkované stresem a dráhy zprostředkované receptorem smrti (Wei et al., 2018a). Předchozí experimenty v naší skupině poukázaly na to, že NaF indukuje kosti a játraapoptózaprostřednictvím dráhy intracelulárního endoplazmatického retikula (ER) a mitochondriální dráhy (Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019). Kromě toho studie také ukázaly, že mitochondriální dráha je zapojena do indukce NaFapoptózamyšiledviny(Wei et al., 2018b). Neexistuje však žádná systematická studie o dráze zprostředkované receptorem smrti u F-indukovanýchledvinaapoptóza. Dráha receptoru smrti dominuje v každém stádiu exogenníhoapoptóza, včetně dráhy receptoru buněčné povrchové smrti Fas (FAS), dráhy tumor nekrotizujícího faktoru (TNF) a související s TNFapoptóza- dráha indukujícího ligandu (TRAIL) (Grunert et al., 2012; Lu et al., 2017; Wang a Su, 2018). Dráha FAS je primitivní systém přenosu signálu, který zprostředkováváapoptóza. FAS má vlastnosti membránového receptoru a po navázání s FAS ligandem (FAS-L) tvoří trimer. Poté se specifická doména trimeru váže s doménou smrti (DD) odpovídající konexinové molekuly proteinu domény smrti spojeného s FAS (FADD) za vzniku signálního komplexu vyvolaného smrtí (DISC) (Wang a Su, 2018). V následujícím procesu transdukce biologického signálu může FADD aktivovat kaspázu 8 a rodinu kaspáz současně a nakonec vést kapoptózaprostřednictvím účasti kaspázy 3 a efektu poly ADP-ribóza polymerázy (PARP) (Kischkel et al., 2000; Meynier a Rieux-Laucat, 2019). Nedávné studie ukázaly, že dráha FAS zprostředkováváapoptózav T buňkách a běhemledvinaselhání vyvolané cisplatinou (Djiadeu et al., 2017; Linkermann et al., 2011). Kromě toho studie také uvedla, že NaF indukujeapoptózau myší cestou FAS (Sun et al., 2017). TRAIL je uznávaný cytokin v superrodině TNF. Váže se na své homologní agonistické receptory, jmenovitě na receptory smrti (DR4 a DR5). V jeho buněčné oblasti je DD. DD je nezbytný pro nábor adaptivního proteinu FADD. FADD zase indukuje uvolňování kaspáz do cytoplazmy, aktivovaná kaspáza 3 štěpí PARP a inhibuje její opravný potenciál DNA, což vede kapoptóza(Bodmer a kol., 2000; Micheau, 2018). Bylo naznačeno, že dráha TRAIL/DR5 je zapojena do indukce NaFapoptózau myší (Song et al., 2021). Osteoprotegerin (OPG) je volný rozpustný receptor, který postrádá transmembránovou doménu. Může omezit TRAIL-zprostředkovanéapoptózainhibicí vazby TRAIL a dalších receptorů smrti (Duiker et al., 2006; Kiraz et al., 2016; Micheau, 2018). Vazba TNF a TNF receptoru (TNF-R1) může aktivovat nábor proteinu TNFR-associated death domain (TRADD) prostřednictvím jeho DD. Poté TRADD interaguje s FADD, což vede k náboru pro-kaspázy 8, která je štěpena na aktivní kaspázu 8 proteolytickými enzymy. Kaspáza 8 pak aktivuje kaspázu 3, která je zodpovědná za buňkuapoptóza(Kiraz a kol., 2016; Sedger a McDermott, 2014). Uvádí se, že NaF indukuje hepatocytyapoptózau myší prostřednictvím signální dráhy TNF-R1 (Lu et al., 2017)

Vápníkhraje různé role ve složení kostí a zubů a může také řídit nervový přenos a uvolňování materiálu (Cao et al., 2016), podílet se na systémovémvápníkhomeostáza (Carmeliet et al., 2003; Yang et al., 2016), změna propustnosti membrán (Lappe et al., 2017), aktivace sekrece různých enzymů a hormonů (Kim et al., 2012) atd. Mnoho předchozích studií zjistilo, že F a Ca mají v biologii antagonistický účinek (Dure-Smith et al., 1996; Nobrega et al., 2019). Jakmile je F absorbován tělem, vstoupí do krve a vytvoří nerozpustné sraženiny CaF2. Pokud je přísun vápníku nedostatečný a vápník v krvi nedosahuje náležité hladiny, dochází k patologickým změnám, jako je hypokalcémie a osteolýza, takže doplněk stravy s vápníkem hraje důležitou roli v prevenci a zlepšení fluorózy (Dure-Smith et al., 1996; Li a kol., 2021; Yang a kol., 2021). Naše skupina to potvrdila dietněvápníkmůže zmírnitapoptózakosti a jater prostřednictvím signální dráhy PI3K-AKT, dráhy ER a mitochondriální dráhy (Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019; Yang et al., 2021). Za účelem dalšího prokázání, zdaVápníkzmírňuje nefrotoxicitu F prostřednictvím receptoru smrti zprostředkovanéapoptózajsme vytvořili potkaní model diety s vysokým obsahem fluoridůvápníka vyhodnotililedvinaindex zranění, stupeňapoptózaa změny exprese markerového genu a proteinu v receptoru smrti zprostředkovanéapoptózacesta.

Materiály a metody

Chemikálie a nástroje

Destilovaná voda byla připravena systémem čištění vody Heal Force (Shanghai, Čína). Lyzační pufr pro radioimunoprecipitační test (RIPA) a fluorid sodný (NaF) poskytla společnost Sigma-Aldrich (Shanghai, Čína). 10procentní formalín, glycin, dodecylsulfát sodný (SDS), TRIS, fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), CaCO3, nitrocelulózová (NC) membrána, souprava bicinchoninová kyselina (BCA) a souprava pro barvení hematoxylin-eosin (H&E) byly získány od společnosti Solarbio Technology Co. ., Ltd. (Peking, Čína). Činidlo Trizol bylo získáno od společnosti Takara Biological Engineering Company (Dalian, Čína). Soupravy CRE, UA, dusík močoviny v krvi (BUN), hořčík (Mg), P a draslík (K) byly zakoupeny od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína). In situapoptózadetekční souprava, králičí polyklonální protilátka FAS (BA0484) a králičí polyklonální protilátka FAS-L (PB0042) byly zakoupeny od společnosti Boster Biotechnology (Wuhan, Čína). -aktin králičí polyklonální protilátka (20536-1-AP), FADD králičí polyklonální protilátka (14906-1-AP), králičí polyklonální protilátka kaspáza 8 (13423-1-AP), králičí polyklonální protilátka kaspáza 3 ({{9 }}AP) a HRPconjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H plus L) (SA00001–2) byly získány od Proteintech Group (Wuhan, Čína). Králičí polyklonální protilátka TRAL (bs-1214R), králičí polyklonální protilátka TNF alfa (bs2081R), králičí polyklonální protilátka PARP (bs-55164R) byly zakoupeny od společnosti Bioss (Peking, Čína). Elektrochemická luminiscence (ECL) a 3,3'-diaminobenzidin (DAB) byly zakoupeny od KeyGen Biotech (Jiangsu, Čína). PrimeScript® RT Master Mix a SYBR® Premix Ex Taq™ II Kit poskytla společnost Promega Biotechnology (Peking, Čína).

Zvířata a léčba

Čtyřicet zdravých {{0}}týdenních samců krys Sprague-Dawley (SD) (120 ± 20 g) bylo získáno z Experimental Animal Center of Shanxi Medical University (Shanxi, Čína). Potkani byli aklimatizováni po dobu jednoho týdne, náhodně rozděleni do čtyř skupin (10 potkanů ​​na skupinu): kontrolní skupina (C), skupina NaF (F), skupina NaF plus 0,5 procenta CaCO3 (F plus 0,5 procenta Ca), NaF plus 1 procento Skupina CaCO3 (F plus 1 procentoVápník) a ošetřeny jako v tabulce 1. Všechny krysy byly umístěny v plastových klecích při 22–25 ◦C (55 ± 5 procent vlhkosti, 12 h cyklus světlo/tma), strava a pitná voda jsou volně přístupné.

Po 17 týdnech chovu krysy hladověly po dobu 24 hodin a voda byla volně k pití. Poté byly krysy anestetizovány pentobarbitalem sodným a utraceny cervikální dislokací poté, co byla odebrána krev z očních bulv. Část krve byla odebrána do zkumavek obsahujících antikoagulační heparin sodný pro BUN test. Část krve byla vložena do běžných zkumavek, umístěna při pokojové teplotě po dobu 2 hodin a poté centrifugována při 3000 ot./min po dobu 10 minut, aby se oddělilo sérum. Sérum bylo separováno pro testy CRE, UA, Mg, P, K a F. Osm vzorkůledvinyz každé skupiny byly náhodně vybrány a rychle zmraženy v kapalném dusíku a poté skladovány při -80 ◦C pro qRT-PCR a experimenty western blotting. Ostatní vzorkyledvinybyly fixovány v 10% formalínu pro histopatologické vyšetření a experimenty s terminálním deoxynukleotidyltransferázou zprostředkované dUTP nick end labeling (TUNEL). Všechny experimentální operace související se zvířaty byly přísně prováděny podle předpisů Instituce péče o zvířata a Výboru pro použití Zemědělské univerzity Shanxi, Shanxi, Čína.

ledvinysoučinitel

Nejprve byly zváženy krysy; pakledvinatkáň byla odebrána a zvážena. Theledvinakoeficient byl získán podle následujícího vzorce.

ledvinykoeficient=[ledvinavlhká hmotnost (g) / tělesná hmotnost (g)] ×100 procent .

Histopatologické vyšetření

ledvinyvzorky byly zality v parafínu. Řez (5 μm tloušťka) zledvinabylo obarveno H&E. Poté byla sklíčka pozorována pomocí světelného mikroskopu (Olympus, Tokio, Japonsko). Závažnostledvinazranění bylo posuzováno podle histopatologického skóre.ledvinytubulární poranění je definováno jakoledvinaatrofované a deformované krvinky,ledvinakapsle dutina rozšířena,ledvinatubuly tvoří odlitek a epiteliální buňky odpadávají. Při 200násobném zvětšení byla k hodnocení stupně poškození jater použita následující kritéria. 1: 0–25 procent poškození; 2: 25–50 procent poškození; 3: 50–75 procent poškození; 4: 75–100 procent poškození (Baranova et al., 2016).

Stanoveníledvinasouvisející ukazatele

Hladina F byla měřena F iontově specifickou elektrodou (Quadri et al., 2018). Hladiny CRE, UA, BUN, Mg, P a K byly měřeny pomocí komerčně dostupných souprav. Všechny související postupy byly provedeny podle pokynů výrobce.

Detekceapoptózaúroveň od TUNEL

Aby bylo možné kvantifikovatapoptózavledvinaExperimentální analýza byla provedena za použití situapoptózadetekční souprava. Theledvinařezy byly deparafinizovány a poté podrobeny štěpení pomocí proteinázy K. Terminální deoxynukleotidyltransferáza může označit digoxinem značený dUTP (DIG-dUTP) na 3'-OH konec a DIG-dUTP se váže na zlomový bod DNA po reakci s biomarkerem anti -dig-Biotin. V kombinaci s DAB bylo přidáno zobrazení. Pro vizualizaci

všechna jádra byly řezy kontrastně obarveny hematoxylinem. Tmavě hnědé signály označují pozitivní buňky a modré značí nereagující buňky. Theapoptózaindex byl vypočten podle následujícího vzorce.

Podíl apoptotických buněk=(počet apoptotických buněk na uzel / celkový počet buněk na uzel) × 100 procent .

Kvantitativní PCR v reálném čase (qRT-PCR)

Celková RNA zledvinabyl extrahován pomocí činidla Trizol. Ke kontrole kvality a množství RNA jsme použili ND{{0}} spektrofotometr (nano-drop, USA) a elektroforézu na agarózovém gelu. Reverzní transkripce (RT) byla provedena na 500 ng celkové RNA pomocí PrimeScript® RT Master Mix. Specifické primery pro -aktin a FAS, TRAIL, TNF a další geny byly navrženy softwarem Primer Premier 7.0 (tabulka 2) a syntetizovány společností Sangon Biotech (Shanghai, Čína). Pro RT-PCR byl použit systém Quantstudio 7 flex real-time PCR (thermo-fisher, USA) a SYBR® Premix Ex Taq™ II Kit. Reakční objem PCR byl 20 μl a podmínky RT-PCR byly: 95 ◦C 10

min, 40 cyklů 95 ◦C 15 s, 55 ◦C 30 s, 72 ◦C 30 s a nakonec jeden cyklus 95 ◦C 15 s, 60 ◦C 15 s, 95 ◦C 15 s. Všechny reakce se opakovaly třikrát. K výpočtu relativních hladin exprese mRNA byla použita metoda relativní 2-ΔACt a jako kalibrátor byl použit -aktin. V tomto procesu je rozdíl účinnosti menší než 5 procent.

Celková extrakce proteinů a analýza westernovým přenosem

Theledvinatkáň byla promyta PBS, vysušena filtračním papírem a rozložena v RIPA lýze (obsahující PMSF), při 12, 000 rpm/min, 4^◦C po dobu 10 min. Koncentrace proteinu byla stanovena pomocí soupravy Bicinchoninic Acid (BCA) Kit (Solarbio Science & Technology, Peking, Čína). Vzorek 35 ng proteinu byl úspěšně extrahován a separován na 8% SDS-polyakrylamidovém gelu elektroforézou. Cílový protein byl přenesen na NC membránu a NC membrána byla blokována 5% odtučněným mlékem při pokojové teplotě po dobu 2 hodin. Poté byla membrána NC inkubována s primárními protilátkami -actin (1:1000), TRAIL (1:500), FAS (1:500), FAS-L (1:100), TNF (1:500), FADD (1:500), kaspáza 8 (1:500), kaspáza 3 (1:500) a PARP (1:1000) při 4 stupních přes noc. Po trojnásobném promytí PBST byla membrána NC inkubována s HRP-konjugovanými sekundárními kozími anti-králičími IgG protilátkami (1:2000) při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. ECL byla použita k vizualizaci pásů cílového proteinu. Optická hustota byla vypočtena softwarem AlphaView (verze: 3.2.2.0) na systému FluorChem Q (Alpha Innotech, CA, USA).

Statistická analýza

K uspořádání a analýze experimentálních dat byl použit software GraphPadPrism{{0}} a každá data byla reprezentována průměrem ± SEM. Významnost rozdílu mezi průměry byla stanovena analýzou rozptylu (ANOVA) následovanou Tukeyho testem, přičemž P < 0,05="" bylo="" považováno="" za="">

Výsledek

Změny vledvinaukazatele koeficientu a biochemické funkce

Theledvinakoeficientu a hladin F, CRE, BUN, UA, Mg, P, K je znázorněn na obr. 1. Ve srovnání se skupinou Cledvinakoeficient byl významně snížen ve skupině F (p < 0,05).="" nicméně,="" ledvinový="" koeficient="" v="" f="" plus="" 1="">Vápníkskupina vykázala významný nárůst ve srovnání se skupinou F (p < {{0}}.05).="" hladina="" f="" ve="" skupině="" f="" byla="" výrazně="" vyšší="" než="" ve="" skupině="" c="" (p="">< 0,001).="" je="" zajímavé,="" že="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" f="" byla="" hladina="" f="" ve="" skupině="" f="" plus="" 1="" procento="" ca="" významně="" snížena="" (p=""><>

CRE, BUN a UA byly hodnoceny tak, aby odrážely stupeňledvinapoškození a funkční změny. Úrovně CRE, BUN a UA byly výrazně zvýšené ve skupině F ve srovnání s úrovněmi ve skupině C (p < 0,05),="" avšak="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" f="" byly="" výše="" uvedené="" tři="" indikátory="" pozoruhodně="" klesl="" v="" f="" plus="" 1="">Vápníkskupina (p < 0.05).="" mg,="" p="" a="" k="" byly="" indikátory="" elektrolytů="" úzce="">ledvinafunkce. Ve srovnání se skupinou C byla hladina sérového Mg významně snížena, hladiny P a K byly dramaticky zvýšeny ve skupině F (p < 0,05).="" přesto="" přidává="" 1="">vápníkk dietě výrazně zvýšily hladiny Mg v séru o 15,3 procenta (p < 0.05)="" a="" výrazně="" snížily="" hladiny="" p="" v="" séru="" o="" 16,9="" procenta="" (p="">< 0,05).="" obsah="" séra="" k="" vykazoval="" klesající="" trend="" bez="" významnosti="" po="" léčbě="" doplněním="" 1="" procenta="">

Změny vledvinamorfologie

Morfologické změnyledvinatkáně byly vyšetřeny H&E (obr. 2I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ). Ve skupině C,ledvinatubulární buňky byly kompaktně uspořádány, morfologie byla pravidelná a morfologie glomerulů byla intaktní. Hranice mezi buňkami však byly nejasnéledvinakrvinky byly atrofovány a deformoványledvinakapsle dutina rozšířena,ledvinatubuly vytvořily odlitek a epiteliální buňky se ve skupině F oddělily. V porovnání se skupinou F s nárůstem oVápníksoustředění, uspořádáníledvinabuňky se postupně staly uspořádanějšími, morfologieledvinakrvinky se postupně zotavovaly a stupeň poranění se postupně zmírňoval. Kromě toho jsme vyhodnotili poškození pomocíledvinaskóre (obr. 2Ⅴ). Skóre skupiny F bylo významně vyšší než skóre skupiny C (p < 0,01);="" nicméně="" skóre="" v="" f="" plus="" 1="">Vápníkskupina se výrazně snížila ve srovnání se skupinou F (p < 0,05).

TUNEL detekujeledvinabuňkaapoptóza

Provedli jsme test TUNEL, abychom zjistili a analyzovali, zdaledvinabuňky prošlyapoptózav této studii (obr. 3I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ).ledvinytkáně ve skupině C byly úhledně uspořádány, s méně apoptotickými buňkami (4,67 ± 1,15 procenta). Skupina F vykazovala velký počet TUNEL-pozitivníchledvinatubulárních epiteliálních buněk (48,17 ± 3,94 procent). Naproti tomu F plus 1 procentoVápníkskupina vykazovala dramatický pokles v počtu TUNEL-pozitivních buněk (28,83 ± 4,81 procent) (obr. 3Ⅴ).

ÚčinkyVápníkna F-indukované změny v genech souvisejících s dráhou receptoru smrti

Relativní úrovně exprese mRNA upstream faktorů souvisejících s receptorem smrti zprostředkovanýmapoptózadráhy (TRAIL, DR5, TNF, TNFR1, TNF-R2, FAS, FAS-L, OPG) byly odhaleny na obr. 4a. V porovnání se skupinou C byly hladiny exprese mRNA TRAIL, DR5, TNF, TNF-R1, TNFR2, FAS a FAS-L výrazně zvýšeny u potkanů ​​ošetřených F (p < 0,01).="" naproti="" tomu="" relativní="" exprese="" mrna="" trail,="" tnf,="" tnf-r2,="" fas="" a="" fas-l="" byly="" výrazně="" sníženy="" v="" f="" plus="" 1="">Vápníkskupina ve srovnání se skupinou F (p < {{0}}.05).="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" c="" byl="" pozorován="" zřejmý="" pokles="" hladin="" mrna="" exprese="" opg="" ve="" skupině="" f="" (p="">< 0,01).="" nicméně,="" vzhledem="" ke="" skupině="" f,="" opg="" v="" f="">Vápníkpočet skupin se zvýšil. Následné faktory FADD, TRADD, kaspáza 8, kaspáza 3 a relativní hladiny exprese mRNA PARP byly ukázány na obr. 4b. Proteinové exprese FADD, TRADD, kaspázy 8, kaspázy 3 a PARP byly zjevně zvýšeny ve skupině F ve srovnání se skupinou C (p < 0,01),="" ale="" byly="" zjevně="" sníženy="" ve="" skupině="" f="">Vápníkskupiny ve srovnání se skupinou F (p < 0,05).

ÚčinkyVápníkna F-indukované změny vapoptóza-příbuzné proteiny

Proteinová exprese TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, kaspáza 8, kaspáza 3 a PARP byla detekována pomocí Western blotu (obr. 5a, b). Ve srovnání se skupinou C byly proteinové exprese TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, kaspázy 8, kaspázy 3 a PARP ve skupině F výrazně zvýšené (p < 0,01).="" proteinové="" exprese="" všech="" výše="" uvedených="" faktorů="" byly="" výrazně="" sníženy="" v="" f="" plus="" 1="">Vápníkskupina ve srovnání se skupinou F (p < 0,05).

Diskuse

Nejnovější důkazy prokázaly, že F může způsobit léze měkkých tkání a stupeň poškození F závisí na koncentraci F, době expozice a typu orgánu (Wei et al., 2019). V této studii bylo použito 100 mg/l NaF po dobu 17 týdnů k vytvoření zvířecího modelu subakutní expozice NaF v pitné vodě. Dávkování NaF se volí podle stupně znečištění F v prostředí a nejistých faktorů různých druhů. Vzhledem k tomu, že přirozená koncentrace F- naměřená v místní podzemní vodě je asi 4,5 mg/l, byla destilovaná voda se 100 mg/l NaF použitá v této studii (koncentrace F- je asi 45 mg/l) vypočtena podle neurčitého faktoru pro extrapolace ze zvířete na člověka na 10 (Guidelines for Drinking-Water Quality, 2017; Mukherjee and Singh, 2021; Wen et al., 2013; Zhang et al., 2020). První studie zjistily, že dietnívápníkmůže ovlivnit vstřebávání fluoru, podporovat vylučování fluoru v těle, snižovat rychlost absorpce fluoru a tím snižovat toxicitu F (Harrison et al., 1984; Larsen et al., 1981). Naše nedávné experimentální studie ukázaly, že Ca zmírňuje poškození kostí a jater indukované F inhibicí vnitřní dráhyapoptóza(Li a kol., 2021; J. Wang a kol., 2020; Wang a kol., 2019). Výzkum ochranného účinku Ca na F-indukovanou nefrotoxicitu a související mechanismus je však dosud bezprecedentní. Zde uvádíme, že Ca zmírňuje F-indukovanéledvinapoškození. Kromě toho jsme také zjistili, že Ca reverzuje F-indukovanéledvinabuňkaapoptózapřes receptor smrti zprostředkovanýapoptózadráha (FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL dráhy). Dlouhodobá akumulace F vledvinamůže vést k poškození struktury tkáně a funkčnímu poškození. V této studii jsme zjistili, že expozice NaF způsobilaledvinabuňkaapoptózau potkanů ​​doprovázené glomerulární atrofií a deformací,ledvinarozšíření dutiny kapsle,ledvinatubuly tvoří odlitky a epiteliální buňky odpadávají. Nicméně,ledvinapoškození bylo významně zmírněno po doplnění 1 procenta Ca. Tyto výsledky byly podobné výsledkům získaným v předchozích zprávách (Cao et al., 2015; HW Wang et al., 2020).

CRE je metabolit svalu, UA je konečný produkt metabolismu purinů a BUN je hlavní konečný produkt metabolismu bílkovin v těle, který je vylučován glomerulární filtrací a obvykle se používá k detekciledvinafunkce (Myers a kol., 2006; HW Wang a kol., 2020). Biochemický průzkum vysoké F oblasti ukázal, že glomerulární filtrace byla významně snížena a F, UA a BUN se významně změnily (Malin et al., 2019). Testy na zvířatech ukázaly, že sérum CRE,Vápníka koncentrace P byly významně sníženy u myší vystavených 100 mg/l NaF, což naznačuje, že F narušilledvinafunkce a také metabolismus Ca a P (HW Wang et al., 2020). F-indukovaná nefrotoxicita souvisí sledvinadysfunkce. Kdyžledvinafunkce se zhoršuje, vylučování F v těle se snižuje, což vede k nadměrné akumulaci fluoru vledvinaa zhoršující F toxicitu (Kido et al., 2017). Kdyžledvinyjsou těžce postiženi,

vylučování F v moči klesá a koncentrace F v séru se dále zvyšuje (Dharmaratne, 2019). V této studii jsme pozorovali, že hladiny BUN a sérového CRE, UA, P, K u potkanů ​​léčených 100 mg/l NaF významně vzrostly, což naznačuje, že vysoká expozice F způsobila změnyledvinabiochemické ukazatele u potkanů ​​a vedly kledvinanedostatečnost. Dále jsme také poukázali na to, že různé ukazateleledvinabývají normální poVápníksuplementace. Ukazuje, že Ca (zejména 1 procentoVápník) má významný zmírňující účinek na F-indukovanéledvinapoškození u potkanů.

Cistanchemůže pomoci sledvinapoškození.

Apoptózaje autonomní a uspořádaná buněčná smrt řízená geny, která se vyznačuje degradací DNA bez zjevné buněčné lýzy. Tato studie zjistila, že fluoróza způsobilaledvinabuňkaapoptózau krys. FAS hraje hlavní roli ve výskytuapoptózaa různé nemoci. Nedávná literatura odhalila, že FAS zprostředkováváapoptózavledvinaindukované ischemií-reperfuzí a lidskými leukocytyapoptózaindukované N-nitrosodimethylaminem (Iwaniuk et al., 2019; Xu

a kol., 2019). Když se FAS a FAS-L spojí za vzniku trimeru, spustí se proapoptotický signál. Nedávná studie ukázala, že F indukuje buňkyapoptózaprostřednictvím dráhy FAS/FAS-L (Xu et al., 2011). V této studii F významně zvýšil expresi mRNA a proteinu FAS a FAS-L vledvina. Up-regulace hladin FAS a FAS-L naznačuje, že apoptotické dráhy související s FAS/FAS-L se mohou podílet na F-indukovanýchapoptóza. Rekrutování trimeru FAS/FAS-L FADD vede ke štěpení pro-kaspázy 8 za vzniku aktivní kaspázy 8, která následně aktivuje kaspázu 3 a následně vede kapoptóza(Li a kol., 2011; Xu a kol., 2011). Tato studie potvrdila, že 100 mg/l NaF indukujeapoptózau krysyledvinycestou FAS/FAS-L. Nejdůležitějším výsledkem je, že suplementace Ca ve stravě zeslabujeapoptóza-indukční účinek F, který je připisován down-regulaci aktivace FAS/FAS-L a sekundární aktivaci kaspáz.

TNF je pleiotropní cytokin, který se účastní široké škály buněčných reakcí, včetně diferenciace, proliferace, zánětu a buněčné smrti. Signál TNF spouští obojíapoptózaa antiapoptotické dráhy. Mnoho druhů literatury uvádí, že TNF dominuje indukované lipopolysacharidyledvinapoškození a cisplatinou vyvolané akutníledvinazranění (Lee et al., 2016; Li et al., 2018). TNF se váže na TNF-R1, jeho DD rekrutuje TRADD a poté TRADD interaguje s FADD, což vede k vytvoření DISC (Kiraz et al., 2016; Sun et al., 2003). Studie odhalily, že F může indukovat játra, neurony aledvinaleukocytapoptózaprostřednictvím signální dráhy TNF (Lu et al., 2017; Singh et al., 2017; Yan et al., 2016). Podobně jako u výsledků těchto zpráv byly relativní exprese TNF, TNF-R1, TNF-R2 a TRADD ve skupině F v tomto experimentu významně zvýšeny. Naproti tomu exprese těchto genů po 1 procentu významně pokleslaVápníkdoplněk, navrhující zásah zVápníkv dráze TNF.

TRAIL se podílí na regulaciapoptóza, proliferace, imunitní-zánětlivá reakce atd. V současnosti se má za to, že TRAIL úzce souvisí s výskytem a prognózouledvinanemoc (Candido, 2014). Stále více literatury potvrzuje, že TRAIL regulujeapoptózazledvinatubulárních epiteliálních buněk u glomerulonefritidy spojené s HBV aledvinaapoptózav souvislosti s uromodulinemledvinaonemocnění (Johnson et al., 2017; Yang et al., 2018). Dále studie uvádí, že exprese TRAIL byla obecně změněna během homeostázy a různéledvinazranění (Devarapu et al., 2017). TRAIL se váže na receptor smrti DR5 a rekrutuje FADD prostřednictvím interakce DD a poté se váže na pro-kaspázu 8 prostřednictvím domény účinku smrti existující v FADD za vzniku DISC (Yuan et al., 2018). Tato studie ukázala, že exprese TRAIL a DR5 byla významně zvýšena ve skupině F. Po doplnění sVápníkexprese TRAIL a DR5 byla inhibována. To se navrhujeVápníkinhibuje dráhu TRAIL ke snížení F-indukovanéapoptóza.

Závěr

Expozice 100 mg/l NaF aktivovala receptorem smrti zprostředkovanouapoptózadráha (FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL dráhy) a poté indukovanáledvinabuňkaapoptózau potkanů, což způsobujeledvinametabolické poruchy aledvinanedostatečnost, což má za následekledvinakrvinky byly atrofovány a deformoványledvinakapsle dutina rozšířena,ledvinatubuly tvořily odlitek. Nicméně přidání 1 procentaVápníkk dietě snížil obsah fluoru v krvi, dále zmírnilledvinametabolická porucha aledvinanedostatečnost cestou zprostředkovanou receptorem smrti a významně snížilaledvinazranění (součást Obr. 6).

Reference

Zdrojem je Haojie Li, College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, PR China atd.