Široce cílená metabolomická analýza k odhalení mechanismu transformace aktivních sloučenin Cistanche Deserticola během procesů napařování a sušení

Cistanche deserticola je jednou z nejcennějších rostlin, tradičně jako čínská medicína, a v poslední době se používá ve farmaceutickém a zdravém potravinářském průmyslu. Napařování a sušení jsou dva důležité kroky při zpracování Cistanche deserticola.

Bohužel komplexní pochopení změn chemického složení Cistanche deserticola během tepelného zpracování je omezené. V této studii byla použita široce cílená metabolomická analýza založená na ultravýkonné kapalinové chromatografii a tandemové hmotnostní spektrometrii (UHPLC-MS/MS) ke zkoumání transformačního mechanismu aktivních sloučenin Cistanche deserticola během procesů napařování a sušení. Během tepelného zpracování bylo v Cistanche deserticola identifikováno celkem 776 metabolitů, z nichž 77 bylo regulováno odlišně (p < 0,05), z nichž 39 bylo regulováno směrem nahoru (UR) a 38 bylo regulováno směrem dolů (DR). Během vaření v páře bylo identifikováno 47 (17 UR, 30 DR) a 30 (22 UR, 8 DR) rozdílných metabolitů.

Největší variace chemikálií byla pozorována během procesu napařování. Analýza metabolických cest ukázala, že během napařování byla pozorována biosyntéza fenylpropanoidů, flavonoidů a metabolismus alaninu, zatímco během sušení byl pozorován metabolismus glycinu, serinu a threoninu, metabolismus thiaminu a biosyntéza nenasycených mastných kyselin. Možné mechanismy chemických změn během tepelného zpracování také poskytla analýza dráhy Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Kromě toho ke zčernání vzhledu Cistanche deserticola docházelo především ve fázi vaření v páře, nikoli ve fázi sušení, což je spojeno s metabolismem aminokyselin. Všechny výsledky naznačovaly, že k tvorbě aktivních látek při zpracování Cistanche deserticola docházelo hlavně ve fázi napařování.

click cistanche tubulosa doplňkové účinky produkty

ÚVOD

Cistanche deserticola, patřící do čeledi Orobanchaceae, je jedním z nejznámějších posilujících léků a je distribuován především v tropických a subtropických oblastech světa, jako je Čína, Írán, Indie, Mongolsko a tak dále (1–3). Cistanche deserticola slouží jako jeden z nejčastěji používaných rostlinných léků k léčbě ledvinové nedostatečnosti, impotence, ženské neplodnosti, chorobné leukorey, profuzní metroragie a senilu (4, 5). Moderní farmakologický výzkum ukázal, že Cistanche deserticola má účinky na zlepšení imunity, proti únavě, proti stárnutí a na zlepšení schopnosti učení a zapamatování (6). Díky těmto zdravotním přínosům byl čaj Cistanche deserticola vyrobený z jeho stonkových hlíz vyvinut jako doplněk výživy a je spotřebiteli stále více oblíben. Za jeho léčivé funkce jsou zodpovědné aktivní složky Cistanche deserticola (7). Některé účinné látky v Cistanche deserticola, jako jsou fenylpropanoidy (například fenylethanoidové glykosidy), flavonoidy, polysacharidy, oligosacharidy, iridoidy a lignany, byly popsány v předchozích studiích (6, 8).

Vzhledem k tomu, že se kazí a sezónní vlastnosti, celoroční nabídka čerstvé Cistanche deserticola je nedostupná, a proto se hlavní konzumní formou stává zpracovaná Cistanche deserticola. Kvalita Cistanche deserticola závisí na mnoha faktorech, jako je klima, stanoviště, hostitelé, doba sklizně, technologie zpracování a poloha rostliny, mezi nimiž je technologie zpracování obzvláště důležitá (4). Napařování a sušení jsou dva důležité kroky při zpracování Cistanche deserticola. Obvykle se sklizený oddenek Cistanche deserticola napařoval v páře při 93 °C po dobu 30 minut a poté se sušil při 60 °C do obsahu vlhkosti 10 procent na mokré bázi (wb) (9).

Předchozí studie ukázaly, že vaření v páře může podporovat akumulaci aktivních složek v Cistanche deserticola, jako jsou fenylethanoidní glykosidy, rozpustné cukry a polysacharidy, doprovázené zčernáním vzhledové barvy (9–11). Většina předchozích studií se však zaměřovala na určité specifické sloučeniny a velmi vzácný výzkum se týká změn všech chemických sloučenin a mechanismu přeměny metabolitů během zpracování. Proto je nutné objasnit změny metabolitů Cistanche deserticola v různých fázích zpracování.

Metabolomika je obvykle aplikována na kvalitativní a kvantitativní analýzu všech malých molekul (zejména cílených a necílených sloučenin) detekovaných ve vzorku (12). Analýza změn různých chemických složek během zpracování potravin pomáhá prohloubit porozumění mechanismu přeměny chemických složek při zpracování potravin (12). V posledních letech byla metabolomika aplikována také na studium Cistanche deserticola pro rozlišení různých částí (11) a různých druhů Cistanche deserticola (13).

Metody detekce metabolitů v těchto studiích byly většinou založeny na cílené a necílené metabolomice. Mezi nimi je cílená metabolomika založena na standardních produktech s vysokou přesností a spolehlivostí dat, avšak s omezeným pokrytím metabolitů. Cílená metabolomika je důležitou součástí metabolomického výzkumu, jde o cílenou a specifickou detekci a analýzu specifických skupin metabolitů, spíše než všech složek ve vzorku. Necílená metabolomická technologie může kvalitativně určit metabolity na základě existujících databází, s vysokým pokrytím sloučenin, avšak s nízkou přesností. Klíčové metabolity musí být potvrzeny standardními produkty (14). Široce cílená metabolomika je nová technologie, která integruje výhody necílových a cílených technologií detekce metabolitů k dosažení širokého pokrytí, vysoké propustnosti a citlivosti (15).

V důsledku toho byla tato technologie široce používána při studiu změn složek v různých materiálech během zpracování, jako jsou aktivní složky ve funkčních potravinách různými metodami zpracování (16), sloučeniny flavonoidů a fenylpropanoidů v čínském vodním kaštanu zpracovaném různými metodami (17). , mechanismus žloutnutí rýže během procesu žloutnutí (18) a mechanismus tvorby charakteristických netěkavých chemikálií, které tvoří během procesu výroby čaje oolong (19). Proto je teoreticky možné využít široce cílenou metabolitovou technologii ke studiu mechanismu přeměny účinných látek při zpracování Cistanche deserticola.

Cílem této studie tedy bylo (1) poskytnout užitečné informace o chemických změnách v Cistanche deserticola během procesů napařování a sušení pomocí ultravýkonné kapalinové chromatografie-tandemové hmotnostní spektrometrie (UHPLC-MS/MS) v kombinaci s široce cílenou metabolomickou přístup; (2) identifikovat rozdílné metabolity a pravidla jejich regulace a odhalit možné cesty konverze v Cistanche deserticola během zpracování. Očekává se proto, že tato studie poskytne teoretický odkaz na mechanismus tvorby vysoce kvalitní Cistanche deserticola.

MATERIÁLY A METODY Materiály a chemikálie

Suroviny: Čerstvé vzorky Cistanche deserticola byly získány z oblasti Hetian v provincii Xinjiang v Číně. Vzorky byly pečlivě vybrány se stejnou velikostí (průměrná délka, průměr a hmotnost byly 11,7 ± 1,1 cm, 7.0 ± 1,1 cm, respektive 360 ​​± 8,9 g). Vzorky byly skladovány při pokojové teplotě v tmavém prostředí s počátečním obsahem vlhkosti asi 78,56 procenta ± 3,47 procenta. Před experimenty byly vzorky Cistanche deserticola omyty vodou z vodovodu, aby se odstranil prach na povrchu. Přebytečná voda na jejím povrchu byla odstraněna savým papírem.

Chemikálie: Methanol, acetonitril a kyselina mravenčí byly čistoty pro kapalinovou chromatografii s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) a byly zakoupeny od společnosti Merck (Sigma Aldrich, MO, USA). Ostatní analytické standardy vykazovaly čistotu vyšší než 98 procent (Sigma Aldrich, MO, USA).

Experimentální design

Předchozí studie ukázaly, že chemické sloučeniny se distribuují nerovnoměrně v podélném směru Cistanche deserticola (1). Proto, aby se získal stejný počáteční obsah chemických sloučenin v každém vzorku, v tomto výzkumu byly všechny vybrané Cistanche deserticola nakrájeny na tři stejné části pro čerstvou skupinu (A), dušená bez sušení skupina (B) a sušena po vaření v páře. (C), respektive podélnou segmentací s podélnou osou symetrie jako středem (20).

Pro skupinu B byly vzorky postupně napařovány po dobu 8 minut podle předběžných experimentů. Pulzní vakuové napařovací zařízení (vlastně vyvinuté Čínskou zemědělskou univerzitou, Peking, Čína) bylo použito pro úpravu čerstvých dezertikol Cistanche v páře. Napařené vzorky byly sušeny ve vakuové lyofilizační sušičce (LGJ-25C, Si Huan Scientific Instrument Factory Co., Peking, Čína). Teploty topné desky byly 30 a −60◦C. Pro skupinu C byly vzorky postupně napařovány pomocí pulzního vakuového zařízení po dobu 8 minut a sušeny v horkovzdušné nárazové sušárně (samovyvinutý China Agricultural University, Peking, Čína) až do konečného obsahu vlhkosti 10 procent (wb). Rychlost proudění vzduchu a teplota byly nastaveny na 6 m/s, respektive 60◦C, s odkazem na výsledky výzkumu Zou et al. (11). Všechny vzorky byly skladovány při -20◦C ne déle než 7 dní před další analýzou.

Stanovení barvy vzhledu Cistanche Deserticola

Barva vzhledu Cistanche deserticola před a po každém tepelném zpracování byla měřena pomocí kolorimetru (SMY2000SF, Shengming Yang Co., Peking, Čína) a černost byla charakterizována hodnotou L ∗.

Příprava a extrakce vzorků

Extrakce metabolitu byla provedena podle metody popsané dříve Chen et al. (21) s několika drobnými úpravami. Stručně řečeno, vysušené vzorky byly drceny pomocí míchacího mlýnu (MM 40}0, Retsch Company, Haan, Německo) s kuličkami zirkonia po dobu 2 minut při 60 Hz. Poté bylo 50 mg prášku (prosátého přes síto 65 mesh) každého vzorku přesně zváženo, přeneseno do Eppendorfovy zkumavky a extrahováno 1 ml směsi methanol/voda (v:v=3:1). Po 30 s vortexu byla směs dvakrát homogenizována při 35 Hz po dobu 4 minut, sonikována po dobu 15 minut v lázni led-voda a poté třepána přes noc při 4 °C. Po centrifugaci při 12,000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut při 4°C byl supernatant shromážděn a zfiltrován přes 0,{20}}µm membránu, poté byl získaný extrakt přenesen do 2ml skleněných lahviček a uložen při -80°C až do analýzy UHPLC-MS/MS.

Analýza metabolitů za podmínek UHPLC-MS UHPLC

Separace UHPLC byla provedena pomocí systému EXIONLC (Sciex Technologies, Framingham, MA, USA). Analytické podmínky byly následující: kolona: Waters ACQUITY UHPLC HSS T3 C18 (1,8 um, 2,1 x 1 00 mm); systém rozpouštědel: mobilní fáze A (0,1 procenta kyseliny mravenčí ve vodě) a mobilní fáze B (obsahující acetonitril). Gradientový program: 98 procent A/2 procent B v 0 min, 50 procent A/50 procent B v 10 min, 5 procent A/95 procent B v 11 min, 98 procent A/2 procent B v 13,1 min a 98 procenta A/2 procenta B po 15 min. průtok: 0,40 ml/min; teplota kolony: 40◦C; injekční objem: 2 ul; teplota automatického vstřikování: 4◦C.

Podmínky ESI-QTRAP-MS/MS

Pro MS byl použit trojitý kvadrupólový (QQQ)-lineární hmotnostní spektrometr iontové pasti (QTRAP, API 6500 QTRAP UHPLC-MS/MS) plus spektrometr QQQ vybavený ESI turbo iontovým rozprašovacím rozhraním (Sciex Technologies, Framingham, MA, USA). analýza. Analytické podmínky byly následující: napětí iontového spreje: plus 5 500 V (režim kladných iontů)/-4 500 V (režim záporných iontů), clonový plyn: 35 psi, teplota zdroje: 400 °C, plyn zdroje iontů 1: 60 psi, iontový zdroj plyn 2: 60 psi, potenciál deklastrování: ±100 V. QQQ skeny byly získány jako experimenty s monitorováním více reakcí (MRM) s kolizní plyn (dusík) nastavený na 5 psi.

Kvalitativní a kvantitativní analýza metabolitů

Kvalitativní a kvantitativní analýzy metabolitů byly provedeny podle metod Liu et al. (18). Primární a sekundární data hmotnostní spektrometrie byla kvalitativně analyzována na základě vlastní databáze lidských metabolomů (MWDB) (Metware Biotechnology Co., Ltd. Wuhan, Čína) a veřejné databáze. Mezitím byly pro zajištění přesnosti kvalitativní analýzy některých látek odstraněny interference z opakovaných signálů Na plus, NH plus 4, K plus a iontů a opakující se signály fragmentových iontů odvozených od jiných relativně velkých molekul a izotopových signálů. identifikace. Strukturní analýza metabolitů byla provedena u veřejných databází (Mass Bank, KNApSAcK, HMDB, MoTo DB a METLIN).

Kvantifikace metabolitů byla provedena pomocí MRM módu QQQ hmotnostní spektrometrie. V režimu MRM byly prekurzorové ionty (rodičovské ionty) cílových látek a vyloučené ionty odpovídající jiným látkám s různou molekulovou hmotností nejprve screenovány pomocí kvadrupólové tyče, aby se zpočátku eliminovala interference. Prekurzorové ionty pak prorazí kolizní komorou a po ionizaci vytvoří mnoho fragmentových želez, které byly filtrovány pomocí QQQ, aby se vybraly jednotlivé fragmentové ionty s požadovanými charakteristikami a zároveň eliminovaly interference necílových iontů. Nakonec, po získání údajů hmotnostní spektrometrie metabolitů různých vzorků, byly vrcholy hmotnostního spektra všech látek integrovány a vrcholy hmotnostního spektra stejného metabolitu v různých vzorcích byly integrovány a opraveny pomocí Multi Quant verze 3.0 .2 (ABSCIEX, Concord, Ontario, Kanada). Odpovídající relativní obsahy metabolitů byly reprezentovány jako integrály plochy píku chromatografie.

Zpracování a analýza dat

Metabolická data byla zpracována pomocí ortogonální parciální diskriminační analýzy nejmenších čtverců (OPLS-DA) a hierarchické shlukové analýzy (HCA). OPLS-DA byl použit k rozlišení každé skupiny; je citlivější než jiné statistické metody na proměnné s nízkou korelací (17). Modely OPLS-DA byly ověřeny pomocí permutační analýzy (200krát). Model byl považován za stabilní, když parametry modelu (R2 a Q2) byly oba blízké 1.

Byly vypočteny hodnoty projekce proměnné důležitosti (VIP) metabolitů. Jakýkoli metabolit s hodnotami VIP většími než 1.0 a hodnotami p menšími než 0,05 byly vybrány jako biomarkery pro každé párové srovnání mezi různými fázemi tepelného zpracování Cistanche deserticola. Screening různých metabolitů byl vizualizován ve formě sopečného grafu. Akumulace metabolitů mezi různými vzorky byla analyzována pomocí balíčku R (www.rproject.org/). Vennův diagram byl sestaven podle webového programu Smart diagram R (https://cloud.smartdraw.com/). Komerční databáze, jako je Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (https: //www.kegg.jp/kegg/), Pub Chem (https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/), Small Molecule Pathway Database (SMPDB) (https://smpdb.ca/) a HMDB (https://hmdb.ca/) byly použity pro analýzu obohacení různých metabolitů a nalezení metabolických drah.

VÝSLEDKY A DISKUSE Vzhled Barevné změny Cistanche Deserticola během tepelného zpracování

Rozdíl ve vzhledové barvě Cistanche deserticola mezi čerstvými, napařenými a sušenými vzorky je reprezentativní znázorněn na obrázku 1. Od čerstvých vzorků po sušené vzorky se během fáze zpracování změnila barva vzhledu vzorků ze žlutohnědé na tmavě černou. a tma v barvě byla stále zřetelnější (odpovídající hodnota L ∗ byla snížena z 50,26 na 24,90). Ke změnám vzhledu Cistanche deserticola došlo hlavně v procesu vaření v páře. Maillardova reakce, během níž cukry reagují s aminokyselinami za tepelných podmínek (22), by byla velmi zodpovědná za tmavě zbarvený vzhled zpracovaných oddenků Cistanche deserticola. Předchozí výzkumné studie ukázaly, že prekurzory byly přeměněny na barviva a generovány látky s tmavou barvou v Maillardově reakci (23). Podobné nálezy byly také pozorovány v předchozích studiích pro napařování Polygonum multiflorum (24) a oddenky Polygonatum cystoma (25). Tmavost napařených vzorků se po vysušení dále prohloubila. Tento jev byl pravděpodobně způsoben výskytem poklesu koncentrace pigmentu během procesu sušení.

Přehled metabolitů v surových a tepelně zpracovaných vzorcích Cistanche Deserticola

Celkový iontový chromatogram (TIC) vzorku kontroly kvality (QC) (směs všech zkoumaných vzorků) a graf vícepíkové detekce chemikálií v režimu MRM stejného vzorku jsou znázorněny na doplňkovém obrázku 1. Znázorněné různé barevné píky různé složky ve vzorku. Jak je znázorněno na obrázku 2, v současné studii (doplňková tabulka 1) bylo v čerstvých vzorcích Cistanche deserticola identifikováno celkové množství 776 metabolitů, které byly rozděleny do 15 tříd, včetně 40 aminokyselin a derivátů, 33 fenylpropanoidů, 23 flavonoidů, 68 flavonů, 67 terpenů, 67 fenolů, 87 alkaloidů, 13 sacharidů, 28 nukleotidů a derivátů, 5 alkoholů a polyolů, 3 purinové nukleosidy, 15

karboxylové kyseliny a jejich deriváty, 14 organických kyselin a derivátů, 12 fytohormonů a 28 dalších chemikálií. Mezi nimi největší skupinu tvořily aminokyseliny a deriváty, jejichž relativní obsah tvořil 30,26 procenta celkového složení metabolitů. Dále bylo detekováno 10 druhů fenylethanoidních glykosidů, jako je echinakosid a verbascosid, které byly zařazeny do skupiny fenylpropanoidů.

Vzorec akumulace metabolitů mezi různými léčebnými skupinami byl analyzován pomocí HCA. Jak ukazuje obrázek 3, 107 identifikovaných metabolitů Cistanche deserticola bylo seskupeno v tepelných mapách založených na euklidovské aritmetice vzdálenosti. Metabolity identifikované v různých fázích tepelného zpracování byly shromážděny do tří shluků podle dendrogramu. Jasnější barva indikuje vyšší obsah konkrétního metabolitu v příslušném vzorku. Tepelná mapa HCA ukázala větší rozdíly v množství mezi čerstvými a napařenými vzorky než mezi vzorky napařenými a sušenými, což naznačuje, že metabolity v Cistanche deserticola mohou mít různé transformace během fáze vaření v páře a sušení a typy a množství metabolitů zahrnutých v proces napařování je více než proces sušení.

Diferenciální metabolitová analýza Cistanche Deserticola v různých fázích tepelného zpracování

Pro lepší pochopení dopadu každého zpracování na metabolity Cistanche deserticolas jsou skóre OPLS-DA rozptylových skupin párových srovnávacích skupin zobrazena na obrázku 4A, což ukazuje, že čerstvé, dušené a sušené po napařování byly výrazně odlišné. Navíc R2Y a Q2 (jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 2) s vysokými testovacími hodnotami naznačovaly, že tento model byl vysoce spolehlivý bez nadměrného vybavení.

Pro screening úrovně exprese metabolitů mezi čerstvou, dušenou a sušenou po napařování Cistanche deserticola byla analýza sopečného grafu dále použita u všech 776 metabolitů identifikovaných podle násobné změny v kombinaci s VIP hodnotami pro screening odlišně exprimovaných metabolity. Významné rozdílné metabolity byly vybrány podle kritéria, že násobek změn skóre větší nebo rovné 2 nebo menší nebo rovné 0,5 s VIP větším nebo rovným 1. Výsledky screeningu jsou znázorněny na Obrázek 4B. Na vulkanické mapě každý bod představuje metabolit a barva rozptýlených bodů představuje konečný výsledek screeningu. Červená představuje metabolity, které jsou významně upregulované (UR), zelená představuje ty, které jsou významně downregulované (DR) a šedá představuje ty, které jsou nevýznamně odlišné. Jak ukazuje obrázek 4B, 47 metabolitů ve skupině čerstvé vs. dušené (17 UR a 30 DR), 30 metabolitů ve skupině dušené vs. sušené (22 UR a 8 DR) a 65 metabolitů ve skupině čerstvé vs. (29 UR a 36 DR) byly vybrány jako významně rozdílné. Počet významně odlišných metabolitů ve skupině čerstvé vs. dušené byl vyšší než počet ve skupině dušené vs. sušené, což ukazuje, že vliv na metabolity v procesu vaření v páře je vyšší než v procesu sušení.

Rozdílné metabolity produkované během tepelného zpracování Cistanche deserticola byly dále klasifikovány a porovnány. Tyto odlišně exprimované metabolity byly klasifikovány do 21 tříd, především aminokyseliny a jejich deriváty, flavonoidy a jejich deriváty, fenylpropanoidy, alkaloidy, terpeny, fenoly a nukleotid a jejich deriváty (tabulka 1). Ve skupině čerstvé vs. dušené lze zjistit, že flavonoidy (jako je isoquercitrin, troxerutin, kyandin a fisetin), fenylpropanoidy (jako je kyselina chlorogenová a 3-(3,4-dihydroxy{ {5}}methoxy)-2-propenová kyselina) a nukleotid a jejich deriváty (uracil a beta-nikotinamid mononukleotid) byly významně DR, zatímco aminokyseliny a jejich deriváty (jako je N6-acetyl-L-lysin , 1- methyl-L-histidin a L-fenylalanin) byly významně UR.

Avšak ve skupině dušené vs. sušené byly trendy exprese těchto typů rozdílných metabolitů opačné. Některé amino a jejich deriváty (jako N, N-dimethylglycin), nukleotidy a jejich deriváty (jako 2'-Deoxyuridin; Deoxyuridin) byly významně DR, zatímco většina fenolů (jako je methylgalát a 4'-Prenyloxyresveratrol), flavonoidy (jako isoquercitrin a kyanidin), fenylpropanoidy (verbaskosid) a terpeny (jako terpinolen a furanon) byly významně UR. Tyto výsledky ukázaly, že chemické složení Cistanche deserticola prošlo během tepelného zpracování přeměnou, která se projevuje především přeměnou flavonoidů, fenylpropanoidů a aminokyselin, přičemž mechanismus přeměny těchto složek je v různých fázích zpracování odlišný.

Již dříve bylo zjištěno, že použití vysoké teploty během procesu napařování a sušení podporuje hydrolýzu, redox, izomeraci, substituci a další termofyzikální a chemické reakce metabolitů (26). V této studii bylo zjištěno, že metabolity, jako jsou flavonoidy a fenylpropanoidy, byly významně akumulovány v dušené Cistanche deserticola ve srovnání s jejich odpovídajícími čerstvými, což naznačuje, že některé klíčové fyziologické a metabolické aktivity vedoucí k syntéze flavonoidů a fenylpropanoidů mohou být aktivována při vysoké teplotě a vlhkosti. Tento výsledek může být podpořen také zprávou Peng et al. (10), kteří zjistili, že obsah PhG (patřících mezi fenylpropanoidy) se po napařování zvýšil. Akumulace těchto složek ve vysušeném vzorku po napařování však vykázala významný pokles, který lze přičíst tepelné degradaci těchto tepelně citlivých složek během dlouhodobého sušení. Předchozí studie ukázaly, že flavonoidní glykosidy lze za tepelných podmínek rozložit na cukerná tělíska a flavonoidní aglykony a ztráta flavonoidů během procesu sušení byla synteticky ovlivněna teplotou a dobou sušení (26, 27). Upregulace aminokyselin a jejich derivátů (N6-acetyl-L-lysin, 1-methyl-L-histidin a fenylalanin) je připisována degradaci proteinu při vysoké teplotě během zpracování v páře. Kromě toho bylo také pozorováno, že některé další aminokyseliny a jejich deriváty N, N-dimethylglycinu, L-kynureninu, glycinu, serinu a threoninu byly DR. Pokles obsahu těchto aminokyselin může být spojen s tepelně indukovanou Maillardovou reakcí, během níž redukující cukry reagují s aminokyselinami za vzniku 5-HMF, což přispívá k vytvoření černého vzhledu v Cistanche deserticola (22). .

Výsledky barevných změn vzhledu řezu cistanche deserticola během tepelného zpracování tuto hypotézu dále potvrdily. Zčernání Cistanche deserticola při napařování proto pravděpodobně souviselo s metabolismem aminokyselin. Vennův diagram byl použit k rozlišení běžných a exkluzivních metabolitů Cistanche deserticola během různých fází tepelného zpracování. Jak je znázorněno na obrázku 4C, mezi různými srovnávacími skupinami existují společné i jedinečné metabolity. Dvacet jedna běžných metabolitů bylo pozorováno mezi skupinou čerstvě a dušenou, zatímco pouze 5 a 1 0 metabolitů bylo nalezeno společných mezi skupinou čerstvě a sušenou a skupinou dušenou a sušenou, v tomto pořadí. Celkem 23 a 17 výhradních metabolitů (p < 0,05) bylo pozorováno v Cistanche deserticola během fáze tepelného zpracování v páře a sušení. Tento výsledek dále potvrdil, že vaření v páře bylo zvláště důležité pro přeměnu metabolitů během zpracování Cistanche deserticola.

Analýza obohacení a analýza dopadu KEGG dráhy diferenciálních metabolitů

Diferenciální metabolity (p < 0,05) v čerstvých a zpracovaných vzorcích byly mapovány do online databází KEGG, HMDB a PubChem, které obsahují znalosti o molekulárních interakcích, reakcích a relačních sítích a výsledky obohacení a podrobné metabolické dráhy jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2 a obrázku 5. Jak je znázorněno na obrázcích 5a1 a a2, dopad dráhy odhalil obohacení biosyntézy fenylpropanoidů, biosyntézy flavonoidů, metabolismu alaninu, metabolismu riboflavinu, metabolismu taurinu a hypotaurinu a nikotinátu a nikotinamidu metabolismus při vaření Cistanche deserticola. Zatímco během procesu sušení po vaření v páře metabolické cesty různých metabolitů obsahovaly především metabolismus glycinu, serinu a threoninu, metabolismus thiaminu, metabolismus pyrimidinu a biosyntézu nenasycených mastných kyselin.

Kromě toho se některé metabolické dráhy mezi těmito dvěma párovými srovnáními překrývaly, jako je metabolismus nikotinátu a nikotinamidu, biosyntéza fenylpropanoidů a biosyntéza flavonoidů, ale úrovně jejich obohacení byly ve dvou párových srovnáních velmi odlišné. Tyto výsledky naznačují, že konverzní cesty metabolitů mezi procesy napařování a sušení Cistanche deserticola byly různé a rozdíly v metabolických drahách by mohly vysvětlit rozdíly v přítomnosti odlišně exkluzivních metabolitů během tepelného zpracování. Tyto biochemické změny mohou být použity k pochopení dopadu fází tepelného zpracování na složení Cistanche deserticola.

čtyři metabolické dráhy (biosyntéza fenylpropanoidů, biosyntéza flavonoidů, metabolismus alaninu a metabolismus glycinu, serinu a threoninu) byly vybrány jako klíčové metabolity pro charakterizaci přeměny hlavních aktivních složek Cistanche deserticola během tepelného zpracování (obrázky 5b1,b2). Současná studie ukázala, že fenylpropanoidy a flavonoidy byly akumulovány, ale aminokyseliny byly degradovány v dušené Cistanche deserticola ve srovnání s čerstvými a sušenými vzorky. Biosyntetická cesta fenylpropanoidů je před biosyntetickou cestou flavonoidů. Podobné závěry publikovali Liu et al. (18), kteří uvedli, že hladina akumulace fenylpropanoidů v procesu žloutnutí rýže se ve srovnání s normální rýží výrazně zvýšila. Fenylpropanoidy jsou odvozeny od kyseliny skořicové a jejich prekurzorem je fenylalanin, který lze při zahřátí syntetizovat aktivací aktivity fenylalanin amonné lyázy (PAL) (28).

Předchozí studie uváděly, že fenylpropanoidová cesta vede k biosyntéze kumarinů, flavonů, isoflavonů a flavonolů, které jsou důležitými zbraněmi pro obranu rostlin (29), a aby se zabránilo buněčné smrti způsobené silným tepelným stresem v procesu napařování, fenylpropanoid dráha může být zesílena v důsledku biologického stresu způsobeného vysokou teplotou (30, 31). Flavonoidy jsou hlavní sekundární metabolity odvozené od fenylpropanoidů (32) a jejich akumulace by mohla chránit rostliny před oxidativním poškozením volnými radikály (33). Ve srovnání s čerstvou a sušenou Cistanche deserticola může být vyšší biosyntéza flavonoidů v dušené Cistanche deserticola spojena se zvýšeným tepelným stresem během procesu vaření v páře, který chrání reaktivní formy kyslíku (ROS) (34, 35). Jak je znázorněno na obrázcích 5b3 a b4, metabolismus aminokyselin hrál důležitou roli při tepelném zpracování Cistanche deserticola. Změny obsahu alaninu, glycinu, serinu a threoninu po napařování nalezené v léčivých bylinách byly použity k označení výskytu Maillardovy reakce (36).

Nicméně vzhledem ke komplikovanému procesu napařování Cistanche deserticola by mělo být dále zkoumáno komplexní hodnocení napařování Cistanche deserticola, jako je zčernání vzhledu, aktivní látky a metabolické biomarkery.

ZÁVĚRY

V této studii byl použit široce cílený metabolomický přístup založený na UHPLC-MS/MS ke studiu mechanismu tvorby aktivních sloučenin v různých fázích tepelného zpracování Cistanche deserticola. Současné výsledky ukázaly, že biosyntéza některých klíčových metabolitů, jako jsou fenylpropanoidy a flavonoidy, byla během procesu napařování významně zvýšena. Úroveň exprese aminokyselin v dušené Cistanche deserticola byla zvýšena, což ukazuje na transformaci mezi primárními a sekundárními metabolity. Navíc ke zčernání vzhledu Cistanche deserticola docházelo hlavně ve fázi vaření v páře, nikoli ve fázi sušení, tato vlastnost je spojena s metabolickou cestou aminokyselin. Hladiny výše uvedených metabolitů se však během procesu sušení významně snížily, což naznačuje, že k tvorbě aktivních sloučenin docházelo hlavně ve fázi napařování během tepelného zpracování Cistanche deserticola. Pokud je nám známo, je to poprvé, kdy byla široce cílená metabolomická metoda použita k odhalení mechanismu změn aktivních látek během tepelného zpracování a jejich zásadního příspěvku ke zčernání Cistanche deserticola. Pro lepší pochopení vztahu mezi biosyntézou aktivních sloučenin a zčernáním vzhledu během tepelného zpracování je však zapotřebí dalšího zkoumání.

Analýza obohacení a analýza dopadu KEGG dráhy diferenciálních metabolitů

Diferenciální metabolity (p < 0,05) v čerstvých a zpracovaných vzorcích byly mapovány do online databází KEGG, HMDB a PubChem, které obsahují znalosti o molekulárních interakcích, reakcích a relačních sítích a výsledky obohacení a podrobné metabolické dráhy jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2 a obrázku 5. Jak je znázorněno na obrázcích 5a1 a a2, dopad dráhy odhalil obohacení biosyntézy fenylpropanoidů, biosyntézy flavonoidů, metabolismu alaninu, metabolismu riboflavinu, metabolismu taurinu a hypotaurinu a nikotinátu a nikotinamidu metabolismus při vaření Cistanche deserticola. Zatímco během procesu sušení po vaření v páře metabolické cesty různých metabolitů obsahovaly především metabolismus glycinu, serinu a threoninu, metabolismus thiaminu, metabolismus pyrimidinu a biosyntézu nenasycených mastných kyselin. Kromě toho se některé metabolické dráhy mezi těmito dvěma párovými srovnáními překrývaly, jako je metabolismus nikotinátu a nikotinamidu, biosyntéza fenylpropanoidů a biosyntéza flavonoidů, ale úrovně jejich obohacení byly ve dvou párových srovnáních velmi odlišné. Tyto výsledky naznačují, že konverzní cesty metabolitů mezi procesy napařování a sušení Cistanche deserticola byly různé a rozdíly v metabolických drahách by mohly vysvětlit rozdíly v přítomnosti odlišně exkluzivních metabolitů během tepelného zpracování. Tyto biochemické změny mohou být použity k pochopení dopadu fází tepelného zpracování na složení Cistanche deserticola.

Na základě anotace a analýzy obohacení KEGG byly vybrány čtyři metabolické dráhy (biosyntéza fenylpropanoidů, biosyntéza flavonoidů, metabolismus alaninu a metabolismus glycinu, serinu a threoninu) jako klíčové metabolity pro charakterizaci přeměny hlavních aktivních složek Cistanche deserticola během tepelného zpracování (obrázky 5b1,b2). Současná studie ukázala, že fenylpropanoidy a flavonoidy byly akumulovány, ale aminokyseliny byly degradovány v dušené Cistanche deserticola ve srovnání s čerstvými a sušenými vzorky. Biosyntetická cesta fenylpropanoidů je před biosyntetickou cestou flavonoidů. Podobné závěry publikovali Liu et al. (18), kteří uvedli, že hladina akumulace fenylpropanoidů v procesu žloutnutí rýže se ve srovnání s normální rýží výrazně zvýšila. Fenylpropanoidy jsou odvozeny od kyseliny skořicové a jejich prekurzorem je fenylalanin, který lze při zahřátí syntetizovat aktivací aktivity fenylalanin amonné lyázy (PAL) (28).

Předchozí studie uváděly, že fenylpropanoidová cesta vede k biosyntéze kumarinů, flavonů, isoflavonů a flavonolů, které jsou důležitými zbraněmi pro obranu rostlin (29), a aby se zabránilo buněčné smrti způsobené silným tepelným stresem v procesu napařování, fenylpropanoid dráha může být zesílena v důsledku biologického stresu způsobeného vysokou teplotou (30, 31). Flavonoidy jsou hlavní sekundární metabolity odvozené od fenylpropanoidů (32) a jejich akumulace by mohla chránit rostliny před oxidativním poškozením volnými radikály (33).

Ve srovnání s čerstvou a sušenou Cistanche deserticola může být vyšší biosyntéza flavonoidů v dušené Cistanche deserticola spojena se zvýšeným tepelným stresem během procesu vaření v páře, který chrání reaktivní formy kyslíku (ROS) (34, 35). Jak je znázorněno na obrázcích 5b3 a b4, metabolismus aminokyselin hrál důležitou roli při tepelném zpracování Cistanche deserticola. Změny obsahu alaninu, glycinu, serinu a threoninu po napařování nalezené v léčivých bylinách byly použity k označení výskytu Maillardovy reakce (36). Nicméně vzhledem ke komplikovanému procesu napařování Cistanche deserticola by mělo být dále zkoumáno komplexní hodnocení napařování Cistanche deserticola, jako je zčernání vzhledu, aktivní látky a metabolické biomarkery.

ZÁVĚRY

V této studii byl použit široce cílený metabolomický přístup založený na UHPLC-MS/MS ke studiu mechanismu tvorby aktivních sloučenin v různých fázích tepelného zpracování Cistanche deserticola. Současné výsledky ukázaly, že biosyntéza některých klíčových metabolitů, jako jsou fenylpropanoidy a flavonoidy, byla během procesu napařování významně zvýšena. Úroveň exprese aminokyselin v dušené Cistanche deserticola byla zvýšena, což ukazuje na transformaci mezi primárními a sekundárními metabolity. Navíc ke zčernání vzhledu Cistanche deserticola docházelo hlavně ve fázi vaření v páře, nikoli ve fázi sušení, tato vlastnost je spojena s metabolickou cestou aminokyselin. Hladiny výše uvedených metabolitů se však během procesu sušení významně snížily, což naznačuje, že k tvorbě aktivních sloučenin docházelo hlavně ve fázi napařování během tepelného zpracování Cistanche deserticola. Pokud je nám známo, je to poprvé, kdy byla široce cílená metabolomická metoda použita k odhalení mechanismu změn aktivních látek během tepelného zpracování a jejich zásadního příspěvku ke zčernání Cistanche deserticola. Pro lepší pochopení vztahu mezi biosyntézou aktivních sloučenin a zčernáním vzhledu během tepelného zpracování je však zapotřebí dalšího zkoumání.

PROHLÁŠENÍ O DOSTUPNOSTI DAT

Původní příspěvky prezentované ve studii jsou součástí článku/doplňkového materiálu, další dotazy lze směřovat na příslušného autora/y.

AUTORSKÉ PŘÍSPĚVKY

ZA provedl experimentální design, provedl experimenty, vygeneroval data a napsal tento rukopis. YZ provedl metabolomickou analýzu. XL poskytl statistickou analýzu. WS provedla zpracování dat a šetření. Akvizice financování, celkový rámec a psaní-recenze byly dokončeny YL. Všichni autoři přispěli k článku a schválili předloženou verzi.

FINANCOVÁNÍ

Tato práce byla finančně podpořena oddělením vědy a technologie provincie Guangdong (č. 2018B020241003).

DOPLŇKOVÝ MATERIÁL

Doplňkový materiál k tomuto článku lze nalézt online na: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnut.2021. 742511/plný#doplňkový-materiál

REFERENCE

1. Wang X, Wang J, Guan H, Xu R, Luo X, Su M a kol. Porovnání chemických profilů a antioxidačních aktivit různých částí kultivované Cistanche deserticola pomocí ultravýkonné kapalinové chromatografie-kvadrupólové hmotnostní spektrometrie s časem letu a 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylového testu. Molekuly. (2017) 22:2011. doi: 10,3390/molekuly22112011

2. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: přehled její chemie, farmakologie a farmakokinetických vlastností. J Ethnopharmacol. (2018) 219:233–47. doi: 10.1016/j.jep.2017.10.015

3. Piwowarczyk R, Carlón L, Kasinska J, Tofil S, Furma ´ nczyk P. ´ Mikromorfologická vnitrodruhová diferenciace nektarových průvodců a přistávací plošiny pro opylovače v iberské parazitické rostlině Cistanche phelypæa (Orobanchaceae). Bot Lett. (2016) 163:47–55. doi: 10.1080/12538078.2015.1124287

4. Jiang Y, Tu P. Analýza chemických složek u druhů Cistanche. J Chromatogr a. (2009) 1216:1970–9. doi: 10.1016/j.chroma.2008. 07.031

5. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng C. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): Jeden z nejlepších farmaceutických darů tradiční čínské medicíny. Front Pharmacol. (2016) 7:41. doi: 10.3389/fphar.2016.00041

6. Song Y, Zeng K, Jiang Y, Tu P. Cistanches Herba, od ohroženého druhu po velkou značku čínské medicíny. Med Res Rev. (2021) 5:1–39. doi: 10.1002/med.21768

7. Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. Antioxidační účinky fenylethanoidů z Cistanche deserticola. Biol Pharmac Bull. (1996) 19:1580-5. doi: 10.1248/bob.19.1580

8. Wang L, Ding H, Yu H, Han L, Lai Q, Zhang L a kol. Cistanches herba: chemické složky a farmakologické účinky. Chin Herbal Med. (2015) 7:135–42. doi: 10.1016/S1674-6384(15)60017-X

9. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Vliv procesu vaření v páře na kvalitu posklizňové Cistanche deserticola pro léčebné použití při sušení na slunci. Biol Pharm Bull. (2016) 39:2066–70. doi: 10.1248/bob.b16- 00250

10. Peng F, Chen J, Wang X, Xu C, Liu T, Xu R. Změny hladin fenylethanoidních glykosidů, antioxidační aktivity a dalších kvalitativních znaků v plátcích Cistanche deserticola zpracováním párou. Chem Pharm Bull. (2016) 64:1024–30. doi: 10.1248/CPB.c16-00033

11. Zou P, Song Y, Lei W, Li J, Tu P, Jiang Y. Aplikace metabolomiky založené na 1H NMR pro rozlišení různých částí a vývoj nového pracovního postupu zpracování pro Cistanche deserticola. Acta Pharm Sin B. (2017) 7:647–56. doi: 10.1016/j.apsb.2017.07.003

12. Zheng J, Wu Z, Yang N, Zhou K, Hu W, Ou S a kol. Široce cílená UHPLC-MS/MS metabolomická analýza chemických změn v pečivu plněném borůvkami během zpracování. Hranice ve výživě. (2020) 7:569172. doi: 10.3389/fnut.2020.569172

13. Liu W, Song Q, Cao Y, Xie N, Li Z, Jiang Y a kol. Od necílené strategie založené na 1H NMR k cílené metabolomické strategii založené na LC–MS pro hloubkové srovnání heřmánku mezi čtyřmi druhy Cistanche. J Pharmaceut Biomed. (2019) 162:16–27. doi: 10.1016/j.jpba.2018.09.013

14. Wang H, Hua J, Yu Q, Li J, Wang J, Deng Y a kol. Široce cílená metabolomická analýza odhaluje dynamické změny v netěkavých a těkavých metabolitech během zpracování zeleného čaje. Food Chem. (2021) 363:130131. doi: 10.1016/j.foodchem.2021.130131

15. Koistinen VM, Da Silva AB, Abrankó L, Low D, Villalba RG, Barberán FT a kol. Mezilaboratorní test pokrytí bioaktivních sloučenin rostlinné potravy a jejich metabolitů pomocí necílené metabolomiky založené na hmotnostní spektrometrii. Metabolity. (2018) 8:46. doi: 10.3390/metabo8030046

16. Santin M, Lucini L, Castagna A, Chiodelli G, Hauser M, Ranieri A. Posklizňové UV-B záření moduluje profil metabolitů v ovoci broskvoně. Posklizňové Biol Tec. (2018) 139:127– 34. doi: 10.1016/j.postharvbio.2018.02.001

17. Nie H, Chen H, Li G, Su K, Song M, Duan Z a kol. Srovnání flavonoidů a fenylpropanoidních sloučenin v čínském vodním kaštanu zpracovaném různými metodami. Food Chem. (2021) 335:127662. doi: 10.1016/j.foodchem.2020.127662

18. Liu Y, Liu J, Wang R, Sun H, Li M, Strappe P a kol. Analýza sekundárních metabolitů indukovaných procesem žloutnutí pro pochopení mechanismu žloutnutí rýže. Food Chem. (2021) 342:128204. doi: 10.1016/j.foodchem.2020.128204

19. Wu L, Huang X, Liu S, Liu J, Guo Y, Sun Y a kol. Pochopení mechanismu tvorby charakteristické netěkavé chemikálie pro čaj oolong spočívá během výrobních procesů pomocí integrované široce cílené analýzy metabolomu a DIA proteomu. Food Chem. (2020) 310:125941. doi: 10.1016/j.foodchem.2019.125941

20. Xie Y, Li X, Zhang Y, Zheng Z, Huang L, Liu D a kol. Účinky napařování s vysokou vlhkostí horkého vzduchu na Gastrodia elata: stupeň napařování, ztráta hmotnosti, textura, kinetika sušení, mikrostruktura a aktivní složky. Food Bioprod Process. (2021) 127:255–65. doi: 10.1016/j.fbp.2021.03.005

21. Chen W, Gong L, Guo Z, Wang W, Zhang H, Liu X a kol. Nová integrovaná metoda pro detekci, identifikaci a kvantifikaci široce cílených metabolitů ve velkém měřítku: aplikace při studiu metabolomiky rýže. Mol Plant. (2013) 6:1769–80. doi: 10.1093/mp/sst080

22. Arena S, Renzone GD, Ambrosio C, Salzano AM, Scaloni A. Mléčné výrobky a Maillardova reakce: slibná budoucnost pro rozsáhlou charakterizaci potravin pomocí integrovaných proteomických studií. Food Chem. (2017) 219:477–89. doi: 10.1016/j.foodchem.2016.09.165

23. Rizzi GP. Chemická struktura barevných produktů Maillardovy reakce. Food Rev Int. (1997) 13:1–28. doi: 10.1080/87559129709541096

24. Liu Z, Chao Z, Liu Y, Song Z, Lu A. Maillardova reakce zapojená do procesu napařování kořene Polygonum multiflorum. Planta Med. (2009) 75:84–8. doi: 10,1055/s-0028-1088349

25. Jin J, Lao J, Zhou R, He W, Qin Y, Zhong C, a kol. Simultánní identifikace a dynamická analýza sacharidů při parním zpracování oddenků Polygonatum cystoma pomocí HPLC–QTOF–MS/MS. Molekuly. (2018) 23:2855. doi: 10,3390/molekuly23112855

26. Wan XC. Biochemie čaje (třetí vydání). Peking: Čínské zemědělské nakladatelství (2003). p. 41–5.

27. Xu Y, Xiao Y, Lagnika C, Li D, Liu C, Jiang N a kol. Srovnávací hodnocení nutričních vlastností, antioxidační kapacity a fyzikálních vlastností zelí (Brassica oleracea var. Capitate var L) podrobených různým metodám sušení. Food Chem. (2020) 309:124935. doi: 10.1016/j.foodchem.2019.06.002

28. Dixon RA, Paiva N L. Stresem indukovaný metabolismus fenylpropanoidů. Rostlinná buňka. (1995) 7:1085-97. doi: 10.1105/tpc.7.7.1085

29. Gupta R, Min CW, Kim SW, Wang Y, Agrawal GK, Rakwal R a kol. Srovnávací výzkum obalů semen hnědě vs. žlutě zbarvených semen sóji pomocí integrovaného přístupu proteomiky a metabolomiky. Proteomika. (2015) 15:1706–16. doi: 10.1002/pmic.201400453

30. Commisso M, Toffali K, Strasser P, Stocchero M, Ceoldo S, Baldan B a kol. Vliv fenylpropanoidních sloučenin na toleranci tepelného stresu v buněčných kulturách mrkve. Front Plant Sci. (2016) 7:1439. doi: 10.3389/fpls.2016.01439

31. Wahid A, Gelani S, Ashraf M, Foolad M. Tepelná tolerance v rostlinách: přehled. Environ Exp Bot. (2007) 61:199-223. doi: 10.1016/j.envexpbot.2007.05.011

32. Wu X, Yuan J, Luo A, Chen Y, Fan Y. Stres ze sucha a opětovné zavlažování zvyšují sekundární metabolity a aktivitu enzymů v dendrobium moniliform. Ind Crop Prod. (2016) 94:385–93. doi: 10.1016/j.indcrop.2016.08.041

33. Wang Y, Ren W, Li Y, Xu Y, Teng Y, Christie P a kol. Necílená metabolomická analýza k odhalení dopadu stresu di(2-ethylhexyl)ftalátem na kořenové exsudáty vojtěšky (Medicago sativa). Sci Total Environ. (2019) 646:212– 9. doi: 10.1016/j.scitotenv.2018.07.247

34. Jia X, Sun C, Li G, Li G, Chen G. Účinky progresivního stresu ze sucha na fyziologii, antioxidační enzymy a sekundární metabolity Radix Astragali. rostlina Acta Physiol. (2015), 37:262. doi: 10.1007/s11738-015- 2015-4

35. Paupière MJ, Müller F, Li H, Rieu I, Tikunov YM, Visser R GF, et al. Necílená metabolomická analýza vývoje pylu rajčat a reakce na tepelný stres. Plant Reprod. (2017) 30:81–94. doi: 10.1007/s00497-017-0301-6

36. Chen J, Ho C. Srovnání tvorby těkavých látek v modelových systémech serin/threonin/glutamin–ribóza/glukóza/fruktóza. J Agr Food Chem. (1999) 47:643-7. doi: 10.1021/jf980771a

Konflikt zájmů:

Autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být vykládány jako potenciální střet zájmů.

Poznámka vydavatele:

Všechna tvrzení vyjádřená v tomto článku jsou výhradně tvrzeními autorů a nemusí nutně představovat tvrzení jejich přidružených organizací nebo tvrzení vydavatele, redaktorů a recenzentů. Žádný produkt, který může být hodnocen v tomto článku, nebo tvrzení, které může vznést jeho výrobce, není zaručeno ani podporováno vydavatelem.

Copyright © 2021 Ai, Zhang, Li, Sun a Liu. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution License (CC BY). Použití, distribuce nebo reprodukce na jiných fórech je povolena za předpokladu, že je uveden původní autor (autoři) a vlastník (vlastníci) autorských práv a že původní publikace v tomto časopise je citována v souladu s uznávanou akademickou praxí. Není povoleno žádné použití, distribuce nebo reprodukce, které nejsou v souladu s těmito podmínkami.

For more information:1950477648nn@gamil.com